ที่อยู่ปัจจุบัน: OX11 0DE, สหราชอาณาจักร, อาคารไดมอนด์, สวนวิทยาศาสตร์และนวัตกรรมฮาร์เวลล์, ไดเอทโคต, ออกซ์ฟอร์ดเชียร์, สหราชอาณาจักร, บริษัท ไดมอนด์ ไลท์ ซอร์ส จำกัด, ศูนย์ภาพทางชีววิทยาอิเล็กทรอนิกส์
ศูนย์ปฏิกิริยาเชิงแสงคอมเพล็กซ์ 1 (RC-LH1) เป็นส่วนประกอบหลักในการสังเคราะห์แสงของแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วง เราได้นำเสนอโครงสร้างสองแบบของคอมเพล็กซ์ RC-LH1 จาก Rhodopseudomonas palustris ที่ได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบแช่แข็ง โครงสร้างความละเอียด 2.65 Å ของคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W ประกอบด้วยลูป LH1 14 หน่วยย่อยที่ล้อมรอบ RC ซึ่งถูกขัดจังหวะด้วยโปรตีน W ในขณะที่คอมเพล็กซ์ที่ไม่มีโปรตีน W ประกอบด้วย RC อย่างสมบูรณ์ล้อมรอบด้วยลูป LH1 16 หน่วยย่อยที่ปิดสนิท การเปรียบเทียบโครงสร้างเหล่านี้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับพลวัตของควิโนนในคอมเพล็กซ์ RC-LH1 รวมถึงการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่ไม่เคยมีการระบุมาก่อนเมื่อควิโนนจับกับไซต์ QB ของ RC ตลอดจนตำแหน่งของไซต์จับควิโนนเสริม ซึ่งช่วยส่งผ่านไปยัง RC โครงสร้างที่เป็นเอกลักษณ์ของโปรตีน W ป้องกันการปิดของลูป LH1 ซึ่งส่งผลให้เกิดช่องทางสำหรับการเร่งการแลกเปลี่ยนควิโนน/ควิโนโลน
พลังงานที่ได้จากการสังเคราะห์แสงสามารถหล่อเลี้ยงสิ่งมีชีวิตเกือบทั้งหมดบนโลก และมีศักยภาพอย่างมากสำหรับเทคโนโลยีชีวภาพพลังงานแสงอาทิตย์ นอกจากการส่งเสริมการสังเคราะห์แสงทั่วโลกแล้ว แบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงยังแสดงโหมดพลังงานและความสามารถในการเผาผลาญที่หลากหลาย พวกมันสามารถหลีกเลี่ยงการสังเคราะห์แสงและเติบโตเป็นแบคทีเรียเฮเทอโรโทรฟิกในที่มืด สามารถตรึงไนโตรเจนและคาร์บอนไดออกไซด์ ผลิตไฮโดรเจน และย่อยสลายสารประกอบอะโรมาติกได้ (1-3) เพื่อให้ได้พลังงานสำหรับกระบวนการเหล่านี้ แสงจะต้องถูกแปลงเป็นพลังงานเคมีอย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ กระบวนการนี้เริ่มต้นเมื่อคอมเพล็กซ์เสาอากาศดักจับแสงดูดซับแสงและถ่ายโอนพลังงานที่ดักจับไว้ไปยังศูนย์ปฏิกิริยา (RC) ซึ่งเป็นการเริ่มต้นการแยกประจุ (4 – 7) หน่วยพื้นฐานของการสังเคราะห์แสงในแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วงประกอบด้วย RC ชนิดที่ 2 ล้อมรอบด้วยคอมเพล็กซ์เก็บเกี่ยวแสง 1 (LH1) ก่อตัวเป็นคอมเพล็กซ์หลัก RC-LH1 LH1 เกิดจากการเรียงตัวของเฮเทอโรไดเมอร์ αβ ที่โค้งงอ ซึ่งแต่ละตัวจะจับกับโมเลกุลคลอโรฟิลล์แบคทีเรีย (BChl) a สองโมเลกุลและแคโรทีนอยด์หนึ่งหรือสองโมเลกุล (8-12) เสาอากาศ LH1 ที่ง่ายที่สุดประกอบด้วยเฮเทอโรไดเมอร์ αβ 16 หรือ 17 ตัวที่ล้อมรอบ RC (9-13) ในวงปิด แต่ในคอมเพล็กซ์แกนกลางอื่นๆ เปปไทด์ทรานส์เมมเบรนจะขัดขวางความต่อเนื่องของ LH1 ที่อยู่รอบๆ จึงส่งเสริมการแพร่กระจายของควิโนล/ควิโนนระหว่าง RC และคอมเพล็กซ์ไซโตโครม bc1 (11, 13-15) พืชสังเคราะห์แสงสีม่วง Rhodopseudomonas (Rps.) เป็นสิ่งมีชีวิตต้นแบบที่สามารถเข้าใจการถ่ายโอนพลังงานและอิเล็กตรอนที่สนับสนุนการสังเคราะห์แสง โครงสร้างผลึกแรกของ Rps. แบบจำลองของคอมเพล็กซ์ RC-LH1 palustris คือ RC ที่ล้อมรอบด้วยวงเฮเทอโรไดเมอร์ LH1 15 วง ซึ่งถูกขัดจังหวะด้วยโปรตีนที่ไม่รู้จักที่เรียกว่า "โปรตีน W" (14) ต่อมาโปรตีน W ถูกระบุว่าเป็น RPA4402 ซึ่งเป็นโปรตีนขนาด 10.5 kDa ที่ยังไม่ได้รับการระบุลักษณะ โดยมีเกลียวทรานส์เมมเบรน (TMH) ที่คาดการณ์ไว้ 3 อัน (16) เราเสนอให้เปลี่ยนชื่อยีน rpa4402 ที่เข้ารหัสโปรตีน W เป็น pufW เพื่อให้สอดคล้องกับระบบการตั้งชื่อที่ใช้สำหรับยีนที่เข้ารหัส RC-L, M (pufL, pufM) และหน่วยย่อย LH1α, β (pufA, pufB) ที่น่าสนใจคือ โปรตีน W พบได้เพียงประมาณ 10% ของ RC-LH1 ซึ่งแสดงให้เห็นว่า Rps. palustris ผลิตคอมเพล็กซ์ RC-LH1 ที่แตกต่างกัน 2 แบบ ในที่นี้ เราได้รายงานโครงสร้าง cryo-EM ความละเอียดสูงของคอมเพล็กซ์หลัก 2 แบบ แบบหนึ่งมีโปรตีน W และเฮเทอโรไดเมอร์ αβ 14 ตัว อีกแบบหนึ่งไม่มีโปรตีน W และมีลูป LH1 เฮเทอโรไดเมอร์ 16 ตัวที่ปิดสนิท โครงสร้างที่เราค้นพบแสดงถึงการเปลี่ยนแปลงครั้งสำคัญในการทำความเข้าใจคอมเพล็กซ์ RC-LH1 ของ Rps. palustris เนื่องจากเราได้วิเคราะห์ประชากรที่เป็นเนื้อเดียวกันของแต่ละสายพันธุ์ และมีความละเอียดเพียงพอที่จะระบุเปปไทด์ เม็ดสีที่จับอยู่ และลิปิดและควิโนนที่เกี่ยวข้องได้อย่างชัดเจน การเปรียบเทียบโครงสร้างเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าโปรตีน TMH-W ทั้งสามตัวที่ไม่เคยพบในคอมเพล็กซ์ RC-LH1 อื่นๆ มาก่อนนั้น สร้างช่องทางควิโนนเพื่อเร่งการแลกเปลี่ยนควิโนน/ควิโนโลน เราได้ระบุตำแหน่งการจับลิปิดและควิโนนที่อนุรักษ์ไว้จำนวนหนึ่ง และเราได้เปิดเผยการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างแบบใหม่หลังจากการรวมกันของควิโนนและ RC ซึ่งอาจเหมาะสมสำหรับ RC ของระบบสังเคราะห์แสง II (PSII) ของสิ่งมีชีวิตสังเคราะห์แสงที่ใช้ออกซิเจน ผลการค้นพบของเราให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับจลนศาสตร์ของการจับและการแลกเปลี่ยนควิโนน/ควิโนโลนในคอมเพล็กซ์หลัก RC-LH1 ของแบคทีเรียสังเคราะห์แสงสีม่วง
เพื่ออำนวยความสะดวกในการศึกษารายละเอียดของคอมเพล็กซ์ทั้งสองที่พบใน Rps. palustris เราจึงแยก RC-LH1 แต่ละชนิดโดยใช้วิธีทางชีวเคมี คอมเพล็กซ์ที่ขาดโปรตีน W (ต่อไปนี้เรียกว่า ΔpufW) ได้รับการทำให้บริสุทธิ์จากสายพันธุ์ที่ขาดจีน pufW (16) และสามารถผลิตคอมเพล็กซ์ RC-LH1 ได้เพียงชนิดเดียวเท่านั้น คอมเพล็กซ์ที่มีโปรตีน W นั้นผลิตโดยสายพันธุ์หนึ่ง โปรตีน W ของสายพันธุ์นี้ได้รับการดัดแปลงด้วยแท็ก His 10x ที่ปลาย C-terminus เพื่อให้คอมเพล็กซ์ที่มีโปรตีน W สามารถรวมเข้ากับโปรตีน W ที่ขาดส่วนใหญ่ได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยการตรึงโลหะ คอมเพล็กซ์จะถูกแยกได้อย่างมีประสิทธิภาพ (16) ด้วยโครมาโทกราฟีแบบแอฟฟินิตี (IMAC)
ดังแสดงในรูปที่ 1 คอมเพล็กซ์ทั้งสองประกอบด้วย RC สามหน่วยย่อย (RC-L, RC-M และ RC-H) ล้อมรอบด้วยเสาอากาศ LH1 โครงสร้างที่ความละเอียด 2.80 อังสตรอมของคอมเพล็กซ์ที่ไม่มีโปรตีน W แสดงให้เห็นเฮเทอโรไดเมอร์ αβ จำนวน 16 ตัว ก่อตัวเป็นวงปิด LH1 ที่ล้อมรอบ RC อย่างสมบูรณ์ ซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่าคอมเพล็กซ์ RC-LH116 โครงสร้างที่ความละเอียด 2.65 อังสตรอมของคอมเพล็กซ์ที่มีโปรตีน W มี LH1 เฮเทอโรไดเมอร์ 14 ตัวที่ถูกขัดจังหวะด้วยโปรตีน W ซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่า RC-LH114-W
(A และ B) การแสดงภาพพื้นผิวของสารประกอบ (C และ D) เม็ดสีที่ยึดติดแสดงเป็นแท่ง (E และ F) คอมเพล็กซ์ที่สังเกตจากพื้นผิวไซโตพลาสมิกมีเปปไทด์และซับยูนิต LH1 แสดงเป็นภาพการ์ตูน และมีการกำหนดหมายเลขตามเข็มนาฬิกาจากช่องว่างโปรตีน-W [สอดคล้องกับการกำหนดหมายเลขของคอมเพล็กซ์ Rba sphaeroides (13)] สำหรับ LH1-α สีของซับยูนิตโปรตีนเป็นสีเหลือง สำหรับ LH1-β สีของซับยูนิตโปรตีนเป็นสีน้ำเงิน สำหรับโปรตีน-W โปรตีนเป็นสีแดง สำหรับ RC-H เป็นสีฟ้า สำหรับ RC-L เป็นสีส้ม สำหรับ RC-M เป็นสีม่วงแดง โคแฟคเตอร์แสดงด้วยแท่ง สีเขียวแทนโมเลกุล BChl และ BPh a สีม่วงแทนแคโรทีนอยด์ และสีเหลืองแทนโมเลกุล UQ10 (G และ H) ภาพขยายของช่องว่างโปรตีน-W ในบริเวณที่เทียบเท่ากันของคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W (G) และคอมเพล็กซ์ RC-LH116 (H) โคแฟคเตอร์แสดงในรูปแบบการเติมพื้นที่ ควิโนนที่ถูกคีเลตแสดงด้วยสีน้ำเงิน ช่องว่างโปรตีน-W ถูกเน้นด้วยเส้นประสีน้ำเงินใน (G) และรูเล็กๆ ที่ควิโนน/ควิโนลอลแพร่กระจายบนวงแหวน LH116 ถูกเน้นด้วยเส้นประสีดำใน (H)
รูปที่ 1 (A และ B) แสดงให้เห็น RC ที่ล้อมรอบด้วยอาร์เรย์แบบเปิดหรือปิดของเฮเทอโรไดเมอร์ LH1αβ ซึ่งแต่ละตัวจะจับกับ BChl สองตัวและแคโรทีนอยด์หนึ่งตัว (รูปที่ 1, C และ D) การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่า Rps คือคอมเพล็กซ์ LH1 ในเส้นทางการสังเคราะห์ทางชีวภาพของแซนทินจากสไปรูลินา สายพันธุ์เหล่านี้มีประชากรแคโรทีนอยด์ผสมกัน (17) อย่างไรก็ตาม สไปโรไพรอกแซนทินเป็นแคโรทีนอยด์ที่เด่นและมีความหนาแน่นที่น่าพอใจ ดังนั้นเราจึงเลือกที่จะสร้างแบบจำลองสไปรอกแซนทินที่ตำแหน่งการจับ LH1 ทั้งหมด โพลีเปปไทด์อัลฟาและเบตาเป็น TMH เดี่ยวที่มีบริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ด้านนอกสั้น (รูปที่ 1, A, B, E และ F) แม้ว่าจะไม่พบความหนาแน่นของเรซิเดิว 17 ตัวที่ปลาย C-terminus แต่โพลีเปปไทด์อัลฟาถูกตัดจาก Met1 ถึง Ala46 ในคอมเพล็กซ์ทั้งสอง โพลีเปปไทด์ β ถูกลดจาก Gly4 เป็น Tyr52 ใน RC-LH116 และจาก Ser5 เป็น Tyr52 ใน RC-LH114-W ไม่พบความหนาแน่นของกรดอะมิโน 3 หรือ 4 ตัวที่ปลาย N หรือ 13 ตัวที่ปลาย C (รูปที่ S1) การวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรีของสารเชิงซ้อน RC-LH1 แบบผสมที่เตรียมจากสายพันธุ์ป่าแสดงให้เห็นว่าบริเวณที่หายไปเป็นผลมาจากการตัดแยกแบบต่างชนิดของเปปไทด์เหล่านี้ (รูปที่ S1 และ S2) นอกจากนี้ยังพบการฟอร์มิเลชันที่ปลาย N ของ α-Met1 (f) การวิเคราะห์แสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ α ประกอบด้วยกรดอะมิโน fMet1 ถึง Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 และเปปไทด์ β ประกอบด้วยกรดอะมิโน Ser2 ถึง Ala53 ซึ่งสอดคล้องกับแผนที่ความหนาแน่นของ EM ที่อุณหภูมิต่ำเป็นอย่างดี
การประสานงานของ α-His29 และ β-His36 ทำให้ BChls หันหน้าเข้าหากัน โดยแต่ละ αβ heterodimer จะประกอบรวมกับเพื่อนบ้านเพื่อสร้างวงเปิด (RC-LH114-W) หรือวงปิด (RC-LH116) รอบอาร์เรย์รงควัตถุที่จับคู่เอ็กซิตอน RC (รูปที่ 1, C และ D) เมื่อเปรียบเทียบกับแถบ 877 nm ของ RC-LH114-W การดูดกลืนแสงที่ 880 nm ของ RC-LH116 มีการเลื่อนไปทางสีแดง 3 nm (รูปที่ 2A) อย่างไรก็ตาม สเปกตรัมไดโครอิซึมแบบวงกลมเกือบจะเหมือนกัน (รูปที่ 2B) ซึ่งบ่งชี้ว่าแม้จะมีความแตกต่างอย่างชัดเจนระหว่างวงเปิดและวงปิด แต่สภาพแวดล้อมเฉพาะที่ของ BChls นั้นคล้ายคลึงกันมาก การดูดกลืนแสงแบบเรดชิฟต์อาจเป็นผลมาจากการลดการเคลื่อนที่ทางความร้อนและความเสถียรที่เพิ่มขึ้นในวงปิด (18, 19) การเปลี่ยนแปลงในการจับคู่เม็ดสีที่เกิดจากวงปิด (20, 21) หรือการรวมกันของผลกระทบทั้งสองนี้ (11)
(A) สเปกตรัมการดูดกลืนแสงอัลตราไวโอเลต/แสงที่มองเห็นได้/อินฟราเรดใกล้ โดยระบุจุดสูงสุดด้วยเม็ดสีที่เกี่ยวข้อง และปรับค่าให้เป็นมาตรฐานเทียบกับจุดสูงสุดของ BPh ที่ 775 นาโนเมตร (B) สเปกตรัมไดโครอิซึมแบบวงกลม ปรับค่าให้เป็นมาตรฐานเทียบกับการดูดกลืนแสงของ BChl ที่ 805 นาโนเมตร (C และ D) สเปกตรัม ΔA ที่เลือกจากสเปกตรัมการดูดกลืนแสงแบบเวลาจำลองของคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W (C) และคอมเพล็กซ์ RC-LH116 (D) เพื่อให้เปรียบเทียบได้ง่ายขึ้น สเปกตรัมทั้งหมดถูกปรับค่าให้เป็นมาตรฐานที่ ∆A เท่ากับ −A ที่ 0.2 พิโควินาที (E) อัตราการออกซิเดชันของไซโตโครม c2 หลังจากการฉายรังสีในที่ที่มีความเข้มข้นต่างๆ ของ UQ2 (ดูรูป S8 สำหรับข้อมูลดิบ) (F) ในเซลล์ที่เจริญเติบโตภายใต้แสงที่มีความเข้มต่ำ ปานกลาง หรือสูง (10, 30 หรือ 300 μMm-2 s-1 ตามลำดับ) โปรตีน W และซับยูนิต RC-L ในคอมเพล็กซ์ที่บริสุทธิ์และอัตราส่วนของเยื่อหุ้มเซลล์ที่แยกออกมา กำหนดระดับโปรตีนโดย SDS-polyacrylamide gel electrophoresis และ immunoassay (ดูรูป S9 สำหรับข้อมูลดิบ) กำหนดอัตราส่วนเทียบกับคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W ที่บริสุทธิ์ อัตราส่วนสัดส่วนของ RC-L ต่อโปรตีน W ของคอมเพล็กซ์คือ 1:1
BChl ที่ตำแหน่ง 1 ในลูป αβ14 ที่ผิดรูปของ RC-LH114-W (รูปที่ 1, A, C และ E) อยู่ใกล้กับตัวให้หลัก (P) ของ RC มากกว่า BChl ที่เทียบเท่ากันใน RC-LH116 (รูปที่ 1, B, D และ F และรูปที่ S3) ถึง 6.8 Å อย่างไรก็ตาม จลนศาสตร์การดูดกลืนแสงชั่วคราวของสารประกอบทั้งสองแสดงให้เห็นว่าสำหรับ RC-LH114-W และ RC-LH116 ค่าคงที่เวลาการถ่ายโอนพลังงานกระตุ้นจาก LH1 ไปยัง RC คือ 40 ±4 และ 44±3 ps ตามลำดับ (รูปที่ 2, C และ D, รูปที่ S4 และตารางที่ S2) นอกจากนี้ยังไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการถ่ายโอนอิเล็กตรอนภายใน RC (รูปที่ S5 และข้อความเสริมที่เกี่ยวข้อง) เราคาดว่าความสอดคล้องกันอย่างใกล้ชิดของเวลาการถ่ายโอนพลังงานระหว่าง LH1 และ RC-P นั้นเกิดจากระยะทาง มุม และพลังงานศักย์ที่คล้ายคลึงกันของ BChl ส่วนใหญ่ในลูป LH1 ทั้งสอง ดูเหมือนว่าการสำรวจรูปแบบพลังงาน LH1 เพื่อให้ได้ระยะทางที่สั้นที่สุดนั้นจะไม่เร็วกว่าการถ่ายโอนพลังงานโดยตรงจากตำแหน่งที่ไม่เหมาะสมไปยัง RC วงเปิด LH1 ใน RC-LH114-W อาจมีการเคลื่อนที่ทางความร้อนที่ไม่สำคัญภายใต้สภาวะอุณหภูมิต่ำสำหรับการวิเคราะห์โครงสร้าง และมีโครงสร้างวงแหวน αβ14 ที่ยาวกว่าที่อุณหภูมิห้องจากระยะการสร้างเม็ดสีของ βBChls ที่ตำแหน่งของ RC 1
คอมเพล็กซ์ RC-LH116 ประกอบด้วย BChl 32 ตัวและแคโรทีนอยด์ 16 ตัว และการจัดเรียงโดยรวมนั้นเหมือนกับที่ได้จาก Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), สายพันธุ์ Thiorhodovibrio (Trv.) 970 ( PDB ID 7C9R) (12) และสาหร่ายสีเขียว (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) หลังจากการจัดเรียงลำดับแล้ว พบว่ามีการเบี่ยงเบนเล็กน้อยในตำแหน่งของเฮเทอโรไดเมอร์ αβ โดยเฉพาะ 1-5, 15 และ 16 (รูปที่ S6) การมีอยู่ของโปรตีน-W มีผลกระทบอย่างมากต่อโครงสร้างของ LH1 TMH ทั้งสามของมันเชื่อมต่อกันด้วยลูปสั้นๆ โดยปลาย N อยู่ด้านลูเมนของคอมเพล็กซ์และปลาย C อยู่ด้านไซโตพลาสมิก (รูปที่ 1A และ 3, A ถึง D) โปรตีน-W มีคุณสมบัติไม่ชอบน้ำเป็นส่วนใหญ่ (รูปที่ 3B) และ TMH2 และ TMH3 ทำปฏิกิริยากับ LH1αβ-14 เพื่อสร้างพื้นผิวที่ทะลุผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (รูปที่ 3, B และ E ถึง G) ส่วนต่อประสานนี้ส่วนใหญ่ประกอบด้วยกรดอะมิโนฟีนิลอะลานีน (Phe), ลิวซีน (Leu) และวาลีน (Val) ในบริเวณที่ทะลุผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ กรดอะมิโนเหล่านี้เรียงตัวซ้อนกับกรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำและรงควัตถุ αβ-14 กรดอะมิโนที่มีขั้วบางส่วนก็มีส่วนช่วยในการทำปฏิกิริยาด้วย เช่น พันธะไฮโดรเจนระหว่าง W-Thr68 และ β-Trp42 บนพื้นผิวของโพรงเชิงซ้อน (รูปที่ 3, F และ G) บนพื้นผิวของไซโตพลาสซึม Gln34 อยู่ติดกับกลุ่มคีโตนของแคโรทีนอยด์ αβ-14 นอกจากนี้ ยังพบโมเลกุล n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) โดยส่วนหางที่ไม่ชอบน้ำยื่นออกไปที่ส่วนต่อประสานระหว่างโปรตีน-W และ αβ-14 และส่วนหางที่เป็นไขมันอาจอยู่ในส่วนลำตัว นอกจากนี้ เรายังสังเกตเห็นว่าบริเวณการแยกส่วนปลาย C ของโปรตีน W และ RCH อยู่ใกล้กันมาก แต่ไม่อยู่ในขอบเขตของการเกิดปฏิกิริยาจำเพาะ (รูปที่ 1, A และ E) อย่างไรก็ตาม อาจมีปฏิกิริยาเกิดขึ้นในกรดอะมิโนปลาย C ที่ยังไม่สามารถแยกส่วนได้ของโปรตีนทั้งสองนี้ ซึ่งอาจเป็นกลไกในการดึงดูดโปรตีน W ในระหว่างการประกอบคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W
(A) โปรตีน-W ซึ่งหันหน้าเข้าหาส่วนต่อประสานกับ LH1αβ14 ในรูปแบบการ์ตูน มีโซ่ข้างรูปแท่ง (สีแดง) แสดงอยู่ในส่วนหนึ่งของแผนภาพศักย์ไฟฟ้าสถิต (พื้นผิวสีเทาโปร่งใสที่มีระดับเส้นชั้นความสูง 0.13) (B) โปรตีน-W แสดงด้วยพื้นผิวสีที่ไม่ชอบน้ำ บริเวณที่มีขั้วและมีประจุแสดงด้วยสีฟ้า บริเวณที่ไม่ชอบน้ำแสดงด้วยสีขาว และบริเวณที่ไม่ชอบน้ำอย่างมากแสดงด้วยสีส้ม (C และ D) โปรตีน-W แสดงในรูปแบบการ์ตูน โดยมีทิศทางเดียวกับใน (A) (C) และหมุนไป 180° (D) ตามตำแหน่งในลำดับกรดอะมิโน กรดอะมิโนที่สามารถแยกแยะได้จะใช้โทนสีรุ้ง โดยปลาย N เป็นสีน้ำเงินและปลาย C เป็นสีแดง (E) โปรตีน-W ในมุมมองเดียวกับใน (A) และกรดอะมิโนที่ส่วนต่อประสานของโปรตีน-W:LH1 แสดงด้วยแท่งที่มีเครื่องหมายกำกับ (F) โปรตีน-W ถูกหมุน 90° เมื่อเทียบกับ (E) และ LH1αβ14 ในภาพการ์ตูน และเมื่อเทียบกับสารตกค้างที่ส่วนต่อประสานในภาพแท่ง สารตกค้างที่ยื่นออกมาจากโพลีเปปไทด์เบต้าถูกระบุไว้ โคแฟคเตอร์แสดงเป็นแท่งที่มีสีตรงกับรูปที่ 1 β-DDM ที่สลายตัวแล้วแสดงเป็นสีเทา และออกซิเจนแสดงเป็นสีแดง (G) มุมมองใน (F) ถูกหมุน 180° โดยมีสารตกค้างที่เด่นชัดของโพลีเปปไทด์อัลฟาที่ระบุไว้
โปรตีน-W เข้ามาแทนที่เฮเทอโรไดเมอร์ αβ (ตัวที่ 15 ในรูปที่ 1F) ทำให้ป้องกันการปิดวงและทำให้เฮเทอโรไดเมอร์ αβ สามตัวแรกเอียง พบว่ามุมเอียงสูงสุดของเฮเทอโรไดเมอร์ αβ-1 ตัวแรกเมื่อเทียบกับระนาบฟิล์มอยู่ที่ 25° ถึง 29° (รูปที่ 1, A และ E) ซึ่งเกิดจากการเอียง 2° ถึง 8° ของ αβ-1 ใน RC ที่มีความคมชัดสูงกับ LH116 (รูปที่ 1, B และ F) เฮเทอโรไดเมอร์ตัวที่สองและสามเอียงที่ 12° ถึง 22° และ 5° ถึง 10° ตามลำดับ เนื่องจากข้อจำกัดทางสเตอริกของ RC การเอียงของ αβ-1 จึงไม่รวมคู่ที่สองของ αβ (ซึ่งตรงกับ αβ ตัวที่ 16 ในรูปที่ 1F) ทำให้เกิดช่องว่างที่ชัดเจนในวงแหวน LH1 (รูปที่ 1, A และ E) เนื่องจากการขาดเฮเทอโรไดเมอร์ αβ สองตัว พร้อมกับการสูญเสีย BChl สี่ตัวและแคโรทีนอยด์สองตัว ทำให้ไม่มีแคโรทีนอยด์ใดจับกับซับยูนิต αβ-1 ที่บิดเบี้ยว ส่งผลให้วงแหวน LH114-W ประกอบด้วยแคโรทีนอยด์มังสวิรัติ 13 ตัวและ BChl 28 ตัว การประมาณความละเอียดเฉพาะที่ของคอมเพล็กซ์ทั้งสองในบริเวณ αβ1 ถึง 7 นั้นต่ำกว่าส่วนที่เหลือของลูป LH1 ซึ่งอาจสะท้อนถึงความยืดหยุ่นโดยธรรมชาติของซับยูนิต LH1 ที่อยู่ติดกับไซต์ RC QB (รูปที่ 4)
ภาพของ RC-LH114-W (A และ B) และ RC-LH116 (C และ D) แสดงจากมุมมองด้านบน/ด้านข้างเดียวกัน (A และ B) (A และ C) และพื้นผิวโพรงของรูปที่ 1 (B และ D) สัญลักษณ์สีแสดงอยู่ทางด้านขวา
คอมเพล็กซ์แกนกลางลักษณะเฉพาะอื่น ๆ เพียงอย่างเดียวที่มีอัตราส่วนสโตอิคิโอเมตริก 1:14 คือไดเมอร์ RC-LH1-PufX ของ Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13) อย่างไรก็ตาม โปรตีน W และ PufX ไม่มีความคล้ายคลึงกันที่ชัดเจน และมีผลกระทบอย่างมากต่อโครงสร้าง LH1 ของพวกมัน PufX เป็น TMH เดี่ยวที่มีโดเมนไซโตพลาสมิกปลาย N ที่ทำปฏิกิริยากับด้านไซโตพลาสมิกของซับยูนิต RC-H (13) ในตำแหน่งที่สอดคล้องกับ Rps. palustris LH116αβ-16 PufX สร้างช่องทางสำหรับการแลกเปลี่ยนควิโนน/ควิโนโลนระหว่าง RC-LH1 และคอมเพล็กซ์ไซโตโครม bcl และมีอยู่ในคอมเพล็กซ์แกนกลาง Rba. sphaeroides ทั้งหมด (13) แม้ว่าอินเทอร์เฟซโมโนเมอร์-โมโนเมอร์จะอยู่ใน Rba. ไดเมอร์ RC-LH1-PufX ของ sphaeroides ตั้งอยู่ที่ตำแหน่งการจับของโปรตีน W ใน RC-LH114-W และช่องว่างที่เกิดจาก PufX และโปรตีน W อยู่ที่ตำแหน่งที่เทียบเท่ากัน (รูปที่ S7A) ช่องว่างใน RC-LH114-W ยังสอดคล้องกับช่องควิโนนสมมุติ (8) ของ Pseudomonas rosea LH1 ซึ่งเกิดจากเปปไทด์ที่ไม่เกี่ยวข้องกับโปรตีน W หรือ PufX (รูปที่ S7B) นอกจากนี้ ช่องควิโนนใน Blc. the emerald green LH1 ที่เกิดจากการตัดซับยูนิต γ หนึ่งตัวออก (7) ตั้งอยู่ที่ตำแหน่งที่คล้ายกัน (รูปที่ S7C) แม้ว่าจะถูกควบคุมโดยโปรตีนที่แตกต่างกัน การปรากฏของช่องควิโนน/ควิโนลอลเหล่านี้ในตำแหน่งทั่วไปในคอมเพล็กซ์ RC-LH1 ดูเหมือนจะเป็นตัวอย่างของวิวัฒนาการแบบบรรจบกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าช่องว่างที่สร้างขึ้นโดยโปรตีน W อาจทำหน้าที่เป็นช่องควิโนน
ช่องว่างในลูป LH114-W ช่วยให้เกิดบริเวณเยื่อหุ้มเซลล์ต่อเนื่องระหว่างพื้นที่ภายในของคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W และเยื่อหุ้มเซลล์ส่วนใหญ่ (รูปที่ 1G) แทนที่จะเชื่อมต่อโดเมนทั้งสองผ่านรูพรุนโปรตีนดังเช่นในโปรตีน คอมเพล็กซ์ RC-LH116 คล้ายกับคอมเพล็กซ์รูปเข็ม Tch ที่ปิดอยู่ (22) (รูปที่ 1H) เนื่องจากการแพร่กระจายของควิโนนผ่านเยื่อหุ้มเซลล์เร็วกว่าการแพร่กระจายผ่านช่องโปรตีนที่แคบ ลูป LH114-W ที่เปิดอยู่จึงช่วยให้ RC หมุนเวียนได้เร็วกว่าลูป LH116 ที่ปิดอยู่ และการแพร่กระจายของควิโนนเข้าไปใน RC อาจถูกจำกัดมากขึ้น เพื่อทดสอบว่าโปรตีน W มีผลต่อการแปลงควิโนนผ่าน RC หรือไม่ เราจึงทำการทดสอบการออกซิเดชันของไซโตโครมที่ความเข้มข้นหนึ่งของยูบิควิโนน 2 (UQ2) (อะนาล็อกของ UQ10 ตามธรรมชาติที่มีหางไอโซพรีนสั้นกว่า) (รูปที่ 2E) แม้ว่าการมีอยู่ของคีเลตควิโนนจะขัดขวางการกำหนดค่าคงที่ไมเคิลลิสที่ปรากฏอย่างแม่นยำ (RC-LH114-W และ RC-LH116 เหมาะสำหรับ 0.2±0.1μM และ 0.5±0.2μM ตามลำดับ) แต่ค่าอัตราสูงสุดของ RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) นั้นสูงกว่า RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1) ถึง 28±5%
ในเบื้องต้น เราประเมินว่าโปรตีน-W มีอยู่ในคอมเพล็กซ์หลักประมาณ 10% (16) โดยอัตราการครอบครองของเซลล์ที่เจริญเติบโตในสภาพแสงน้อย แสงปานกลาง และแสงมาก คือ 15±0.6%, 11±1% และ 0.9±0.5% ตามลำดับ (รูปที่ 2F) การเปรียบเทียบเชิงปริมาณของแมสสเปกโทรเมตรีแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มแท็กฮิสติดีนไม่ได้ลดความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของโปรตีน-W เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ป่า (P = 0.59) ดังนั้นระดับเหล่านี้จึงไม่ใช่สิ่งผิดปกติของโปรตีน-W ที่ถูกดัดแปลง (รูปที่ S10) อย่างไรก็ตาม การครอบครองโปรตีน-W ที่ต่ำในคอมเพล็กซ์ RC-LH1 อาจทำให้ RC บางส่วนพลิกกลับได้ในอัตราที่เร่งขึ้น ซึ่งจะช่วยลดการแลกเปลี่ยนควิโนน/ควิโนโลนที่ช้าลงในคอมเพล็กซ์ RC-LH116 เราสังเกตเห็นว่าอัตราการครอบครองแสงที่สูงไม่สอดคล้องกับข้อมูลทรานสคริปโตมิกส์ล่าสุด ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของยีน pufW เพิ่มขึ้นภายใต้แสงที่แรง (รูปที่ S11) (23) ความแตกต่างระหว่างการถอดรหัส pufW และการรวมโปรตีน-W เข้ากับคอมเพล็กซ์ RC-LH1 นั้นสับสนและอาจสะท้อนถึงการควบคุมที่ซับซ้อนของโปรตีน
ใน RC-LH114-W มีโมเลกุลคาร์ดิโอลิปิน (CDL) 6 โมเลกุล, ฟอสฟาติดิลโคลีน (POPC) 7 โมเลกุล, ฟอสฟาติดิลกลีเซอรอล (POPG) 1 โมเลกุล และ β-DDM 29 โมเลกุล กระจายตัวอยู่ และมีการจำลองโครงสร้างใน RC-LH116 โดยมี CDL 6 โมเลกุล, POPC 24 โมเลกุล, POPG 2 โมเลกุล และ β-DDM 12 โมเลกุล (รูปที่ 5, A และ B) ในโครงสร้างทั้งสองนี้ CDL ส่วนใหญ่จะอยู่ทางด้านไซโตพลาสมิกของคอมเพล็กซ์ ในขณะที่ POPC, POPG และ β-DDM ส่วนใหญ่จะอยู่ทางด้านลูมินัล มีการแยกโมเลกุลไขมันและสารซักฟอก 2 โมเลกุลในบริเวณ αβ-1 ถึง αβ-6 ของคอมเพล็กซ์ RC-LH114-W (รูปที่ 5A) และแยกได้ 5 โมเลกุลในบริเวณที่เทียบเท่ากันของ RC-LH116 (รูปที่ 5B) พบลิปิดเพิ่มเติมที่ด้านอื่นของคอมเพล็กซ์ ส่วนใหญ่เป็น CDL สะสมอยู่ระหว่าง RC และ αβ-7 ถึง αβ-13 (รูปที่ 5, A และ B) ลิปิดและสารลดแรงตึงผิวอื่นๆ ที่มีโครงสร้างที่ชัดเจนนั้นตั้งอยู่นอกวงแหวน LH1 และโซ่แอซิลที่มีโครงสร้างชัดเจนทอดยาวระหว่างหน่วยย่อย LH1 ซึ่งกำหนดเบื้องต้นเป็น β-DDM ใน RC-LH114-W และกำหนดให้เป็น β-DDM ใน RC A ซึ่งเป็นส่วนผสมของ β-DDM และ POPC-LH116 ตำแหน่งที่คล้ายคลึงกันของลิปิดคีเลตและสารลดแรงตึงผิวในโครงสร้างของเราบ่งชี้ว่าพวกมันเป็นตำแหน่งการจับที่เกี่ยวข้องทางสรีรวิทยา (รูปที่ S12A) ตำแหน่งของโมเลกุลที่เทียบเท่ากันใน Tch ก็มีความสอดคล้องกันดีเช่นกัน Gentle และ Trv สายพันธุ์ 970 RC-LH1 (รูปที่ S12, B ถึง E) (9, 12) และสารตกค้างพันธะไฮโดรเจนของกลุ่มหัวลิปิดแสดงให้เห็นการอนุรักษ์ที่ดีพอสมควรในการจัดเรียงลำดับ (รูปที่ S13) ซึ่งบ่งชี้ว่า CDL ที่ได้รับการอนุรักษ์ซึ่งจับกับ RC (24) ตำแหน่งเหล่านี้อาจได้รับการอนุรักษ์ในคอมเพล็กซ์ RC-LH1
(A และ B) เปปไทด์ RC-LH114-W (A) และ RC-LH116 (B) แสดงด้วยภาพการ์ตูน และรงควัตถุแสดงด้วยแท่ง โดยใช้โทนสีในรูปที่ 1 ลิปิดแสดงด้วยสีแดง และสารลดแรงตึงผิวแสดงด้วยสีเทา UQ ที่จับกับไซต์ RC QA และ QB เป็นสีเหลือง ในขณะที่ UQ ที่แยกเดี่ยวเป็นสีน้ำเงิน (C และ D) มุมมองเดียวกันกับ (A) และ (B) โดยตัดลิปิดออก (E ถึง G) มุมมองที่ขยายใหญ่ขึ้นของ Q1(E), Q2(F) และ Q3(G) จาก RC-LH116 พร้อมกับโซ่ข้างที่ส่งผลต่อกันและกัน พันธะไฮโดรเจนแสดงด้วยเส้นประสีดำ
ใน RC-LH116 ทั้ง RC QA และ QB UQ ซึ่งมีส่วนร่วมในการถ่ายโอนอิเล็กตรอนในกระบวนการแยกประจุ จะถูกแยกส่วนในตำแหน่งการจับของพวกมัน อย่างไรก็ตาม ใน RC-LH114-W ควิโนน QB ยังไม่ได้รับการระบุ และจะกล่าวถึงรายละเอียดเพิ่มเติมด้านล่าง นอกจากควิโนน QA และ QB แล้ว โมเลกุล UQ ที่ถูกคีเลตสองโมเลกุล (ตั้งอยู่ระหว่างวงแหวน RC และ LH1) ยังถูกจัดสรรในโครงสร้าง RC-LH114-W ตามกลุ่มหัวที่ระบุได้อย่างชัดเจน (ตั้งอยู่ในพื้นที่ Q1 และ Q2 ตามลำดับ) (รูปที่ 5C) หน่วยไอโซพรีนสองหน่วยถูกกำหนดให้กับ Q1 และแผนที่ความหนาแน่นระบุส่วนหางไอโซพรีน 10 หน่วยที่สมบูรณ์ของ Q2 ในโครงสร้างของ RC-LH116 โมเลกุล UQ10 ที่ถูกคีเลตสามโมเลกุล (Q1 ถึง Q3 รูปที่ 5D) ได้รับการระบุ และโมเลกุลทั้งหมดมีความหนาแน่นที่ชัดเจนตลอดส่วนหาง (รูปที่ 5, D ถึง G) ในโครงสร้างทั้งสอง ตำแหน่งของกลุ่มหัวควิโนนของ Q1 และ Q2 มีความสอดคล้องกันอย่างดีเยี่ยม (รูปที่ S12F) และพวกมันมีปฏิสัมพันธ์กับ RC เท่านั้น Q1 ตั้งอยู่ที่ทางเข้าของช่องว่าง W ของ RC-LH114-W (รูปที่ 1G และ 5, C, D และ E) และ Q2 ตั้งอยู่ใกล้กับตำแหน่งการจับของ QB (รูปที่ 5, C, D และ F) กรดอะมิโน L-Trp143 และ L-Trp269 ที่อนุรักษ์ไว้ อยู่ใกล้กับ Q1 และ Q2 มาก และให้ปฏิสัมพันธ์แบบ π-stacking ที่เป็นไปได้ (รูปที่ 5, E และ F และรูปที่ S12) L-Gln88 ซึ่งอยู่ห่างจากออกซิเจนด้านปลายของ Q1 3.0 Å ให้พันธะไฮโดรเจนที่แข็งแรง (รูปที่ 5E) กรดอะมิโนนี้ได้รับการอนุรักษ์ไว้ใน RC ทั้งหมด ยกเว้นความสัมพันธ์ที่ห่างไกลที่สุด (รูปที่ S13) L-Ser91 ถูกแทนที่ด้วย Thr อย่างระมัดระวังใน RC อื่นๆ ส่วนใหญ่ (รูปที่ S13) อยู่ห่างจากออกซิเจนเมทิลของ Q1 3.8 อังสตรอม และอาจสร้างพันธะไฮโดรเจนที่อ่อนแอได้ (รูปที่ 5E) Q3 ดูเหมือนจะไม่มีปฏิสัมพันธ์ที่เฉพาะเจาะจง แต่ตั้งอยู่ในบริเวณที่ไม่ชอบน้ำระหว่างหน่วยย่อย RC-M และหน่วยย่อย LH1-α 5 ถึง 6 (รูปที่ 5, D และ G) Q1, Q2 และ Q3 หรือควิโนนคีเลตที่อยู่ใกล้เคียงก็ได้รับการระบุใน Tch. Gentle, Trv. Strain 970 และ Blc. โครงสร้างของไอริส (9, 10, 12) ชี้ให้เห็นถึงตำแหน่งการจับควิโนนเสริมที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ในคอมเพล็กซ์ RC-LH1 (รูปที่ S12G) UQ ที่สลายตัวทั้งห้าใน RC-LH116 สอดคล้องกับค่า 5.8±0.7 ของแต่ละคอมเพล็กซ์ที่กำหนดโดยโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง (HPLC) ในขณะที่ UQ ที่สลายตัวทั้งสามใน RC-LH114-W มีค่าต่ำกว่าค่าที่วัดได้ 6.2±0.3 (รูปที่ S14) ซึ่งบ่งชี้ว่ามีโมเลกุล UQ ที่ยังไม่สามารถแยกแยะได้ในโครงสร้าง
โพลีเปปไทด์ L และ M ที่มีสมมาตรเทียมแต่ละตัวประกอบด้วย TMH ห้าตัวและสร้างเฮเทอโรไดเมอร์ที่รวมไดเมอร์ BChl หนึ่งตัว โมโนเมอร์ BChl สองตัว โมโนเมอร์แบคทีริโอเฟจ (BPh) สองตัว และเหล็กที่ไม่ใช่ฮีมหนึ่งตัวและโมเลกุล UQ10 หนึ่งหรือสองโมเลกุล ผ่านการมีพันธะไฮโดรเจนบนกลุ่มคีโตนปลายและการสะสมที่ทราบใน Rps แคโรทีนอยด์จะถูกรวมเข้าในซับยูนิต M ซึ่งมีชื่อว่า cis-3,4-dehydroorhodopin (25) โดเมนเยื่อหุ้มเซลล์ด้านนอกของ RC-H ยึดติดกับเยื่อหุ้มเซลล์ด้วย TMH หนึ่งตัว โครงสร้าง RC โดยรวมคล้ายกับ RC สามซับยูนิตของสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้อง (เช่น Rba) sphaeroides (PDB ID: 3I4D) วงแหวนขนาดใหญ่ของ BChl และ BPh โครงสร้างหลักของแคโรทีนอยด์ และเหล็กที่ไม่ใช่ฮีมนั้นทับซ้อนกันภายในช่วงความละเอียดของโครงสร้างเหล่านี้ เช่นเดียวกับกลุ่มหัว UQ10 ที่ไซต์ QA และควิโนน QB ที่ RC-LH116 (รูปที่ S15)
การมีโครงสร้าง RC สองแบบที่มีอัตราการครอบครองไซต์ QB ที่แตกต่างกันทำให้เกิดโอกาสใหม่ในการตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่สอดคล้องกันซึ่งมาพร้อมกับการจับควิโนน QB ในคอมเพล็กซ์ RC-LH116 ควิโนน QB จะอยู่ในตำแหน่ง “ใกล้เคียง” ที่จับอย่างสมบูรณ์ (26) แต่การแยก RC-LH114-W ไม่มีควิโนน QB ไม่มีควิโนน QB ใน RC-LH114-W ซึ่งเป็นเรื่องน่าประหลาดใจเพราะคอมเพล็กซ์นี้ยังคงทำงานอยู่ มากกว่าคอมเพล็กซ์ RC-LH116 ที่มีควิโนน QB ที่มีโครงสร้างที่ชัดเจน แม้ว่าวงแหวน LH1 สองวงจะคีเลตควิโนนประมาณหกตัว แต่ห้าตัวมีโครงสร้างที่ชัดเจนในวงแหวน RC-LH116 ที่ปิดอยู่ ในขณะที่มีเพียงสามตัวเท่านั้นที่มีโครงสร้างจำกัดในวงแหวน RC-LH114-W ที่เปิดอยู่ ความไม่เป็นระเบียบทางโครงสร้างที่เพิ่มขึ้นนี้อาจสะท้อนถึงการแทนที่ไซต์ QB ของ RC-LH114-W ที่เร็วขึ้น จลนศาสตร์ของควิโนนที่เร็วขึ้นในคอมเพล็กซ์ และโอกาสที่เพิ่มขึ้นในการข้ามลูป LH1 เราเสนอว่าการขาด UQ ในไซต์ QB ของ RC-LH114-W อาจเป็นผลมาจากคอมเพล็กซ์ที่ซับซ้อนและมีกิจกรรมมากขึ้น และไซต์ QB ของ RC-LH114-W ได้ถูกตรึงไว้ทันทีในการหมุนเวียนของ UQ ขั้นตอนเฉพาะ (ทางเข้าสู่ไซต์ QB ถูกปิด) สะท้อนถึงโครงสร้างของกิจกรรมนี้
หากไม่มี QB การหมุนของ L-Phe217 ที่เกิดขึ้นพร้อมกันไปยังตำแหน่งที่ไม่เข้ากันกับการจับกับ UQ10 จะทำให้เกิดการชนกันในเชิงพื้นที่กับหน่วยไอโซพรีนแรกของส่วนหาง (รูปที่ 6A) นอกจากนี้ การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างหลักที่เห็นได้ชัดเจนนั้นเห็นได้ชัด โดยเฉพาะอย่างยิ่งเฮลิกซ์ de (เฮลิกซ์สั้นในลูประหว่าง TMH D และ E) ซึ่ง L-Phe217 เลื่อนไปยังช่องจับ QB และการหมุนของ L-Tyr223 (รูปที่ 6A) เพื่อทำลายพันธะไฮโดรเจนกับโครงสร้าง M-Asp45 และปิดทางเข้าของตำแหน่งจับ QB (รูปที่ 6B) เฮลิกซ์ de หมุนที่ฐานของมัน Cα ของ L-Ser209 เลื่อนไป 0.33 Å ในขณะที่ L-Val221Cα เลื่อนไป 3.52 Å ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้ใน TMH D และ E ซึ่งสามารถซ้อนทับกันได้ในโครงสร้างทั้งสอง (รูปที่ 6A) เท่าที่เราทราบ นี่คือโครงสร้างแรกใน RC ตามธรรมชาติที่ปิดไซต์ QB การเปรียบเทียบกับโครงสร้างที่สมบูรณ์ (ที่จับกับ QB แล้ว) แสดงให้เห็นว่าก่อนที่ควิโนนจะถูกรีดิวซ์ จำเป็นต้องมีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเพื่อให้มันเข้าไปในควิโนนได้ L-Phe217 หมุนเพื่อสร้างปฏิกิริยาการเรียงซ้อนแบบ π กับกลุ่มหัวของควิโนน และเกลียวจะเลื่อนออกไปด้านนอก ทำให้โครงกระดูกของ L-Gly222 และโซ่ข้างของ L-Tyr223 สามารถสร้างเครือข่ายพันธะไฮโดรเจนที่มีโครงสร้างพันธะไฮโดรเจนที่เสถียรได้ (รูปที่ 6, A และ C)
(A) ภาพการ์ตูนซ้อนทับของโฮโลแกรม (สาย L สีส้ม/สาย M สีม่วงแดง) และโครงสร้างอะโป (สีเทา) ซึ่งแสดงสารตกค้างที่สำคัญในรูปแบบแท่ง UQ10 แสดงด้วยแถบสีเหลือง เส้นประแสดงพันธะไฮโดรเจนที่เกิดขึ้นในโครงสร้างทั้งหมด (B และ C) การแสดงพื้นผิวของอะโพลิโปโปรตีนและโครงสร้างวงแหวนทั้งหมด โดยเน้นออกซิเจนของหมู่ข้างเคียงของ L-Phe217 เป็นสีน้ำเงินและ L-Tyr223 เป็นสีแดง ตามลำดับ หน่วยย่อย L เป็นสีส้ม หน่วยย่อย M และ H ไม่ได้ระบายสี (D และ E) อะโพลิโปโปรตีน (D) และไซต์ RC QB ทั้งหมด (E) [ระบายสีตาม (A) ตามลำดับ] และ Thermophilus thermophilus PSII (สีเขียว สีน้ำเงินด้วยพลาสติกควิโนน; รหัส PDB: 3WU2) จัดเรียง (58)
โดยไม่คาดคิด แม้ว่าจะมีโครงสร้าง RC ที่ขาด QB หลายโครงสร้างโดยไม่มี LH1 อยู่แล้ว แต่การเปลี่ยนแปลงโครงสร้างที่สังเกตได้ในการศึกษาครั้งนี้ยังไม่เคยมีการรายงานมาก่อน ซึ่งรวมถึงโครงสร้างที่ขาด QB จาก Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) และ Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) ซึ่งทั้งหมดเกือบจะเหมือนกับโครงสร้าง QB โดยรวม การตรวจสอบ 3PRC อย่างละเอียดเผยให้เห็นว่าโมเลกุลผงซักฟอก LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) จับที่ทางเข้าของตำแหน่ง QB ซึ่งอาจป้องกันการจัดเรียงใหม่เป็นโครงสร้างแบบปิด แม้ว่า LDAO จะไม่สลายตัวที่ตำแหน่งเดียวกันใน 1EYS หรือ 1OGV แต่ RC เหล่านี้ถูกเตรียมโดยใช้ผงซักฟอกชนิดเดียวกัน ดังนั้นจึงอาจทำให้เกิดผลเช่นเดียวกัน โครงสร้างผลึกของ Rba. Sphaeroides RC ที่ตกผลึกร่วมกับไซโตโครม c2 (PDB ID: 1L9B) ดูเหมือนจะมีไซต์ QB ที่ปิดอยู่เช่นกัน อย่างไรก็ตาม ในกรณีนี้ บริเวณปลาย N ของพอลิเปปไทด์ RC-M (ที่ทำปฏิกิริยากับไซต์การจับ QB ผ่านพันธะไฮโดรเจนของสารตกค้าง Tyr บนเกลียว Q) มีโครงสร้างที่ไม่เป็นธรรมชาติ และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของ QB ไม่ได้รับการสำรวจเพิ่มเติม (30) สิ่งที่น่าอุ่นใจคือเราไม่พบการเสียรูปของพอลิเปปไทด์ M แบบนี้ในโครงสร้าง RC-LH114-W ซึ่งเกือบจะเหมือนกับบริเวณปลาย N ของ RC-LH116 RC นอกจากนี้ควรสังเกตว่าหลังจากกำจัดเสาอากาศ LH1 ที่ใช้ผงซักฟอกแล้ว RC ของอะโพลิโปโปรตีนใน PDB ได้รับการแก้ไข ซึ่งกำจัดกลุ่มควิโนนภายในและลิปิดในช่องว่างระหว่าง RC และพื้นผิวด้านในของวงแหวน LH1 ที่อยู่รอบๆ (31, 32) RC ยังคงทำงานได้เนื่องจากยังคงรักษาโคแฟคเตอร์ทั้งหมดไว้ ยกเว้นควิโนน QB ที่สลายตัวได้ ซึ่งมีความเสถียรน้อยกว่าและมักจะสูญหายไปในระหว่างกระบวนการเตรียม (33) นอกจากนี้ เป็นที่ทราบกันดีว่าการกำจัด LH1 และลิปิดวงจรธรรมชาติออกจาก RC อาจส่งผลกระทบต่อการทำงาน เช่น อายุการใช้งานที่สั้นลงของสถานะ P+QB ที่แยกประจุ (31, 34, 35) ดังนั้น เราจึงคาดการณ์ว่าการมีอยู่ของวงแหวน LH1 เฉพาะที่ล้อมรอบ RC อาจช่วยรักษาไซต์ QB ที่ "ปิด" ไว้ได้ จึงช่วยรักษาสภาพแวดล้อมเฉพาะที่ใกล้กับ QB ไว้ได้
แม้ว่าอะโพลิโปโปรตีน (ที่ไม่มีควิโนน QB) และโครงสร้างที่สมบูรณ์จะแสดงเพียงสองภาพสแนปช็อตของการหมุนเวียนของไซต์ QB มากกว่าจะเป็นชุดของเหตุการณ์ แต่ก็มีข้อบ่งชี้ว่าการจับกันสามารถควบคุมได้เพื่อป้องกันการจับกันใหม่โดยไฮโดรควิโนนเพื่อยับยั้งการยับยั้งของสารตั้งต้น ปฏิสัมพันธ์ของควิโนลอลและควิโนนใกล้กับไซต์ QB ของอะโพลิโปโปรตีนอาจแตกต่างกัน ซึ่งนำไปสู่การปฏิเสธโดย RC มีการเสนอมานานแล้วว่าการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างมีบทบาทในการจับและการลดควิโนน ความสามารถของ RC ที่แช่แข็งในการลดควิโนนหลังจากการปรับตัวในที่มืดจะบกพร่อง (36) ผลึกศาสตร์รังสีเอกซ์แสดงให้เห็นว่าความเสียหายนี้เกิดจากควิโนน QB ถูกดักจับในโครงสร้าง "ระยะไกล" ประมาณ 4.5 Å จากตำแหน่งใกล้เคียงที่ใช้งานอยู่ (26, 37) เราเสนอว่าโครงสร้างการจับยึดที่อยู่ห่างออกไปนี้เป็นภาพนิ่งของสถานะขั้นกลางระหว่างอะโพลิโปโปรตีนและโครงสร้างวงแหวนที่สมบูรณ์ ซึ่งเกิดขึ้นหลังจากการโต้ตอบเริ่มต้นกับควิโนนและการเปิดของไซต์ QB
RC ชนิด II ที่พบในคอมเพล็กซ์ PSII ของแบคทีเรียสังเคราะห์แสงและไซยาโนแบคทีเรีย สาหร่าย และพืชบางชนิด มีโครงสร้างและหน้าที่ที่ได้รับการอนุรักษ์ไว้ (38) การจัดเรียงโครงสร้างที่แสดงในรูปที่ 6 (D และ E) เน้นความคล้ายคลึงกันระหว่าง RC ของ PSII และไซต์ QB ของคอมเพล็กซ์ RC ของแบคทีเรีย การเปรียบเทียบนี้เป็นแบบจำลองสำหรับการศึกษาระบบที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดของการจับและการลดควิโนนมานานแล้ว สิ่งพิมพ์ก่อนหน้านี้แนะนำว่าการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเกิดขึ้นพร้อมกับการลดควิโนนของ PSII (39, 40) ดังนั้น เมื่อพิจารณาถึงการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการของ RC กลไกการจับที่ไม่เคยสังเกตมาก่อนนี้อาจนำไปใช้กับไซต์ QB ของ RC ของ PSII ในพืชสังเคราะห์แสงที่มีออกซิเจนได้เช่นกัน
สายพันธุ์ Rps ΔpufW (การลบ pufW ที่ไม่มีฉลาก) และ PufW-His (โปรตีน-W ที่มีแท็ก His 10x ที่ปลาย C ซึ่งแสดงออกจากตำแหน่ง pufW ตามธรรมชาติ) palustris CGA009 ได้รับการอธิบายไว้ในงานก่อนหน้าของเรา (16) สายพันธุ์เหล่านี้และสายพันธุ์แม่ที่เป็นไอโซจีนิกแบบป่าถูกนำกลับมาจากช่องแช่แข็งโดยการขีดเซลล์จำนวนเล็กน้อยลงบนจานวุ้น PYE (แต่ละ 5 กรัมต่อลิตร) (เก็บใน LB ที่ -80 °C ซึ่งมีกลีเซอรอล 50% (w/v)) โปรตีน สารสกัดจากยีสต์ และซัคซิเนต [1.5% (w/v)] นำจานเพาะเชื้อไปบ่มค้างคืนในที่มืดที่อุณหภูมิห้องภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจน จากนั้นจึงฉายแสงสีขาว (~50 μmolm-2 s-1) จากหลอดฮาโลเจน OSRAM 116 วัตต์ (RS Components, สหราชอาณาจักร) เป็นเวลา 3 ถึง 5 วัน จนกระทั่งมีโคโลนีเดียวปรากฏขึ้น นำโคโลนีเดียวนั้นไปเพาะในอาหารเลี้ยงเชื้อ M22+ ปริมาณ 10 มล. (41) ที่เสริมด้วยกรดอะมิโนแคสซามิโน 0.1% (w/v) (ต่อไปนี้เรียกว่า M22) เพาะเลี้ยงเชื้อภายใต้สภาวะออกซิเจนต่ำในที่มืดที่อุณหภูมิ 34°C พร้อมกับเขย่าที่ 180 รอบต่อนาที เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นจึงนำอาหารเลี้ยงเชื้อปริมาณ 70 มล. ไปเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะเดียวกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง นำเชื้อจุลินทรีย์แบบกึ่งแอโรบิกปริมาตร 1 มล. มาเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ M22 ปริมาตร 30 มล. ในขวดแก้วใสฝาเกลียวขนาด 30 มล. แล้วฉายแสงพร้อมกวนด้วยแท่งกวนแม่เหล็กปลอดเชื้อ (~50 μmolm⁻²s⁻¹) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง จากนั้นนำเชื้อจุลินทรีย์ 30 มล. มาเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อประมาณ 1 ลิตร ภายใต้สภาวะเดียวกัน แล้วนำไปเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อประมาณ 9 ลิตร ที่ฉายแสงด้วยความเข้มแสง ~200 μmolm⁻²s⁻¹ เป็นเวลา 72 ชั่วโมง เก็บเกี่ยวเซลล์โดยการปั่นเหวี่ยงที่ 7132 RCF เป็นเวลา 30 นาที ละลายเซลล์ในสารละลาย tris-HCl 20 mM (pH 8.0) ประมาณ 10 มล. และเก็บรักษาไว้ที่ -20°C จนกว่าจะใช้งาน
หลังจากละลายน้ำแข็งแล้ว ให้เติมผลึกดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (Merck, สหราชอาณาจักร), ไลโซไซม์ (Merck, สหราชอาณาจักร) และเม็ดสารยับยั้งโปรตีเอสโฮโลเอนไซม์ของ Roche สองเม็ด (Merck, สหราชอาณาจักร) ลงในเซลล์ที่แขวนลอยอยู่ จากนั้นใช้เครื่องอัดความดัน French pressure cell ขนาด 20,000 psi (Aminco, สหรัฐอเมริกา) บดเซลล์ 8 ถึง 12 ครั้ง หลังจากกำจัดเซลล์ที่ไม่แตกและเศษที่ไม่ละลายน้ำออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 18,500 RCF เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C แล้ว ทำการตกตะกอนเยื่อหุ้มเซลล์จากสารละลายที่มีสีโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 113,000 RCF เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 43,000°C ทิ้งส่วนที่ละลายน้ำได้และแขวนลอยเยื่อหุ้มเซลล์ที่มีสีในสารละลาย tris-HCl 20 mM (pH 8.0) ปริมาตร 100 ถึง 200 มล. แล้วทำการผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันจนกว่าจะไม่เห็นก้อนรวมตัว นำเมมเบรนที่แขวนลอยไปบ่มในสารละลาย 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) ที่มี β-DDM 2% (w/v) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดที่อุณหภูมิ 4°C พร้อมกับการคนเบาๆ จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่อุณหภูมิ 70°C เพื่อละลาย 150,000 RCF ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อกำจัดสารที่ไม่ละลายที่เหลืออยู่
นำเมมเบรนที่ละลายได้จากสายพันธุ์ ΔpufW ไปใส่ในคอลัมน์แลกเปลี่ยนไอออน DEAE Sepharose ขนาด 50 มล. โดยใช้บัฟเฟอร์สำหรับจับยึดปริมาณสามเท่าของปริมาตรคอลัมน์ (CV) [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ที่มี β-DDM 0.03% (w/v)] ล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับจับยึดปริมาณสองเท่าของปริมาตรคอลัมน์ จากนั้นล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์สำหรับจับยึดปริมาณสองเท่าของปริมาตรคอลัมน์ที่มี NaCl 50 mM คอมเพล็กซ์ RC-LH116 ถูกชะออกมาด้วยการไล่ระดับความเข้มข้นเชิงเส้นของ NaCl จาก 150 ถึง 300 mM (ในบัฟเฟอร์สำหรับจับยึด) ที่ปริมาณ 1.75 เท่าของปริมาตรคอลัมน์ และคอมเพล็กซ์ที่เหลือถูกชะออกมาด้วยบัฟเฟอร์สำหรับจับยึดที่มี NaCl 300 mM ที่ปริมาณ 0.5 เท่าของปริมาตรคอลัมน์ เก็บสเปกตรัมการดูดกลืนแสงในช่วง 250 ถึง 1000 นาโนเมตร เก็บส่วนที่มีอัตราส่วนการดูดกลืนแสง (A880/A280) มากกว่า 1 ในช่วง 880 ถึง 280 นาโนเมตร เจือจางสองเท่าในบัฟเฟอร์สำหรับการจับ และใช้ขั้นตอนเดียวกันอีกครั้งกับคอลัมน์ DEAE ในการทำให้บริสุทธิ์ เจือจางส่วนที่มีอัตราส่วน A880/A280 สูงกว่า 1.7 และอัตราส่วน A880/A805 สูงกว่า 3.0 ทำการแลกเปลี่ยนไอออนรอบที่สาม และเก็บส่วนที่มีอัตราส่วน A880/A280 สูงกว่า 2.2 และอัตราส่วน A880/A805 สูงกว่า 5.0 คอมเพล็กซ์ที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์บางส่วนถูกทำให้เข้มข้นเหลือประมาณ 2 มล. ในตัวกรองแบบแรงเหวี่ยง Amicon ที่มีขนาดรูพรุน 100,000 (MWCO) (Merck, สหราชอาณาจักร) และนำไปใส่ในคอลัมน์แยกขนาด Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, สหรัฐอเมริกา) ที่บรรจุบัฟเฟอร์ NaCl 200 mM จากนั้นจึงชะออกมาในบัฟเฟอร์เดียวกันที่ 1.5 CV รวบรวมสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของส่วนที่แยกตามขนาด และทำให้สเปกตรัมการดูดกลืนแสงที่มีอัตราส่วน A880/A280 มากกว่า 2.4 และอัตราส่วน A880/A805 มากกว่า 5.8 เข้มข้นขึ้นเป็น 100 A880 และนำไปใช้ในการเตรียมกริดสำหรับ cryo-TEM หรือเก็บรักษาทันที เก็บที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่าจะใช้งาน
นำเมมเบรนที่ละลายได้จากสายพันธุ์ PufW-His ไปใส่ในคอลัมน์ HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ขนาด 20 มล. (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ที่มี NaCl 200 mM และ β-DDM 0.03% (w/w)) ในบัฟเฟอร์ IMAC (GE Healthcare) ล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์ IMAC จำนวน 5 ครั้ง จากนั้นล้างด้วยบัฟเฟอร์ IMAC ที่มีฮิสติดีน 10 mM จำนวน 5 ครั้ง แยกคอมเพล็กซ์หลักออกจากคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์ IMAC ที่มีฮิสติดีน 100 mM จำนวน 5 ครั้ง ส่วนประกอบที่มีสารเชิงซ้อน RC-LH114-W จะถูกทำให้เข้มข้นเหลือประมาณ 10 มล. ในถังกวนที่มีตัวกรอง Amicon 100,000 MWCO (Merck, สหราชอาณาจักร) เจือจาง 20 เท่าด้วยบัฟเฟอร์สำหรับการจับ แล้วเติมลงในคอลัมน์ DEAE Sepharose ปริมาตร 25 มล. โดยใช้ CV สี่ตัวที่จับกับบัฟเฟอร์ไว้ล่วงหน้า ล้างคอลัมน์ด้วยบัฟเฟอร์จับยึด CV สี่ตัว จากนั้นชะคอมเพล็กซ์ลงบน CV แปดตัวด้วยการไล่ระดับเชิงเส้นจาก 0 ถึง 100 mM NaCl (ในบัฟเฟอร์จับยึด) และ CV ที่เหลืออีกสี่ตัวมีบัฟเฟอร์จับยึด 100 mM คอมเพล็กซ์ที่เหลือที่ถูกชะออกมาบนโซเดียมคลอไรด์รวมกับเศษส่วนที่มีอัตราส่วน A880/A280 สูงกว่า 2.4 และอัตราส่วน A880/A805 สูงกว่า 4.6 ถูกทำให้เข้มข้นจนเหลือประมาณ 2 มล. ในตัวกรองแบบแรงเหวี่ยง Amicon 100,000 MWCO และเติมด้วย IMAC 1.5 CV ในคอลัมน์แยกขนาด Superdex 200 16/600 ที่ปรับสมดุลด้วยบัฟเฟอร์ล่วงหน้า จากนั้นชะในบัฟเฟอร์เดียวกันลงบน CV 1.5 ตัว รวบรวมสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของเศษส่วนที่แยกตามขนาด และเพิ่มความเข้มข้นของสเปกตรัมการดูดกลืนแสงที่มีอัตราส่วน A880/A280 มากกว่า 2.1 และอัตราส่วน A880/A805 มากกว่า 4.6 ให้เป็น 100 A880 ซึ่งจะนำไปใช้ในการเตรียมแผ่นกริด TEM แบบแช่แข็งทันที หรือเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่าจะถึงเวลาใช้งาน
ใช้เครื่องแช่แข็งแบบจุ่ม Leica EM GP ในการเตรียมแผ่นกริด TEM ที่อุณหภูมิต่ำ เจือจางสารประกอบเชิงซ้อนในบัฟเฟอร์ IMAC จนมีความเข้มข้น A880 เท่ากับ 50 จากนั้นจึงนำสารละลาย 5 ไมโครลิตรไปวางบนแผ่นตาข่ายทองแดงเคลือบด้วยคาร์บอน QUANTIFOIL 1.2/1.3 ที่เพิ่งผ่านกระบวนการปล่อยประจุไฟฟ้า (Agar Scientific, UK) บ่มแผ่นกริดที่อุณหภูมิ 20°C และความชื้นสัมพัทธ์ 60% เป็นเวลา 30 วินาที จากนั้นซับให้แห้งเป็นเวลา 3 วินาที แล้วจึงทำให้เย็นลงอย่างรวดเร็วในอีเทนเหลวที่อุณหภูมิ -176°C
ข้อมูลของสารประกอบ RC-LH114-W ถูกบันทึกบน eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) ด้วยกล้องจุลทรรศน์ Titan Krios ซึ่งทำงานที่แรงดันเร่ง 300kV กำลังขยายที่ระบุ 130,000 เท่า และพลังงานที่เลือกไว้ที่ 20 eV ใช้ Gatan 968 GIF Quantum พร้อมตัวตรวจจับพีค K2 ในการบันทึกภาพในโหมดนับเพื่อรวบรวมข้อมูล ขนาดพิกเซลที่ปรับเทียบแล้วคือ 1.048Å และอัตราปริมาณรังสีคือ 3.83 e-Å-2s-1 บันทึกภาพยนตร์ใน 11 วินาทีและแบ่งออกเป็น 40 ส่วน ใช้พื้นที่เคลือบด้วยคาร์บอนเพื่อปรับโฟกัสกล้องจุลทรรศน์ใหม่ จากนั้นบันทึกภาพยนตร์สามเรื่องต่อรู รวมทั้งหมดได้รวบรวมภาพยนตร์ 3130 เรื่อง โดยมีค่าการเบี่ยงเบนโฟกัสระหว่าง -1 ถึง -3μm
ข้อมูลสำหรับคอมเพล็กซ์ RC-LH116 ถูกรวบรวมโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ตัวเดียวกันที่ห้องปฏิบัติการ Asterbury Biostructure (มหาวิทยาลัยลีดส์ สหราชอาณาจักร) ข้อมูลถูกรวบรวมในโหมดนับด้วยกำลังขยาย 130k และขนาดพิกเซลถูกปรับเทียบเป็น 1.065 Å ด้วยปริมาณรังสี 4.6 e-Å-2s-1 ภาพยนตร์ถูกบันทึกใน 12 วินาทีและแบ่งออกเป็น 48 ส่วน โดยรวมแล้วมีการรวบรวมภาพยนตร์ 3359 เรื่อง โดยมีค่าการเบลอภาพระหว่าง -1 ถึง -3 μm
การประมวลผลข้อมูลทั้งหมดดำเนินการในไปป์ไลน์ Relion 3.0 (42) ใช้ Motioncorr 2 (43) เพื่อแก้ไขการเคลื่อนที่ของลำแสงโดยการถ่วงน้ำหนักปริมาณรังสี จากนั้นใช้ CTFFIND 4.1 (44) เพื่อกำหนดพารามิเตอร์ CTF (ฟังก์ชันการถ่ายโอนความคมชัด) ภาพถ่ายจุลทรรศน์ทั่วไปหลังจากขั้นตอนการประมวลผลเบื้องต้นเหล่านี้แสดงในรูปที่ 2 S16 แม่แบบการเลือกอัตโนมัติถูกสร้างขึ้นโดยการเลือกพิกเซลประมาณ 250 พิกเซลจากอนุภาค 1000 อนุภาคในเฟรม 250 พิกเซลด้วยตนเอง และไม่มีการอ้างอิงการจำแนกประเภทสองมิติ (2D) ดังนั้นจึงปฏิเสธการจำแนกประเภทที่ตรงกับการปนเปื้อนของตัวอย่างหรือไม่มีลักษณะที่สามารถแยกแยะได้ จากนั้น การเลือกอัตโนมัติจะดำเนินการกับภาพถ่ายจุลทรรศน์ทั้งหมด และ RC-LH114-W มีอนุภาค 849,359 อนุภาค และคอมเพล็กซ์ RC-LH116 มีอนุภาค 476,547 อนุภาค อนุภาคที่เลือกทั้งหมดได้ผ่านการจำแนกประเภท 2 มิติแบบไม่ใช้ข้อมูลอ้างอิงสองรอบ และหลังจากการทำงานแต่ละรอบ อนุภาคที่ตรงกับพื้นที่คาร์บอน การปนเปื้อนของตัวอย่าง ไม่มีคุณลักษณะที่ชัดเจน หรืออนุภาคที่ทับซ้อนกันอย่างมากจะถูกคัดออก ส่งผลให้เหลืออนุภาค 772,033 (90.9%) และ 359,678 (75.5%) ที่ใช้สำหรับการจำแนกประเภท 3 มิติของ RC-LH114-W และ RC-LH116 ตามลำดับ แบบจำลองอ้างอิง 3 มิติเริ่มต้นถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีการไล่ระดับแบบสุ่ม (stochastic gradient descent) โดยใช้แบบจำลองเริ่มต้นเป็นข้อมูลอ้างอิง อนุภาคที่เลือกจะถูกจำแนกออกเป็นสี่ประเภทใน 3 มิติ โดยใช้แบบจำลองในประเภทนี้เป็นข้อมูลอ้างอิง ทำการปรับแต่ง 3 มิติบนอนุภาคในประเภทที่ใหญ่ที่สุด จากนั้นใช้ตัวกรองความถี่ต่ำ 15 Å เริ่มต้นเพื่อครอบคลุมพื้นที่ตัวทำละลาย เพิ่มขอบนุ่ม 6 พิกเซล และประมวลผลพิกเซลภายหลังเพื่อแก้ไขฟังก์ชันการถ่ายโอนการปรับค่าสูงสุดของ Gatan K2 ของตัวตรวจจับด้านบน สำหรับชุดข้อมูล RC-LH114-W โมเดลเริ่มต้นนี้ได้รับการปรับเปลี่ยนโดยการลบความหนาแน่นสูงที่ขอบของมาสก์ (ซึ่งแยกออกจากความหนาแน่นของแกนกลางใน UCSF Chimera) โมเดลที่ได้ (ความละเอียดของ RC-LH114-W และ RC-LH116 คือ 3.91 และ 4.16 Å ตามลำดับ) ถูกใช้เป็นข้อมูลอ้างอิงสำหรับการจำแนกประเภท 3 มิติรอบที่สอง อนุภาคที่ใช้จะถูกจัดกลุ่มเป็นคลาส 3 มิติเริ่มต้นและไม่มีความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งกับบริเวณใกล้เคียง ไม่มีการทับซ้อนหรือขาดคุณลักษณะโครงสร้างที่ชัดเจน หลังจากรอบที่สองของการจำแนกประเภท 3 มิติ หมวดหมู่ที่มีความละเอียดสูงสุดจะถูกเลือก [สำหรับ RC-LH114-W หนึ่งหมวดหมู่มีอนุภาค 377,703 อนุภาค (44.5%) สำหรับ RC-LH116 มีสองหมวดหมู่ รวมทั้งหมด 260,752 อนุภาค (54.7%) ซึ่งเหมือนกันเฉพาะเมื่อจัดเรียงหลังจากการหมุนเริ่มต้นโดยมีความแตกต่างเล็กน้อย] อนุภาคที่เลือกจะถูกแยกออกมาอีกครั้งในกล่องขนาด 400 พิกเซล และปรับปรุงด้วยการปรับแต่งแบบ 3 มิติ หน้ากากตัวทำละลายถูกสร้างขึ้นโดยใช้ตัวกรองความถี่ต่ำ 15 Å เริ่มต้น การขยายแผนที่ 3 พิกเซล และหน้ากากแบบอ่อน 3 พิกเซล โดยใช้การปรับแต่ง CTF ต่ออนุภาค การแก้ไขการเคลื่อนไหวต่ออนุภาค และการปรับแต่ง CTF ต่ออนุภาครอบที่สอง การปรับแต่งแบบ 3 มิติ การสร้างหน้ากากตัวทำละลาย และการประมวลผลภายหลัง จะดำเนินการหลังจากแต่ละขั้นตอนเพื่อปรับปรุงพื้นผิวที่ได้ดียิ่งขึ้น โดยใช้ค่าตัด FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ที่ 0.143 ความละเอียดของแบบจำลองสุดท้ายของ RC-LH114-W และ RC-LH116 คือ 2.65 และ 2.80 Å ตามลำดับ เส้นโค้ง FSC ของแบบจำลองสุดท้ายแสดงในรูปที่ 2 S17
ลำดับโปรตีนทั้งหมดถูกดาวน์โหลดจาก UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3) SWISS-MODEL (45) ถูกใช้เพื่อสร้างแบบจำลองความเหมือนของ RC ซึ่งประกอบด้วยลำดับโปรตีนของ RC-L, RC-M และ RC-H และโครงสร้างผลึกของ Rba. sphaeroides RC ถูกใช้เป็นแม่แบบ (PDB ID: 5LSE) (46) ใช้เครื่องมือ “fit map” ใน UCSF Chimera เพื่อปรับโมเดลที่สร้างขึ้นให้เข้ากับแผนที่ (47) ปรับปรุงโครงสร้างโปรตีน และเพิ่มโคแฟคเตอร์ [4×BChl a (ชื่อสารตกค้างในไลบรารีโมโนเมอร์ = BCL), 2×BPh a (BPH), UQ10 (U10) หนึ่งหรือสองชนิด, เหล็กที่ไม่ใช่ฮีม (Fe) หนึ่งตัว และ 3,4-ไดไฮโดรเฮกซาคาร์บอนิลโคลีน (QAK) หนึ่งตัว] โดยใช้ Coot (48) เนื่องจาก QAK ไม่มีอยู่ในไลบรารีโมโนเมอร์ จึงกำหนดพารามิเตอร์โดยใช้เครื่องมือ eLBOW ใน PHENIX (49)
ต่อไปคือการสร้างซับยูนิต LH1 ในขั้นต้น ใช้เครื่องมือสร้างอัตโนมัติใน PHENIX (49) เพื่อสร้างลำดับ LH1 บางส่วนโดยอัตโนมัติโดยใช้แผนที่และลำดับโปรตีน LH1-α และ LH1-β เป็นข้อมูลป้อนเข้า เลือกซับยูนิต LH1 ที่สมบูรณ์ที่สุด แยกออกมาและโหลดลงใน Coot เพิ่มลำดับที่ขาดหายไปด้วยตนเอง และปรับแต่งโครงสร้างทั้งหมดด้วยตนเองก่อนที่จะเพิ่ม BCl สองตัว (BCL) และสไปริลลอกแซนทิน (CRT) [ตามความหนาแน่นของ Rps ที่เกี่ยวข้องของคอมเพล็กซ์ LH1 และปริมาณแคโรทีนอยด์ที่ทราบ สายพันธุ์ (17)] คัดลอกซับยูนิต LH1 ที่สมบูรณ์ และใช้ “เครื่องมือแผนที่การเชื่อมต่อ” ของ UCSF Chimera เพื่อเชื่อมต่อในพื้นที่ที่ไม่ใช่แบบจำลองที่อยู่ติดกันของความหนาแน่น LH1 จากนั้นปรับแต่งใน Coot ทำซ้ำกระบวนการจนกว่าซับยูนิต LH1 ทั้งหมดจะได้รับการสร้างแบบจำลอง สำหรับโครงสร้าง RC-LH114-W โดยการสกัดความหนาแน่นที่ไม่ได้จัดสรรใน Coot โปรตีนจะถูกแยกออกจากส่วนประกอบที่ไม่ใช่โปรตีนที่เหลืออยู่ในแผนที่ USCF Chimera และใช้เครื่องมือ Autobuild เพื่อสร้างแบบจำลองเริ่มต้น และการสร้างแบบจำลองหน่วยย่อยที่เหลือ (โปรตีน-W) ใน PHENIX (49) เพิ่มลำดับที่ขาดหายไปในแบบจำลองที่ได้ใน Coot (48) จากนั้นปรับแต่งหน่วยย่อยทั้งหมดด้วยตนเอง ความหนาแน่นที่ไม่ได้จัดสรรที่เหลืออยู่จะพอดีกับส่วนผสมของลิปิด (รหัสไลบรารีโมโนเมอร์ PDB ของ CDL = CDL, POPC = 6PL และ POPG = PGT) สารซักฟอก β-DDM (LMT) และโมเลกุล UQ10 (U10) ใช้การเพิ่มประสิทธิภาพ PHENIX (49) และการเพิ่มประสิทธิภาพด้วยตนเองใน Coot (48) เพื่อปรับปรุงแบบจำลองเริ่มต้นทั้งหมดให้สมบูรณ์แบบจนกว่าสถิติของแบบจำลองและคุณภาพการมองเห็นของความพอดีจะไม่สามารถปรับปรุงได้อีกต่อไป สุดท้าย ใช้ LocScale (50) เพื่อเพิ่มความคมชัดของแผนที่ท้องถิ่น จากนั้นดำเนินการสร้างแบบจำลองความหนาแน่นที่ไม่ได้จัดสรรและเพิ่มประสิทธิภาพอัตโนมัติและด้วยตนเองอีกหลายรอบ
เปปไทด์ โคแฟคเตอร์ และลิปิดและควิโนนอื่นๆ ที่จับคู่กับความหนาแน่นที่เกี่ยวข้องแสดงอยู่ในรูปที่ 1 และ 2 S18 ถึง S23 ข้อมูลทางสถิติของแบบจำลองสุดท้ายแสดงอยู่ในตาราง S1
หากไม่ได้ระบุไว้เป็นอย่างอื่น สเปกตรัมการดูดกลืนแสง UV/Vis/NIR จะถูกเก็บรวบรวมโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์ Cary60 (Agilent, สหรัฐอเมริกา) ที่ช่วงความยาวคลื่น 1 นาโนเมตร ตั้งแต่ 250 นาโนเมตร ถึง 1000 นาโนเมตร และเวลาในการรวมสัญญาณ 0.1 วินาที
เจือจางตัวอย่างในคิวเวตต์ควอตซ์ที่มีทางเดิน 2 มม. ถึง A880 เท่ากับ 1 และเก็บสเปกตรัมการดูดกลืนแสงระหว่าง 400 ถึง 1000 นาโนเมตร สเปกตรัมไดโครอิกแบบวงกลมถูกเก็บรวบรวมโดยใช้เครื่องสเปกโตรโพลาไรมิเตอร์ Jasco 810 (Jasco, ประเทศญี่ปุ่น) ที่ช่วงห่าง 1 นาโนเมตร ระหว่าง 400 นาโนเมตร และ 950 นาโนเมตร ที่อัตราการสแกน 20 นาโนเมตรต่อนาที
ค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงโมลาร์ถูกกำหนดโดยการเจือจางสารประกอบหลักให้มีค่า A880 ประมาณ 50 เจือจางปริมาตร 10 μl ในบัฟเฟอร์การจับหรือเมทานอล 990 μl และเก็บสเปกตรัมการดูดกลืนแสงทันทีเพื่อลดการเสื่อมสภาพของ BChl ให้น้อยที่สุด ปริมาณ BChl ในแต่ละตัวอย่างเมทานอลคำนวณจากค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงที่ 771 nm เท่ากับ 54.8 mM-1 cm-1 และกำหนดค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง (51) หารความเข้มข้นของ BChl ที่วัดได้ด้วย 32 (RC-LH114-W) หรือ 36 (RC-LH116) เพื่อกำหนดความเข้มข้นของสารประกอบหลัก จากนั้นใช้ค่านี้ในการกำหนดสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของตัวอย่างเดียวกันที่เก็บในบัฟเฟอร์ ค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง ทำการวัดซ้ำ 3 ครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง และใช้ค่าเฉลี่ยการดูดกลืนแสงของค่าสูงสุดของ BChl Qy ในการคำนวณ ค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของ RC-LH114-W ที่วัดได้ที่ 878 นาโนเมตร คือ 3280±140 mM-1 cm-1 ในขณะที่ค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงของ RC-LH116 ที่วัดได้ที่ 880 นาโนเมตร คือ 3800±30 mM-1 cm-1
UQ10 ถูกหาปริมาณตามวิธีการใน (52) โดยสรุปคือ ทำการ HPLC แบบย้อนกลับเฟส (RP-HPLC) โดยใช้ระบบ HPLC Agilent 1200 ละลาย RC-LH116 หรือ RC-LH114-W ประมาณ 0.02 nmol ในเมทานอล:คลอโรฟอร์ม 50:50 ปริมาณ 50 μl ที่มีเฟอร์ริกคลอไรด์ 0.02% (w/v) และฉีดสารละลาย Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm ที่ปรับสมดุลไว้ล่วงหน้าในอัตรา 1 ml-1 min-1 ที่อุณหภูมิ 40°C ในตัวทำละลาย HPLC (เมทานอล:2-โพรพานอล 80:20) บนคอลัมน์ขนาด ×25 ซม. ทำการชะแบบไอโซแครติกในตัวทำละลาย HPLC เพื่อตรวจสอบการดูดกลืนแสงที่ 275 nm (UQ10), 450 nm (แคโรทีนอยด์) และ 780 nm (BChl) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง พื้นที่ใต้กราฟโครมาโทแกรมที่ความยาวคลื่น 275 นาโนเมตร ณ เวลา 25.5 นาที ได้ทำการอินทิเกรต ซึ่งไม่พบสารประกอบอื่นใด พื้นที่ใต้กราฟที่ได้จะถูกนำมาใช้คำนวณปริมาณโมลของ UQ10 ที่สกัดได้ โดยอ้างอิงจากกราฟสอบเทียบที่คำนวณจากการฉีดสารมาตรฐานบริสุทธิ์ในปริมาณ 0 ถึง 5.8 นาโนโมล (รูปที่ S14) แต่ละตัวอย่างได้รับการวิเคราะห์ซ้ำ 3 ครั้ง และค่าความคลาดเคลื่อนที่รายงานนั้นสอดคล้องกับค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย
เตรียมสารละลายที่มีคอมเพล็กซ์ RC-LH1 ซึ่งมีค่าการดูดกลืนแสง Qy สูงสุด 0.1 โดยใช้ไซโตโครม c2 จากหัวใจม้าที่ลดลง 30 μM (Merck, UK) และ MUQ2 0 ถึง 50 μM (Merck, UK) เตรียมตัวอย่าง 1 มล. จำนวน 3 ตัวอย่างสำหรับแต่ละความเข้มข้นของ UQ2 และบ่มค้างคืนในที่มืดที่อุณหภูมิ 4°C เพื่อให้แน่ใจว่าปรับตัวเข้ากับความมืดอย่างสมบูรณ์ก่อนทำการวัด นำสารละลายใส่ลงในเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์แบบโมดูลาร์ OLIS RSM1000 ที่ติดตั้งตะแกรงเปลวไฟ 300 nm/เส้น 500 nm, ช่องทางเข้า 1.24 มม., ช่องตรงกลาง 0.12 มม. และช่องทางออก 0.6 มม. วางตัวกรองแบบผ่านยาว 600 nm ไว้ที่ทางเข้าของหลอดโฟโตมิเตอร์ตัวอย่างและหลอดโฟโตมัลติพลายเออร์อ้างอิงเพื่อกันแสงกระตุ้น ตรวจสอบการดูดกลืนแสงที่ 550 nm ด้วยเวลาการรวมแสง 0.15 วินาที แสงกระตุ้นถูกปล่อยออกมาจาก LED (ไดโอดเปล่งแสง) รุ่น M880F2 ขนาด 880 นาโนเมตร (Thorlabs Ltd., สหราชอาณาจักร) ผ่านสายเคเบิลใยแก้วนำแสงที่ความเข้ม 90% โดยใช้ตัวควบคุม DC2200 (Thorlabs Ltd., สหราชอาณาจักร) และถูกปล่อยออกมาที่แหล่งกำเนิดแสงในมุม 90° ลำแสงวัดจะสะท้อนกับกระจกเพื่อสะท้อนแสงที่ไม่ถูกดูดซับโดยตัวอย่างในตอนแรก ตรวจสอบค่าการดูดกลืนแสง 10 วินาทีก่อนการส่องสว่าง 50 วินาที จากนั้นจึงตรวจสอบค่าการดูดกลืนแสงต่อไปอีก 60 วินาทีในที่มืดเพื่อประเมินว่าควินอลอลลดไซโตโครม c23+ ได้เองมากน้อยเพียงใด (ดูรูป S8 สำหรับข้อมูลดิบ)
ข้อมูลถูกประมวลผลโดยการปรับอัตราเริ่มต้นเชิงเส้นภายใน 0.5 ถึง 10 วินาที (ขึ้นอยู่กับความเข้มข้นของ UQ2) และหาค่าเฉลี่ยของอัตราของตัวอย่างทั้งสามที่ความเข้มข้นของ UQ2 แต่ละระดับ ความเข้มข้นของ RC-LH1 ที่คำนวณได้จากค่าสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงที่เกี่ยวข้องถูกนำมาใช้ในการแปลงอัตราเป็นประสิทธิภาพการเร่งปฏิกิริยา นำไปพล็อตใน Origin Pro 2019 (OriginLab, สหรัฐอเมริกา) และปรับให้เข้ากับแบบจำลอง Michaelis-Menten เพื่อกำหนดค่า Km และ Kcat ที่ปรากฏ
สำหรับการวัดการดูดกลืนแสงแบบชั่วคราว ตัวอย่าง RC-LH1 ถูกเจือจางให้มีความเข้มข้นประมาณ 2 μM ในบัฟเฟอร์ IMAC ที่ประกอบด้วยโซเดียมแอสคอร์เบต 50 mM (Merck, USA) และเทอร์บูติน 0.4 mM (Merck, USA) กรดแอสคอร์บิกใช้เป็นตัวให้电子แบบเสียสละ และเทอร์ท-บูตาโคลเฟนใช้เป็นสารยับยั้ง QB เพื่อให้แน่ใจว่าตัวให้电子หลัก RC ยังคงอยู่ในสถานะรีดิวซ์ (กล่าวคือ ไม่ถูกออกซิไดซ์ด้วยแสง) ตลอดกระบวนการวัด เติมตัวอย่างประมาณ 3 มล. ลงในเซลล์หมุนแบบกำหนดเอง (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 0.1 ม. ความเร็ว 350 รอบต่อนาที) ที่มีความยาวเส้นทางแสง 2 มม. เพื่อให้แน่ใจว่าตัวอย่างในเส้นทางเลเซอร์มีเวลาเพียงพอสำหรับการปรับตัวในที่มืดระหว่างพัลส์การกระตุ้น ใช้พัลส์เลเซอร์ ~100 fs เพื่อขยายระบบเลเซอร์ Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) เพื่อกระตุ้นตัวอย่างที่ 880 nm ด้วยอัตราการทำซ้ำ 1 kHz (20 nJ สำหรับ NIR หรือ 100 nJ สำหรับ Vis) ก่อนเก็บข้อมูล ให้ฉายแสงกระตุ้นลงบนตัวอย่างประมาณ 30 นาที การฉายแสงจะทำให้ QA ไม่ทำงาน (อาจลด QA ลงหนึ่งหรือสองครั้ง) แต่โปรดทราบว่ากระบวนการนี้สามารถย้อนกลับได้ เพราะหลังจากระยะเวลาการปรับตัวในที่มืดเป็นเวลานาน RC จะค่อยๆ กลับมาทำงานในระดับ QA อีกครั้ง ใช้สเปกโทรเมตร Helios (Ultrafast Systems, USA) ในการวัดสเปกตรัมชั่วคราวด้วยเวลาหน่วง -10 ถึง 7000 ps ใช้ซอฟต์แวร์ Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) ในการแยกกลุ่มชุดข้อมูล จากนั้นรวมและปรับมาตรฐาน ใช้ซอฟต์แวร์ CarpetView (Light Conversion Ltd., ลิทัวเนีย) เพื่อใช้ชุดข้อมูลที่รวมกันแล้วในการสร้างสเปกตรัมเชิงอนุพันธ์ที่เกี่ยวข้องกับการสลายตัว หรือใช้ฟังก์ชันที่ทำการคอนโวลูชันเลขชี้กำลังหลายตัวกับผลตอบสนองของเครื่องมือเพื่อปรับให้เข้ากับการเปลี่ยนแปลงสเปกตรัมความยาวคลื่นเดียวใน Origin (OriginLab, สหรัฐอเมริกา)
ตามที่กล่าวไว้ข้างต้น (53) ฟิล์มสังเคราะห์แสงที่มีคอมเพล็กซ์ LH1 ที่ขาดทั้ง RC และเสาอากาศ LH2 รอบนอกถูกเตรียมขึ้น เมมเบรนถูกเจือจางใน tris 20 mM (pH 8.0) จากนั้นโหลดลงในคิวเวตต์ควอตซ์ที่มีทางเดินแสง 2 มม. ใช้พัลส์เลเซอร์ 30 nJ เพื่อกระตุ้นตัวอย่างที่ 540 nm ด้วยเวลาหน่วง -10 ถึง 7000 ps ประมวลผลชุดข้อมูลตามที่อธิบายไว้สำหรับตัวอย่าง Rps.pal
เมมเบรนถูกแยกตะกอนโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 150,000 RCF เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นจึงนำเมมเบรนที่วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 880 nm มาละลายใหม่ใน 20 mM tris-HCl (pH 8.0) และ 200 mM NaCl ละลายเมมเบรนโดยการคนอย่างช้าๆ ใน β-DDM 2% (w/v) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงในที่มืดที่อุณหภูมิ 4°C ตัวอย่างถูกเจือจางใน 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) จนมีความเข้มข้นของโปรตีน 2.5 mg ml-1 (การวิเคราะห์โดย Bio-Rad) การประมวลผลเพิ่มเติมดำเนินการตามวิธีการที่ตีพิมพ์ไว้ก่อนหน้านี้ (54) โดยเริ่มจากการเจือจางโปรตีน 50 μg ลงใน TEAB ปริมาตร 50 μl ที่มีโซเดียมลอเรต 1% (w/v) (Merck, UK) หลังจากทำการอัลตราโซนิคเป็นเวลา 60 วินาทีแล้ว นำไปรีดิวซ์ด้วย tris(2-carboxyethyl)phosphine ความเข้มข้น 5 mM (Merck, UK) ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที สำหรับการ S-alkylation ให้บ่มตัวอย่างด้วย methyl S-methylthiomethanesulfonate ความเข้มข้น 10 mM (Merck, UK) โดยเติมจากสารละลายสต็อก isopropanol ความเข้มข้น 200 mM เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ทำการย่อยโปรตีนโดยเติม trypsin/endoproteinase Lys-C mixture ความเข้มข้น 2 μg (Promega UK) และบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง สกัดสารลดแรงตึงผิว laurate โดยเติม ethyl acetate 50 μl และ trifluoroacetic acid (TFA) เกรด LC ความเข้มข้น 10% (v/v) ความเข้มข้น 10 μl (Thermo Fisher Scientific, UK) แล้วเขย่าด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 60 วินาที การแยกเฟสเกิดขึ้นโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 15,700 RCF เป็นเวลา 5 นาที ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต คอลัมน์ปั่น C18 (Thermo Fisher Scientific, สหราชอาณาจักร) ถูกนำมาใช้เพื่อดูดและกำจัดเกลือออกจากเฟสล่างที่มีเปปไทด์อย่างระมัดระวัง หลังจากทำให้แห้งโดยการปั่นเหวี่ยงสุญญากาศ ตัวอย่างถูกละลายใน 0.5% TFA และ 3% อะซีโตไนไตรล์ และนำตัวอย่าง 500 นาโนกรัมไปวิเคราะห์โดยโครมาโทกราฟีแบบนาโนโฟลว์ RP ร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรี โดยใช้พารามิเตอร์ของระบบที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
ใช้ MaxQuant v.1.5.3.30 (56) สำหรับการระบุและการหาปริมาณโปรตีนเพื่อค้นหาฐานข้อมูลโปรตีโอมของ Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) ข้อมูลโปรตีโอมิกส์จากการวิเคราะห์มวลสารได้ถูกฝากไว้ใน ProteomeXchange Alliance ผ่านทางคลังข้อมูลพันธมิตร PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ภายใต้รหัสชุดข้อมูล PXD020402
สำหรับการวิเคราะห์ด้วย RPLC ร่วมกับการตรวจวัดมวลสารด้วยการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสถิต คอมเพล็กซ์ RC-LH1 ถูกเตรียมจาก Rps ชนิดป่า โดยใช้วิธีการที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ (16) ความเข้มข้นของโปรตีนที่ผลิตในเซลล์ palustris คือ 2 มก. มล.-1 ใน 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl และ 0.03% (w/v) β- (การวิเคราะห์ Bio-Rad) DDM ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต ใช้ชุดอุปกรณ์การทำให้บริสุทธิ์แบบ 2D (GE Healthcare, สหรัฐอเมริกา) เพื่อสกัดโปรตีน 10 μg โดยวิธีการตกตะกอน และละลายตะกอนใน 20 μl ของกรดฟอร์มิก (FA) 60% (v/v), อะซีโตไนไตรล์ 20% (v/v) และน้ำ 20% (v/v) นำตัวอย่าง 5 ไมโครลิตร มาวิเคราะห์ด้วย RPLC (Dionex RSLC) ร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรี (Maxis UHR-TOF, Bruker) โดยใช้คอลัมน์ MabPac 1.2×100 มม. (Thermo Fisher Scientific, UK) สำหรับการแยกสารที่อุณหภูมิ 60°C และอัตราการไหล 100 μl/min โดยใช้กราเดียนต์ของตัวทำละลาย A 85% (v/v) [สารละลายในน้ำ 0.1% (v/v) FA และ 0.02% (v/v) TFA] ไปจนถึงตัวทำละลาย B 85% (v/v) [0.1% (v/v) FA และ 0.02% (v/v) ในอะซีโตไนไตรล์ TFA 90% (v/v)] โดยใช้แหล่งกำเนิดไอออนไนเซชันแบบอิเล็กโทรสเปรย์มาตรฐานและพารามิเตอร์เริ่มต้น เป็นเวลานานกว่า 60 นาที แมสสเปกโทรเมตรีจะให้ค่า m/z (อัตราส่วนมวลต่อประจุ) ตั้งแต่ 100 ถึง 2750 โดยใช้เครื่องมือ FindPept จากพอร์ทัลทรัพยากรชีวสารสนเทศ ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/) จับคู่สเปกตรัมมวลกับหน่วยย่อยของสารประกอบเชิงซ้อน
เซลล์ถูกเลี้ยงเป็นเวลา 72 ชั่วโมงภายใต้แสง NF-low (10μMm-2 s-1), medium (30μMm-2 s-1) หรือ high (300μMm-2 s-1) ปริมาณ 100 มล. ในอาหารเลี้ยงเซลล์ M22 (อาหารเลี้ยงเซลล์ M22 ที่ไม่มีแอมโมเนียมซัลเฟตและแทนที่โซเดียมซัคซิเนตด้วยโซเดียมอะซิเตต) ในขวดฝาเกลียวขนาด 100 มล. (23) ในแต่ละรอบ 30 วินาที จำนวน 5 รอบ ลูกปัดแก้วขนาด 0.1 ไมครอนถูกใส่ในอัตราส่วนปริมาตร 1:1 เพื่อสลายเซลล์และแช่เย็นบนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาที สารที่ไม่ละลาย เซลล์ที่ไม่แตก และลูกปัดแก้วถูกกำจัดออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 16,000 RCF เป็นเวลา 10 นาทีในเครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดเล็กแบบตั้งโต๊ะ เมมเบรนถูกแยกในโรเตอร์ Ti 70.1 ด้วยแรงเหวี่ยง 100,000 RCF ในสารละลาย tris-HCl 20 mM (pH 8.0) โดยใช้การไล่ระดับความเข้มข้นของซูโครส 40/15% (w/w) เป็นเวลา 10 ชั่วโมง
ตามที่อธิบายไว้ในงานก่อนหน้าของเรา การตรวจจับภูมิคุ้มกันของแท็ก His บน PufW (16) โดยสรุปคือ คอมเพล็กซ์แกนกลางที่บริสุทธิ์ (11.8 nM) หรือเมมเบรนที่มีความเข้มข้นของ RC เท่ากัน (กำหนดโดยการออกซิเดชันโดยการลบสเปกตรัมความแตกต่างที่ลดลงและจับคู่กับการโหลดบนเจลที่ย้อมสี) ในบัฟเฟอร์โหลด SDS 2x (Merck, UK) ที่เจือจางสองเท่า โปรตีนถูกแยกบนเจล NuPage bis-tris 12% แบบจำลอง (Thermo Fisher Scientific, UK) เจลถูกย้อมด้วย Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) เพื่อโหลดและมองเห็นซับยูนิต RC-L โปรตีนบนเจลที่สองถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) ที่กระตุ้นด้วยเมทานอล (Thermo Fisher Scientific, UK) สำหรับการตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน แผ่นเมมเบรน PVDF ถูกปิดกั้นด้วยสารละลาย 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v/v) Tween-20 และ 5% (w/v) นมผงพร่องมันเนย จากนั้นจึงนำไปบ่มกับแอนติบอดีหลักต่อต้าน His (ในบัฟเฟอร์แอนติบอดีเจือจาง [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl และ 0.05% (v/v) Tween-20] ในอัตราส่วน 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากล้างเมมเบรน 3 ครั้ง ครั้งละ 5 นาที ในบัฟเฟอร์แอนติบอดีแล้ว นำเมมเบรนไปผสมกับแอนติบอดีรองชนิดต่อต้านเมาส์ที่เติมเอนไซม์ฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (Sigma-Aldrich, สหราชอาณาจักร) (เจือจาง 1:10,000 ในบัฟเฟอร์แอนติบอดี) บ่มไว้เพื่อให้สามารถตรวจจับได้ (5 นาทีหลังจากล้าง 3 ครั้งในบัฟเฟอร์แอนติบอดี) โดยใช้สารตั้งต้นเคมีเรืองแสง WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, อิตาลี) และเครื่อง Amersham Imager 600 (GE Healthcare, สหราชอาณาจักร)
โดยการวาดการกระจายความเข้มของเจลที่ย้อมสีแต่ละอันหรือเลนอิมมูโนแอสเซย์ รวมพื้นที่ใต้จุดสูงสุดและคำนวณอัตราส่วนความเข้มของ RC-L (เจลที่ย้อมสี) และ Protein-W (อิมมูโนแอสเซย์) ใน ImageJ (57) ประมวลผลภาพ อัตราส่วนเหล่านี้ถูกแปลงเป็นอัตราส่วนโมลาร์โดยสมมติว่าอัตราส่วนของ RC-L ต่อ Protein-W ในตัวอย่าง RC-LH114-W บริสุทธิ์คือ 1:1 และปรับค่าชุดข้อมูลทั้งหมดให้เป็นมาตรฐานตามนั้น
สำหรับเอกสารประกอบเพิ่มเติมของบทความนี้ โปรดดูที่ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
บทความนี้เป็นบทความที่เปิดให้เข้าถึงได้โดยเสรี ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution License อนุญาตให้ใช้งาน แจกจ่าย และทำสำเนาซ้ำในสื่อใดๆ ก็ได้โดยไม่จำกัด โดยมีเงื่อนไขว่าต้องอ้างอิงแหล่งที่มาของงานต้นฉบับอย่างถูกต้อง
หมายเหตุ: เราขอให้คุณระบุที่อยู่อีเมลของคุณก็เพื่อให้ผู้ที่คุณแนะนำไปยังเพจทราบว่าคุณต้องการให้พวกเขาเห็นอีเมลนั้นและไม่ใช่สแปม เราจะไม่เก็บรวบรวมที่อยู่อีเมลใดๆ ทั้งสิ้น
คำถามนี้ใช้เพื่อทดสอบว่าคุณเป็นผู้เยี่ยมชมหรือไม่ และเพื่อป้องกันการส่งสแปมโดยอัตโนมัติ
เดวิด เจ.เค. สเวนส์เบอรี, พาร์ค เฉียน, ฟิลิป เจ. แจ็กสัน, เคทลิน เอ็ม. ฟารีส์, ดาริอุส เอ็ม. นีดซ์เวียดซกี, เอลิซาเบธ ซี. มาร์ติน, เดวิด เอ. ฟาร์มเมอร์, ลอร์นา เอ. มาโลน, รีเบคกา เอฟ. ทอมป์สัน, นีล เอ. แรนสัน, แดเนียล พี. แคนนิฟฟ์, มาร์ค เจ. ดิกแมน, ดิวอี้ โฮลเทน, คริสติน เคอร์ไมเออร์, แอนดรูว์ ฮิตช์ค็อก, ซี. นีล ฮันเตอร์
โครงสร้างความละเอียดสูงของสารเชิงซ้อนดักจับแสง 1 ในศูนย์กลางปฏิกิริยาให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับพลวัตของควิโนน
เดวิด เจ.เค. สเวนส์เบอรี, พาร์ค เฉียน, ฟิลิป เจ. แจ็กสัน, เคทลิน เอ็ม. ฟารีส์, ดาริอุส เอ็ม. นีดซ์เวียดซกี, เอลิซาเบธ ซี. มาร์ติน, เดวิด เอ. ฟาร์มเมอร์, ลอร์นา เอ. มาโลน, รีเบคกา เอฟ. ทอมป์สัน, นีล เอ. แรนสัน, แดเนียล พี. แคนนิฟฟ์, มาร์ค เจ. ดิกแมน, ดิวอี้ โฮลเทน, คริสติน เคอร์ไมเออร์, แอนดรูว์ ฮิตช์ค็อก, ซี. นีล ฮันเตอร์
โครงสร้างความละเอียดสูงของสารเชิงซ้อนดักจับแสง 1 ในศูนย์กลางปฏิกิริยาให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับพลวัตของควิโนน
©2021 สมาคมอเมริกันเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ สงวนลิขสิทธิ์. AAAS เป็นหุ้นส่วนของ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef และ COUNTER วิทยาศาสตร์ก้าวหน้า ISSN 2375-2548