ที่อยู่ปัจจุบัน: โคโลญจน์ 50931 ประเทศเยอรมนี ศูนย์วิจัยความเป็นเลิศด้านการวิจัยเกี่ยวกับการตอบสนองต่อความเครียดของเซลล์ในโรคที่เกี่ยวข้องกับความชรา (CECAD)
ภาวะความเสื่อมของระบบประสาทจากโรคไมโทคอนเดรียถือว่าไม่สามารถย้อนกลับได้ เนื่องจากความสามารถในการปรับตัวทางเมตาบอลิซึมของเซลล์ประสาทมีจำกัด แต่ผลกระทบของความผิดปกติของไมโทคอนเดรียต่อความเป็นอิสระของเซลล์ในการเผาผลาญพลังงานในร่างกายยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ในที่นี้ เราได้นำเสนอโปรตีโอมเฉพาะเซลล์ของเซลล์ประสาท Purkinje ที่มีภาวะขาด OXPHOS อย่างต่อเนื่อง ซึ่งเกิดจากความผิดปกติของกลไกการรวมตัวของไมโทคอนเดรีย เราพบว่าความผิดปกติของไมโทคอนเดรียกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างลึกซึ้งในด้านโปรตีโอมิกส์ ซึ่งในที่สุดนำไปสู่การกระตุ้นโปรแกรมการเผาผลาญที่แม่นยำอย่างต่อเนื่องก่อนที่เซลล์จะตาย ที่น่าประหลาดใจคือ เราพบการเหนี่ยวนำที่ชัดเจนของเอนไซม์ไพรูเวทคาร์บอกซิเลส (PCx) และเอนไซม์ต้านริ้วรอยอื่นๆ ที่เสริมสารตัวกลางของวัฏจักร TCA การยับยั้ง PCx ทำให้ความเครียดจากออกซิเดชันและความเสื่อมของระบบประสาทรุนแรงขึ้น แสดงให้เห็นว่าภาวะหลอดเลือดแดงแข็งมีผลป้องกันในเซลล์ประสาทที่ขาด OXPHOS การฟื้นฟูการรวมตัวของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาทที่เสื่อมสภาพอย่างสมบูรณ์จะย้อนกลับลักษณะทางเมตาบอลิซึมเหล่านี้ได้อย่างสมบูรณ์ จึงช่วยป้องกันการตายของเซลล์ได้ ผลการศึกษาของเราได้ระบุถึงกลไกที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน ซึ่งช่วยให้เซลล์มีความยืดหยุ่นต่อความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย และแสดงให้เห็นว่าการเสื่อมของระบบประสาทสามารถย้อนกลับได้แม้ในระยะสุดท้ายของโรค
บทบาทสำคัญของไมโทคอนเดรียในการรักษาสมดุลพลังงานของเซลล์ประสาทได้รับการเน้นย้ำจากอาการทางระบบประสาทมากมายที่เกี่ยวข้องกับโรคไมโทคอนเดรียในมนุษย์ โรคเหล่านี้ส่วนใหญ่เกิดจากการกลายพันธุ์ของยีนที่ควบคุมการแสดงออกของยีนไมโทคอนเดรีย (1, 2) หรือการทำลายยีนที่เกี่ยวข้องกับพลวัตของไมโทคอนเดรีย ซึ่งส่งผลกระทบทางอ้อมต่อความเสถียรของดีเอ็นเอไมโทคอนเดรีย (mtDNA) (3, 4) งานวิจัยในแบบจำลองสัตว์แสดงให้เห็นว่า ในการตอบสนองต่อความผิดปกติของไมโทคอนเดรียในเนื้อเยื่อโดยรอบ วิถีการเผาผลาญแบบอนุรักษ์ (5-7) สามารถถูกกระตุ้นได้ ซึ่งให้ข้อมูลสำคัญสำหรับการทำความเข้าใจอย่างลึกซึ้งเกี่ยวกับพยาธิกำเนิดของโรคที่ซับซ้อนเหล่านี้ ในทางตรงกันข้าม ความเข้าใจของเราเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญของเซลล์ชนิดเฉพาะที่เกิดจากความล้มเหลวโดยทั่วไปของการผลิตอะดีโนซีนไตรฟอสเฟต (ATP) ของไมโทคอนเดรียในสมองนั้นมีความสำคัญอย่างยิ่ง (8) ซึ่งเน้นย้ำถึงความจำเป็นในการระบุเป้าหมายการรักษาที่สามารถใช้เพื่อป้องกันหรือยับยั้งการเสื่อมของเซลล์ประสาท (9) การขาดข้อมูลเกิดจากข้อเท็จจริงที่ว่าเซลล์ประสาทนั้นโดยทั่วไปถือว่ามีความยืดหยุ่นในการเผาผลาญที่จำกัดมากเมื่อเทียบกับเซลล์ประเภทอื่นในเนื้อเยื่อรอบข้าง (10) เนื่องจากเซลล์เหล่านี้มีบทบาทสำคัญในการประสานงานการจัดหาสารเมตาบอไลต์ให้กับเซลล์ประสาทเพื่อส่งเสริมการส่งสัญญาณประสาทและตอบสนองต่อการบาดเจ็บและสภาวะของโรค ความสามารถในการปรับการเผาผลาญของเซลล์ให้เข้ากับสภาวะที่ท้าทายของเนื้อเยื่อสมองจึงแทบจะจำกัดอยู่เฉพาะเซลล์เกลียเท่านั้น (11-14) นอกจากนี้ ความหลากหลายของเซลล์ในเนื้อเยื่อสมองยังขัดขวางการศึกษาการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญที่เกิดขึ้นในกลุ่มย่อยของเซลล์ประสาทโดยเฉพาะ ส่งผลให้ยังไม่ค่อยมีใครทราบถึงผลกระทบทางเซลล์และการเผาผลาญที่แน่นอนของการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาท
เพื่อทำความเข้าใจผลกระทบทางเมตาบอลิซึมของการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรีย เราได้แยกเซลล์ประสาท Purkinje (PNs) ในระยะต่างๆ ของการเสื่อมของระบบประสาทที่เกิดจากการทำลายการหลอมรวมของเยื่อหุ้มชั้นนอกของไมโทคอนเดรีย (Mfn2) แม้ว่าการกลายพันธุ์ของ Mfn2 ในมนุษย์จะเกี่ยวข้องกับโรคทางระบบประสาทสั่งการและรับความรู้สึกทางพันธุกรรมชนิดหนึ่งที่เรียกว่า Charcot-Marie-Tooth ชนิด 2A (15) แต่การทำลาย Mfn2 แบบมีเงื่อนไขในหนูเป็นวิธีการเหนี่ยวนำการทำงานผิดปกติของออกซิเดชั่นฟอสโฟรีเลชั่น (OXPHOS) ที่ได้รับการยอมรับอย่างดี เซลล์ประสาทชนิดต่างๆ (16-19) และฟีโนไทป์ของการเสื่อมของระบบประสาทที่เกิดขึ้นนั้นมาพร้อมกับอาการทางระบบประสาทที่ก้าวหน้า เช่น ความผิดปกติของการเคลื่อนไหว (18, 19) หรือภาวะสมองน้อยทำงานผิดปกติ (16) ด้วยการใช้การผสมผสานระหว่างโปรตีโอมิกส์เชิงปริมาณแบบไม่ใช้ฉลาก (LFQ) เมตาโบโลมิกส์ การถ่ายภาพ และวิธีการทางไวรัสวิทยา เราแสดงให้เห็นว่าการเสื่อมของระบบประสาทที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องกระตุ้นการแสดงออกของเอนไซม์ไพรูเวทคาร์บอกซิเลส (PCx) และปัจจัยอื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับภาวะหลอดเลือดแดงแข็งในเซลล์ประสาทส่วนปลาย (PN) ในร่างกายอย่างรุนแรง เพื่อตรวจสอบความเกี่ยวข้องของผลการค้นพบนี้ เราได้ทำการลดการแสดงออกของ PCx ในเซลล์ประสาทส่วนปลายที่ขาด Mfn2 โดยเฉพาะ และพบว่าการกระทำนี้ทำให้ความเครียดออกซิเดชันรุนแรงขึ้นและเร่งการเสื่อมของระบบประสาท ซึ่งพิสูจน์ได้ว่าภาวะไม่มีอสุจิทำให้เกิดความสามารถในการปรับตัวทางเมตาบอลิซึมที่นำไปสู่การตายของเซลล์ การแสดงออกของ MFN2 อย่างรุนแรงสามารถช่วยฟื้นฟูเซลล์ประสาทส่วนปลายที่เสื่อมอย่างรุนแรงซึ่งมีภาวะขาด OXPHOS อย่างรุนแรง การบริโภค DNA ของไมโทคอนเดรียจำนวนมาก และเครือข่ายไมโทคอนเดรียที่แตกหักอย่างเห็นได้ชัด ซึ่งเน้นย้ำเพิ่มเติมว่าการเสื่อมของระบบประสาทในรูปแบบนี้สามารถฟื้นตัวได้แม้ในระยะขั้นสูงของโรคก่อนที่เซลล์จะตาย
เพื่อให้เห็นภาพไมโตคอนเดรียใน PN ที่มีการตัดยีน Mfn2 ออก เราใช้หนูสายพันธุ์ที่อนุญาตให้ไมโตคอนเดรียที่ขึ้นอยู่กับ Cre กำหนดเป้าหมายโปรตีนเรืองแสงสีเหลือง (YFP) (mtYFP) (20) การแสดงออกของ Cre และตรวจสอบสัณฐานวิทยาของไมโตคอนเดรียในร่างกาย เราพบว่าการทำลายยีน Mfn2 ใน PN จะนำไปสู่การแบ่งตัวของเครือข่ายไมโตคอนเดรียอย่างค่อยเป็นค่อยไป (รูปที่ S1A) และการเปลี่ยนแปลงที่เร็วที่สุดพบเมื่ออายุ 3 สัปดาห์ ในทางตรงกันข้าม การเสื่อมสภาพอย่างมากของชั้นเซลล์ PN ดังที่เห็นได้จากการสูญเสียการย้อมสีภูมิคุ้มกันของ Calbindin ไม่ได้เริ่มต้นจนกระทั่งอายุ 12 สัปดาห์ (รูปที่ 1, A และ B) ความไม่ตรงกันของเวลาระหว่างการเปลี่ยนแปลงที่เร็วที่สุดในสัณฐานวิทยาของไมโตคอนเดรียและการเริ่มปรากฏให้เห็นของการตายของเซลล์ประสาทกระตุ้นให้เราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากความผิดปกติของไมโตคอนเดรียก่อนการตายของเซลล์ เราได้พัฒนาวิธีการคัดแยกเซลล์ด้วยแสงฟลูออเรสเซนต์ (FACS) เพื่อแยกเซลล์ประสาทที่แสดงออก YFP (YFP+) (รูปที่ 1C) และในหนูควบคุม (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ซึ่งต่อไปนี้จะเรียกว่า CTRL (รูปที่ S1B) การปรับกลยุทธ์การคัดกรองให้เหมาะสมโดยพิจารณาจากความเข้มสัมพัทธ์ของสัญญาณ YFP ทำให้เราสามารถแยกส่วน YFP+ (YFPhigh) ของเซลล์ประสาทออกจากเซลล์ที่ไม่แสดงออก YFP (YFPneg) (รูปที่ S1B) หรือชิ้นส่วนแอกซอน/เดนไดรต์เรืองแสงที่คาดการณ์ไว้ (YFPlow; รูปที่ S1D ด้านซ้าย) ซึ่งได้รับการยืนยันโดยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล (รูปที่ S1D ด้านขวา) เพื่อตรวจสอบเอกลักษณ์ของประชากรที่จำแนก เราได้ทำการวิเคราะห์โปรตีนด้วย LFQ จากนั้นจึงทำการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก และพบว่ามีการแยกที่ชัดเจนระหว่างเซลล์ YFPhigh และ YFPneg (รูปที่ S1C) เซลล์ YFPhigh แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นสุทธิของเครื่องหมาย PN ที่รู้จัก (เช่น Calb1, Pcp2, Grid2 และ Itpr3) (21, 22) แต่ไม่มีการเพิ่มขึ้นของโปรตีนที่แสดงออกทั่วไปในเซลล์ประสาทหรือเซลล์ประเภทอื่น (รูปที่ 1D) การเปรียบเทียบระหว่างตัวอย่างในเซลล์ YFPhigh ที่จำแนกประเภทซึ่งรวบรวมในการทดลองอิสระแสดงให้เห็นค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ > 0.9 ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีระหว่างตัวอย่างทางชีววิทยา (รูปที่ S1E) โดยสรุป ข้อมูลเหล่านี้ยืนยันแผนของเราสำหรับการแยก PN ที่เป็นไปได้แบบเฉียบพลันและเฉพาะเจาะจง เนื่องจากระบบขับเคลื่อน L7-cre ที่ใช้กระตุ้นการรวมตัวแบบโมเสกในสัปดาห์แรกหลังคลอด (23) เราจึงเริ่มคัดแยกหนูจาก CTRL และแบบมีเงื่อนไข (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) เพื่อรวบรวมเซลล์ประสาท หลังจากการรวมตัวเสร็จสมบูรณ์ จะเรียกว่า Mfn2cKO เมื่ออายุ 4 สัปดาห์ เราเลือกอายุ 8 สัปดาห์เป็นจุดสิ้นสุดเมื่อชั้น PN ยังคงสมบูรณ์แม้จะมีการแตกตัวของไมโทคอนเดรียอย่างเห็นได้ชัด (รูปที่ 1B และรูปที่ S1A) โดยรวมแล้ว เราวัดปริมาณโปรตีนทั้งหมด 3013 ชนิด ซึ่งประมาณ 22% มาจากคำอธิบายประกอบ MitoCarta 2.0 โดยอิงจากโปรตีโอมของไมโทคอนเดรียเป็นไมโทคอนเดรีย (รูปที่ 1E) (รูปที่ 1E) (24) การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันที่ดำเนินการในสัปดาห์ที่ 8 แสดงให้เห็นว่ามีเพียง 10.5% ของโปรตีนทั้งหมดที่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1F และรูปที่ S1F) ซึ่งโปรตีน 195 ชนิดมีการลดลง และโปรตีน 120 ชนิดมีการเพิ่มขึ้น (รูปที่ 1F) เป็นที่น่าสังเกตว่า “การวิเคราะห์เส้นทางนวัตกรรม” ของชุดข้อมูลนี้แสดงให้เห็นว่ายีนที่แสดงออกแตกต่างกันส่วนใหญ่เป็นของชุดเส้นทางการเผาผลาญเฉพาะที่จำกัด (รูปที่ 1G) ที่น่าสนใจคือ แม้ว่าการลดระดับของวิถีการทำงานที่เกี่ยวข้องกับ OXPHOS และการส่งสัญญาณแคลเซียมจะยืนยันการเหนี่ยวนำให้เกิดความผิดปกติของไมโทคอนเดรียใน PN ที่ขาดการหลอมรวม แต่หมวดหมู่อื่นๆ ที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญกรดอะมิโนเป็นหลักกลับมีการเพิ่มระดับขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับการเผาผลาญที่เกิดขึ้นใน PN ที่มีความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย การปรับโครงสร้างใหม่มีความสอดคล้องกัน
(A) ภาพถ่ายคอนโฟคอลที่เป็นตัวแทนของส่วนตัดสมองน้อยของหนู CTRL และ Mfn2cKO ที่แสดงให้เห็นการสูญเสียเซลล์ Purkinje (calbindin, สีเทา) อย่างต่อเนื่อง โดยนิวเคลียสถูกย้อมด้วย DAPI (B) การหาปริมาณของ (A) (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว, ***P<0.001; n = 4 ถึง 6 วงกลมจากหนูสามตัว) (C) ขั้นตอนการทดลอง (D) แผนที่ความร้อนแสดงการกระจายของเครื่องหมายเฉพาะสำหรับเซลล์ Purkinje (ด้านบน) และเซลล์ชนิดอื่น ๆ (ตรงกลาง) (E) แผนภาพเวนน์แสดงจำนวนโปรตีนไมโทคอนเดรียที่ระบุในเซลล์ Purkinje ที่จัดประเภทแล้ว (F) แผนภาพภูเขาไฟแสดงโปรตีนที่แสดงออกแตกต่างกันในเซลล์ประสาท Mfn2cKO ที่อายุ 8 สัปดาห์ (ค่าตัดความสำคัญที่ 1.3) (G) การวิเคราะห์เส้นทางความคิดสร้างสรรค์แสดงให้เห็นเส้นทางการควบคุมขึ้น (สีแดง) และการควบคุมลง (สีน้ำเงิน) ที่สำคัญที่สุดห้าเส้นทางในเซลล์ Purkinje ของหนู Mfn2cKO ที่จัดประเภทแล้วที่อายุ 8 สัปดาห์ แสดงระดับการแสดงออกเฉลี่ยของโปรตีนแต่ละชนิดที่ตรวจพบ แผนภูมิความร้อนแบบขาวดำ: ค่า P ที่ปรับแล้ว ns, ไม่มีนัยสำคัญ
ข้อมูลโปรตีโอมิกส์แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของโปรตีนของคอมเพล็กซ์ I, III และ IV ลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไป คอมเพล็กซ์ I, III และ IV ทั้งหมดประกอบด้วยซับยูนิตที่เข้ารหัสโดย mtDNA ที่จำเป็น ในขณะที่คอมเพล็กซ์ II ซึ่งเข้ารหัสโดยนิวเคลียสเท่านั้น แทบจะไม่ได้รับผลกระทบ (รูปที่ 2A และรูปที่ S2A) สอดคล้องกับผลลัพธ์ของโปรตีโอมิกส์ การตรวจทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของเนื้อเยื่อสมองส่วนซีรีเบลลัมแสดงให้เห็นว่าระดับซับยูนิต MTCO1 (mitochondrial cytochrome C oxidase subunit 1) ของคอมเพล็กซ์ IV ใน PN ลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไป (รูปที่ 2B) ซับยูนิต Mtatp8 ที่เข้ารหัสโดย mtDNA ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ S2A) ในขณะที่ระดับคงที่ของซับยูนิต ATP synthase ที่เข้ารหัสโดยนิวเคลียสยังคงไม่เปลี่ยนแปลง ซึ่งสอดคล้องกับคอมเพล็กซ์ F1 ของการประกอบย่อย ATP synthase ที่เสถียรซึ่งเป็นที่รู้จักเมื่อการแสดงออกของ mtDNA มีเสถียรภาพ การก่อตัวมีความสอดคล้องกัน (7) การประเมินระดับ mtDNA ในเซลล์ประสาท Mfn2cKO ที่คัดแยกแล้วโดยใช้ปฏิกิริยาโพลีเมอเรสลูกโซ่แบบเรียลไทม์ (qPCR) ยืนยันว่าจำนวนสำเนา mtDNA ลดลงอย่างค่อยเป็นค่อยไป เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ในอายุ 8 สัปดาห์ พบว่าระดับ mtDNA เหลืออยู่เพียงประมาณ 20% เท่านั้น (รูปที่ 2C) สอดคล้องกับผลลัพธ์เหล่านี้ การย้อมสีด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของเซลล์ประสาท Mfn2cKO แสดงให้เห็นถึงการบริโภคนิวคลีโอไทด์ของไมโทคอนเดรียที่ขึ้นอยู่กับเวลา (รูปที่ 2D) เราพบว่ามีเพียงบางยีนที่เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายโปรตีนในไมโทคอนเดรียและการตอบสนองต่อความเครียดเท่านั้นที่มีการเพิ่มระดับขึ้น ได้แก่ Lonp1, Afg3l2 และ Clpx รวมถึงปัจจัยการประกอบคอมเพล็กซ์ OXPHOS ไม่พบการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในระดับของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับอะพอพโทซิส (รูปที่ S2B) ในทำนองเดียวกัน เราพบว่าไมโทคอนเดรียและช่องทางเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมที่เกี่ยวข้องกับการขนส่งแคลเซียมมีการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อย (รูปที่ S2C) นอกจากนี้ การประเมินโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับออโตฟาจีไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับการเหนี่ยวนำของออโตฟาโกโซมที่มองเห็นได้ซึ่งสังเกตได้ในร่างกายโดยวิธีอิมมูโนฮิสโตเคมีและกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอน (รูปที่ S3) อย่างไรก็ตาม การทำงานผิดปกติของ OXPHOS ที่เกิดขึ้นอย่างต่อเนื่องใน PN นั้นมาพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างระดับจุลภาคของไมโทคอนเดรียที่ชัดเจน สามารถมองเห็นกลุ่มไมโทคอนเดรียได้ในตัวเซลล์และกิ่งก้านของเซลล์ประสาท Mfn2cKO PN ที่มีอายุ 5 และ 8 สัปดาห์ และโครงสร้างเยื่อหุ้มชั้นในมีการเปลี่ยนแปลงอย่างมาก (รูปที่ S4, A และ B) สอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างระดับจุลภาคเหล่านี้และการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของ mtDNA การวิเคราะห์ชิ้นส่วนสมองส่วนซีรีเบลลัมแบบเฉียบพลันด้วยเทตราเมทิลโรดามีนเมทิลเอสเทอร์ (TMRM) แสดงให้เห็นว่าศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียใน Mfn2cKO PN ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ S4C)
(A) การวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงระดับการแสดงออกของคอมเพล็กซ์ OXPHOS ตามช่วงเวลา พิจารณาเฉพาะโปรตีนที่มีค่า P<0.05 ที่ 8 สัปดาห์ (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง) เส้นประ: ไม่มีการปรับเทียบกับกลุ่มควบคุม (CTRL) (B) ซ้าย: ตัวอย่างส่วนของสมองน้อยที่ติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อ MTCO1 (แถบมาตราส่วน 20 μm) บริเวณที่เซลล์ Purkinje ครอบครองถูกปกคลุมด้วยสีเหลือง ขวา: การหาปริมาณระดับ MTCO1 (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว; n = 7 ถึง 20 เซลล์ที่วิเคราะห์จากหนูสามตัว) (C) การวิเคราะห์ qPCR ของจำนวนสำเนา mtDNA ใน PN ที่แยกแล้ว (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว; n = 3 ถึง 7 ตัว) (D) ซ้าย: ตัวอย่างชิ้นส่วนของสมองน้อยที่ติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อ DNA (แถบมาตราส่วน 20 μm) บริเวณที่เซลล์ Purkinje ครอบครองถูกปกคลุมด้วยสีเหลือง ขวา: การหาปริมาณความเสียหายของ mtDNA (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว; n = 5 ถึง 9 เซลล์จากหนู 3 ตัว) (E) ตัวอย่างส่วนตัดของสมองน้อยแบบเฉียบพลันที่แสดงเซลล์ Purkinje ที่มี mitoYFP + (ลูกศร) ในการบันทึกแบบ patch clamp ของเซลล์ทั้งหมด (F) การหาปริมาณเส้นโค้ง IV (G) การบันทึกตัวอย่างของการฉีดกระแสไฟฟ้าแบบ depolarizing ในเซลล์ Purkinje ของกลุ่มควบคุม (CTRL) และกลุ่ม Mfn2cKO เส้นบน: พัลส์แรกที่กระตุ้น AP เส้นล่าง: ความถี่ AP สูงสุด (H) การหาปริมาณอินพุตแบบ sPSPs หลังไซแนปส์ เส้นบันทึกตัวอย่างและอัตราส่วนการซูมแสดงใน (I) การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียววิเคราะห์ n = 5 ถึง 20 เซลล์จากหนู 3 ตัว ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (J) ภาพแสดงร่องรอยของศักย์ไฟฟ้าแอ็กชัน (AP) ที่เกิดขึ้นเองโดยธรรมชาติ ซึ่งบันทึกโดยใช้โหมดการจับยึดแบบแพทช์ที่มีรูพรุน ร่องรอยด้านบน: ความถี่ AP สูงสุด ร่องรอยด้านล่าง: ภาพขยายของ AP เดี่ยว (K) หาปริมาณความถี่ AP เฉลี่ยและสูงสุดตาม (J) ทดสอบด้วยวิธี Mann-Whitney; วิเคราะห์เซลล์ n = 5 เซลล์จากหนู 4 ตัว ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM); ไม่สำคัญ
ตรวจพบความเสียหายของ OXPHOS อย่างชัดเจนในเซลล์ประสาท Mfn2cKO อายุ 8 สัปดาห์ ซึ่งบ่งชี้ว่าการทำงานทางสรีรวิทยาของเซลล์ประสาทมีความผิดปกติอย่างรุนแรง ดังนั้น เราจึงวิเคราะห์ลักษณะทางไฟฟ้าแบบพาสซีฟของเซลล์ประสาทที่ขาด OXPHOS ในช่วงอายุ 4-5 สัปดาห์ และ 7-8 สัปดาห์ โดยทำการบันทึกแบบ whole-cell patch clamp ในชิ้นส่วนสมองน้อยแบบเฉียบพลัน (รูปที่ 2E) โดยไม่คาดคิด ค่าเฉลี่ยศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพักและค่าความต้านทานอินพุตของเซลล์ประสาท Mfn2cKO นั้นคล้ายกับกลุ่มควบคุม แม้ว่าจะมีความแตกต่างเล็กน้อยระหว่างเซลล์ (ตารางที่ 1) ในทำนองเดียวกัน ในช่วงอายุ 4-5 สัปดาห์ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในความสัมพันธ์ระหว่างกระแสไฟฟ้าและแรงดันไฟฟ้า (IV curve) (รูปที่ 2F) อย่างไรก็ตาม เซลล์ประสาท Mfn2cKO อายุ 7-8 สัปดาห์ ไม่รอดจากกระบวนการ IV (ขั้นตอนไฮเปอร์โพลาไรเซชัน) ซึ่งบ่งชี้ว่ามีความไวต่อศักย์ไฮเปอร์โพลาไรเซชันอย่างชัดเจนในระยะหลังนี้ ในทางตรงกันข้าม ในเซลล์ประสาท Mfn2cKO กระแสดีโพลาไรซ์ที่ทำให้เกิดการปล่อยศักย์ไฟฟ้าแอคชั่น (AP) ซ้ำๆ นั้นสามารถทนได้ดี แสดงให้เห็นว่ารูปแบบการปล่อยศักย์ไฟฟ้าโดยรวมของพวกมันไม่แตกต่างอย่างมีนัยสำคัญจากเซลล์ประสาทควบคุมอายุ 8 สัปดาห์ (ตารางที่ 1 และรูปที่ 2G) ในทำนองเดียวกัน ความถี่และแอมพลิจูดของกระแสโพสต์ไซแนปส์ที่เกิดขึ้นเอง (sPSCs) เทียบได้กับกลุ่มควบคุม และความถี่ของเหตุการณ์เพิ่มขึ้นจาก 4 สัปดาห์เป็น 5 สัปดาห์เป็น 7 สัปดาห์เป็น 8 สัปดาห์ด้วยการเพิ่มขึ้นที่คล้ายกัน (รูปที่ 2, H และ I) ระยะเวลาของการเจริญเติบโตของไซแนปส์ใน PNs (25) ได้ผลลัพธ์ที่คล้ายกันหลังจากแพทช์ PNs ที่เจาะรู การกำหนดค่านี้ป้องกันการชดเชยที่เป็นไปได้ของข้อบกพร่องของ ATP ในเซลล์ ซึ่งอาจเกิดขึ้นในการบันทึกแพทช์แคลมป์แบบเซลล์ทั้งหมด โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ศักย์เยื่อหุ้มเซลล์ขณะพักและความถี่การยิงที่เกิดขึ้นเองของเซลล์ประสาท Mfn2cKO ไม่ได้รับผลกระทบ (รูปที่ 2, J และ K) โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าเซลล์ประสาท PN ที่มีความผิดปกติของ OXPHOS อย่างชัดเจนสามารถรับมือกับรูปแบบการปล่อยกระแสไฟฟ้าความถี่สูงได้ดี ซึ่งแสดงให้เห็นว่ามีกลไกการชดเชยที่ช่วยให้เซลล์เหล่านี้สามารถรักษาการตอบสนองทางไฟฟ้าสรีรวิทยาให้ใกล้เคียงปกติได้
ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว การทดสอบเปรียบเทียบหลายกลุ่มของ Holm-Sidak; *P<0.05) หมายเลขหน่วยระบุด้วยวงเล็บ
เราตั้งเป้าที่จะตรวจสอบว่าหมวดหมู่ใดในชุดข้อมูลโปรตีโอมิกส์ (รูปที่ 1G) มีวิถีที่สามารถต่อต้านการขาด OXPHOS อย่างรุนแรงหรือไม่ ซึ่งอธิบายได้ว่าทำไม PN ที่ได้รับผลกระทบจึงสามารถรักษาการทำงานทางไฟฟ้าได้ใกล้เคียงปกติ (รูปที่ 2, E ถึง K) การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์แสดงให้เห็นว่าเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับการสลายกรดอะมิโนสายโซ่กิ่ง (BCAA) มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3A และรูปที่ S5A) และผลิตภัณฑ์สุดท้ายคืออะเซทิล-โคเอ (CoA) หรือซัคซินิลโคเอสามารถเสริมไตรคาร์บอกซิเลตในวัฏจักรกรดไตรคาร์บอกซิลิก (TCA) ของหลอดเลือดแดงแข็งได้ เราพบว่าปริมาณของ BCAA ทรานส์อะมิเนส 1 (BCAT1) และ BCAT2 เพิ่มขึ้นทั้งคู่ พวกมันเร่งปฏิกิริยาขั้นตอนแรกของการสลาย BCAA โดยการสร้างกลูตาเมตจาก α-คีโตกลูตาเรต (26) หน่วยย่อยทั้งหมดที่ประกอบขึ้นเป็นคอมเพล็กซ์ของเอนไซม์ branched chain keto acid dehydrogenase (BCKD) มีการเพิ่มระดับการแสดงออก (คอมเพล็กซ์นี้เร่งปฏิกิริยาการสลายคาร์บอนของ BCAA ที่เกิดขึ้นอย่างถาวรและไม่สามารถย้อนกลับได้) (รูปที่ 3A และรูปที่ S5A) อย่างไรก็ตาม ไม่พบการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนใน BCAA เองใน PN ที่คัดแยกแล้ว ซึ่งอาจเป็นเพราะการดูดซึมกรดอะมิโนจำเป็นเหล่านี้เข้าสู่เซลล์เพิ่มขึ้น หรือการใช้แหล่งอื่น (กลูโคสหรือกรดแลคติก) เพื่อเสริมวงจร TCA (รูปที่ S5B) PN ที่ขาด OXPHOS ยังแสดงให้เห็นถึงกิจกรรมการสลายตัวของกลูตามีนและการถ่ายโอนหมู่เอมีนที่เพิ่มขึ้นเมื่ออายุ 8 สัปดาห์ ซึ่งสามารถสะท้อนได้จากการเพิ่มระดับการแสดงออกของเอนไซม์ไมโทคอนเดรียกลูตามิเนส (GLS) และกลูตามีนไพรูเวตทรานส์อะมิเนส 2 (GPT2) (รูปที่ 3, A และ C) เป็นที่น่าสังเกตว่าการควบคุมระดับ GLS ที่เพิ่มขึ้นนั้นจำกัดอยู่ที่กลูตามิเนส C ไอโซฟอร์มที่ถูกตัดต่อ (GLS-GAC) (การเปลี่ยนแปลงของ Mfn2cKO/CTRL อยู่ที่ประมาณ 4.5 เท่า, P = 0.05) และการควบคุมระดับที่เพิ่มขึ้นเฉพาะในเนื้อเยื่อมะเร็งสามารถสนับสนุนพลังงานชีวภาพของไมโตคอนเดรียได้ (27)
(A) แผนภูมิความร้อนแสดงการเปลี่ยนแปลงของระดับโปรตีนตามเส้นทางที่กำหนด ณ สัปดาห์ที่ 8 (B) ตัวอย่างชิ้นส่วนสมองน้อยที่ติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อต้าน PCx (แถบมาตราส่วน 20 μm) ลูกศรสีเหลืองชี้ไปที่ตัวเซลล์ Purkinje (C) การวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนตามช่วงเวลาที่ระบุว่าเป็นตัวเลือกสำคัญสำหรับภาวะหลอดเลือดแดงแข็ง (การทดสอบ t หลายครั้ง, *FDR <5%; n = 3-5 ตัว) (D) ด้านบน: แผนภาพแสดงวิธีการต่างๆ ในการเข้าสู่คาร์บอนที่ติดฉลากซึ่งมีอยู่ในสารติดตาม [1-13C]pyruvate (เช่น ผ่าน PDH หรือเส้นทางผ่านหลอดเลือดแดง) ด้านล่าง: แผนภูมิไวโอลินแสดงเปอร์เซ็นต์ของคาร์บอนที่ติดฉลากเดี่ยว (M1) ที่แปลงเป็นกรดแอสปาร์ติก กรดซิตริก และกรดมาลิก หลังจากติดฉลากชิ้นส่วนสมองน้อยเฉียบพลันด้วย [1-13C]pyruvate (การทดสอบ t แบบจับคู่; ** P <0.01) (E) การวิเคราะห์ประวัติเวลาโดยละเอียดของเส้นทางที่ระบุ พิจารณาเฉพาะโปรตีนที่มีค่า P<0.05 ที่ 8 สัปดาห์ เส้นประ: ไม่มีค่าปรับ (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง; * P <0.05; *** P <0.001) ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
จากการวิเคราะห์ของเรา การสลายตัวของ BCAA กลายเป็นหนึ่งในเส้นทางการควบคุมที่สำคัญ ข้อเท็จจริงนี้ชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่าปริมาตรการหายใจที่เข้าสู่รอบ TCA อาจเปลี่ยนแปลงไปใน PN ที่ขาด OXPHOS ซึ่งอาจแสดงถึงรูปแบบหลักของการปรับเปลี่ยนการเผาผลาญของเซลล์ประสาท ซึ่งอาจส่งผลกระทบโดยตรงต่อสรีรวิทยาและการอยู่รอดของเซลล์ประสาทในระหว่างการรักษาภาวะการทำงานผิดปกติของ OXPHOS อย่างรุนแรง สอดคล้องกับสมมติฐานนี้ เราพบว่าเอนไซม์ต้านหลอดเลือดแดงแข็งหลัก PCx มีการควบคุมเพิ่มขึ้น (Mfn2cKO/CTRL เปลี่ยนแปลงประมาณ 1.5 เท่า; รูปที่ 3A) ซึ่งเร่งปฏิกิริยาการเปลี่ยนไพรูเวตเป็นออกซาโลอะซิเตต (28) ซึ่งเชื่อว่ามีการแสดงออกในเนื้อเยื่อสมองจำกัดเฉพาะในแอสโทรไซต์ (29, 30) จากการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล พบว่าการแสดงออกของ PCx เพิ่มขึ้นอย่างจำเพาะเจาะจงและมีนัยสำคัญใน PN ที่ขาด OXPHOS ซึ่งสอดคล้องกับผลการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ ในขณะที่ปฏิกิริยาของ PCx นั้นจำกัดอยู่เฉพาะในเซลล์เกลีย Bergmann ที่อยู่ติดกันในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3B) เพื่อทดสอบการทำงานของการเพิ่มขึ้นของ PCx ที่สังเกตได้ เราได้ทำการทดลองกับชิ้นส่วนสมองน้อยที่เตรียมใหม่โดยใช้สารติดตาม [1-13C]pyruvate เมื่อไพรูเวทถูกออกซิไดซ์โดยไพรูเวทดีไฮโดรจีเนส (PDH) ฉลากไอโซโทปจะหายไป แต่จะถูกรวมเข้ากับสารตัวกลางของวัฏจักร TCA เมื่อไพรูเวทถูกเผาผลาญโดยปฏิกิริยาของหลอดเลือด (รูปที่ 3D) เพื่อสนับสนุนข้อมูลโปรตีโอมิกส์ของเรา เราสังเกตเห็นเครื่องหมายจำนวนมากจากสารติดตามนี้ในกรดแอสปาร์ติกของชิ้นส่วน Mfn2cKO ในขณะที่กรดซิตริกและกรดมาลิกก็มีแนวโน้มปานกลางเช่นกัน แม้ว่าจะไม่มีนัยสำคัญทางสถิติ (รูปที่ 3D)
ในเซลล์ประสาทโดปามีนของหนู MitoPark ที่มีความผิดปกติของไมโทคอนเดรียซึ่งเกิดจากการทำลายยีนปัจจัยการถอดรหัสไมโทคอนเดรีย A (Tfam) โดยเฉพาะในเซลล์ประสาทโดปามีน (รูปที่ S6B) การแสดงออกของ PCx ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน (31) ซึ่งบ่งชี้ว่าการเกิดโรคหลอดเลือดแดงแข็งจากกรดอะซิโตนนั้นถูกควบคุมในระหว่างความผิดปกติของ OXPHOS ในเซลล์ประสาทในร่างกาย เป็นที่น่าสังเกตว่ามีการค้นพบเอนไซม์เฉพาะ (32-34) ที่อาจแสดงออกในเซลล์ประสาทที่อาจเกี่ยวข้องกับหลอดเลือดแดงแข็งตัว ซึ่งมีการควบคุมเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญใน PN ที่ขาด OXPHOS เช่น โพรพิโอนิล-CoA คาร์บอกซิเลส (PCC-A) มาโลนิล-CoA ที่แปลงโพรพิโอนิล-CoA เป็นซัคซินิล-CoA และไมโทคอนเดรียลมาลิกเอนไซม์ 3 ​​(ME3) ซึ่งมีบทบาทหลักในการกู้คืนไพรูเวตจากมาเลต (รูปที่ 3, A และ C) (33, 35) นอกจากนี้ เรายังพบว่าเอนไซม์ Pdk3 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งทำหน้าที่ฟอสโฟรีเลตและทำให้ PDH ไม่ทำงาน (36) ในขณะที่ไม่พบการเปลี่ยนแปลงใดๆ ในเอนไซม์ Pdp1 ที่กระตุ้น PDH หรือเอนไซม์เชิงซ้อน PDH เอง (รูปที่ 3A) ในเซลล์ประสาท Mern2cKO PN การฟอสโฟรีเลชันของหน่วยย่อย α1 (PDHE1α) ของส่วนประกอบไพรูเวทดีไฮโดรจีเนส E1 ของคอมเพล็กซ์ PDH ที่ Ser293 (ซึ่งทราบกันว่ายับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ PDH) เพิ่มขึ้นอย่างสม่ำเสมอ (รูปที่ S6C) (รูปที่ S6C) ไพรูเวทไม่สามารถเข้าถึงหลอดเลือดได้
สุดท้าย เราพบว่าวิถีการสังเคราะห์ซีรีนและไกลซีน วงจรโฟเลตไมโทคอนเดรียที่เกี่ยวข้อง (1C) และการสังเคราะห์โพรลีน (รูปที่ 1G และรูปที่ S5C) ล้วนได้รับการกระตุ้นอย่างมีนัยสำคัญ ตามรายงานระหว่างกระบวนการกระตุ้น เนื้อเยื่อโดยรอบถูกกระตุ้นด้วยความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย (5-7) การวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลที่สนับสนุนข้อมูลโปรตีโอมิกส์เหล่านี้แสดงให้เห็นว่าใน PN ที่ขาด OXPHOS ชิ้นส่วนสมองน้อยของหนูอายุ 8 สัปดาห์ได้รับการกระตุ้นด้วยซีรีนไฮดรอกซีเมทิลทรานสเฟอเรส 2 (SHMT2) ซึ่งเป็นเอนไซม์สำคัญของวงจรโฟเลตไมโทคอนเดรีย ทำให้เกิดการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ S5D) ในการทดลองติดตามกระบวนการเผาผลาญในชิ้นส่วนสมองน้อยที่บ่มด้วยกลูโคส CU จำนวน 13 ชิ้น ยืนยันเพิ่มเติมถึงการเพิ่มขึ้นของการสังเคราะห์ซีรีนและโพรลีน ซึ่งบ่งชี้ว่าการไหลของไอโซฟอร์มคาร์บอนเข้าสู่ซีรีนและโพรลีนเพิ่มขึ้น (รูปที่ S5E) เนื่องจากปฏิกิริยาที่ส่งเสริมโดย GLS และ GPT2 มีหน้าที่ในการสังเคราะห์กลูตาเมตจากกลูตามีนและการถ่ายโอนหมู่แอมิโนระหว่างกลูตาเมตและ α-คีโตกลูตาเรต การเพิ่มขึ้นของปฏิกิริยาเหล่านี้บ่งชี้ว่าเซลล์ประสาทที่ขาด OXPHOS มีความต้องการกลูตาเมตเพิ่มขึ้น ซึ่งอาจมีจุดมุ่งหมายเพื่อรักษาระดับการสังเคราะห์โพรลีนที่เพิ่มขึ้น (รูปที่ S5C) ตรงกันข้ามกับการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของแอสโทรไซต์ในสมองส่วนซีรีเบลลัมจากหนู Mfn2cKO ที่มี PN เฉพาะเจาะจง แสดงให้เห็นว่าเส้นทางเหล่านี้ (รวมถึงแอนติเพอร์ออกซิเดสทั้งหมด) ไม่มีการเปลี่ยนแปลงการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนทิศทางการเผาผลาญนี้มีความเฉพาะเจาะจงต่อ PN ที่ถูกย่อยสลาย (รูปที่ S6, D ถึง G)
โดยสรุป การวิเคราะห์เหล่านี้เผยให้เห็นรูปแบบการกระตุ้นตามเวลาที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญของวิถีเมตาบอลิซึมเฉพาะในเซลล์ประสาท แม้ว่าการทำงานของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาทที่ผิดปกติอาจนำไปสู่ภาวะหลอดเลือดแดงแข็งตัวในระยะเริ่มต้นและการปรับโครงสร้าง 1C (รูปที่ 3E และรูปที่ S5C) และแม้กระทั่งการเปลี่ยนแปลงที่คาดการณ์ได้ในการแสดงออกของคอมเพล็กซ์ I และ IV แต่การเปลี่ยนแปลงในการสังเคราะห์ซีรีนใหม่จะปรากฏชัดเจนในระยะหลังเท่านั้น ความผิดปกติของ OXPHOS (รูปที่ 3E และรูปที่ S5C) ผลการค้นพบเหล่านี้กำหนดกระบวนการตามลำดับที่การตอบสนองของไมโทคอนเดรีย (วงจร 1C) และไซโตพลาสซึม (การสังเคราะห์ซีรีน) ที่เกิดจากความเครียดทำงานร่วมกันอย่างมีประสิทธิภาพกับการเพิ่มขึ้นของภาวะหลอดเลือดแดงแข็งตัวในวงจร TCA เพื่อปรับเปลี่ยนเมตาบอลิซึมของเซลล์ประสาท
เซลล์ประสาท PN ที่ขาด OXPHOS อายุ 8 สัปดาห์ สามารถรักษาการทำงานของการกระตุ้นความถี่สูงและมีการเชื่อมต่อทางเมตาบอลิซึมอย่างมีนัยสำคัญเพื่อชดเชยความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย การค้นพบนี้ทำให้เกิดความเป็นไปได้ที่น่าสนใจว่า แม้ในขณะนี้ เซลล์เหล่านี้อาจได้รับการแทรกแซงทางการรักษาเพื่อชะลอหรือป้องกันการเสื่อมของระบบประสาทในภายหลัง เราได้แก้ไขความเป็นไปได้นี้ผ่านการแทรกแซงอิสระสองวิธี ในวิธีแรก เราได้ออกแบบเวกเตอร์ไวรัสอะเดโนแอสโซซิเอต (AAV) ที่ขึ้นอยู่กับ Cre เพื่อให้ MFN2 สามารถแสดงออกได้อย่างเลือกสรรในเซลล์ประสาท PN ที่ขาด OXPHOS ในร่างกาย (รูปที่ S7A) AAV ที่เข้ารหัส MFN2 และยีนรายงานเรืองแสง mCherry (Mfn2-AAV) ได้รับการตรวจสอบในวัฒนธรรมเซลล์ประสาทปฐมภูมิในหลอดทดลอง ซึ่งทำให้ MFN2 แสดงออกในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับ Cre และช่วยกอบกู้สัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย จึงป้องกันการกลายพันธุ์ของระบบประสาทในเซลล์ประสาท Mfn2cKO (รูปที่ S7, B, D และ E) ถัดมา เราได้ทำการทดลองในร่างกายเพื่อส่ง Mfn2-AAV อายุ 8 สัปดาห์ไปยังเปลือกสมองส่วนซีรีเบลลัมของหนู Mfn2cKO และหนูควบคุมโดยใช้เทคนิคสเตอริโอแท็กติก และวิเคราะห์หนูอายุ 12 สัปดาห์ (รูปที่ 4A) หนู Mfn2cKO ที่ได้รับการรักษาเสียชีวิต (รูปที่ 1, A และ B) (16) การถ่ายทอดไวรัสในร่างกายส่งผลให้เกิดการแสดงออกของ PN อย่างเลือกสรรในวงกลมซีรีเบลลัมบางส่วน (รูปที่ S7, G และ H) การฉีด AAV ควบคุมที่แสดงออกเฉพาะ mCherry (Ctrl-AAV) ไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อระดับการเสื่อมของระบบประสาทในสัตว์ Mfn2cKO ในทางตรงกันข้าม การวิเคราะห์ Mfn2cKO ที่ได้รับการถ่ายทอดด้วย Mfn2-AAV แสดงให้เห็นถึงผลการป้องกันอย่างมีนัยสำคัญของชั้นเซลล์ PN (รูปที่ 4, B และ C) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความหนาแน่นของเซลล์ประสาทดูเหมือนจะแทบไม่แตกต่างจากสัตว์ควบคุม (รูปที่ 4, B และ C และรูปที่ S7, H และ I) การแสดงออกของ MFN1 แต่ไม่ใช่ MFN2 มีประสิทธิภาพเท่าเทียมกันในการป้องกันการตายของเซลล์ประสาท (รูปที่ 4C และรูปที่ S7, C และ F) ซึ่งบ่งชี้ว่าการแสดงออกของ MFN1 ที่ผิดปกติสามารถชดเชยการขาด MFN2 ได้อย่างมีประสิทธิภาพ การวิเคราะห์เพิ่มเติมในระดับ PN เดี่ยวแสดงให้เห็นว่า Mfn2-AAV ช่วยฟื้นฟูโครงสร้างจุลภาคของไมโทคอนเดรีย ปรับระดับ mtDNA ให้เป็นปกติ และย้อนกลับการแสดงออกที่สูงของเครื่องหมายต่อต้านการสร้างหลอดเลือด PCx ​​(รูปที่ 4, C ถึง E) การตรวจสอบด้วยสายตาของหนู Mfn2cKO ที่ได้รับการฟื้นฟูในสภาวะพักแสดงให้เห็นว่าท่าทางและอาการทางมอเตอร์ (การเคลื่อนไหว S1 ถึง S3) ดีขึ้น สรุปได้ว่า การทดลองเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการนำ MFN2 กลับเข้าไปใน PN ที่ขาด OXPHOS อย่างรุนแรงในภายหลังนั้นเพียงพอที่จะย้อนกลับการบริโภค mtDNA และกระตุ้นให้เกิดหลอดเลือดแดงแข็งตัว ซึ่งจะช่วยป้องกันการเสื่อมของแอกซอนและการตายของเซลล์ประสาทในร่างกาย
(A) แผนภาพแสดงตารางการทดลองสำหรับการฉีด AAV ที่เข้ารหัส MFN2 เมื่อวิถีเมตาบอลิซึมที่ระบุถูกกระตุ้น (B) ภาพตัวอย่างจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของชิ้นส่วนสมองน้อยอายุ 12 สัปดาห์ที่ได้รับการถ่ายทอดยีนเมื่ออายุ 8 สัปดาห์ในหนู Mfn2cKO และติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อต้านแคลบินดิน ด้านขวา: การปรับขนาดของเส้นใยแอกซอน มาตราส่วนของการซูมแอกซอนคือ 450 และ 75 ไมโครเมตร (C) ด้านซ้าย: การหาปริมาณความหนาแน่นของเซลล์ Purkinje ในวงจรการถ่ายทอดยีน AAV (AAV+) (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว; n = 3 ตัว) ด้านขวา: การวิเคราะห์จุดโฟกัส mtDNA ใน PN ที่ได้รับการถ่ายทอดยีนเมื่ออายุ 12 สัปดาห์ (การทดสอบ t แบบไม่จับคู่; n = 6 เซลล์จากหนูสามตัว) * P <0.05; ** P <0.01 (D) ภาพถ่ายอิเล็กตรอนแบบส่งผ่านตัวอย่างของ PN จากส่วนสมองน้อยของ Mfn2cKO ที่ได้รับการถ่ายทอดด้วยเวกเตอร์ไวรัสตามที่ระบุไว้ หน้ากากสีชมพูแสดงพื้นที่ที่เดนไดรต์ครอบครอง และสี่เหลี่ยมจุดสีเหลืองแสดงภาพขยายที่แสดงทางด้านขวา n แทนแกนกลางของนิวเคลียส แถบมาตราส่วน 1 μm (E) แสดงตัวอย่างการย้อมสี PCx ใน PN ที่ได้รับการถ่ายทอดเมื่ออายุ 12 สัปดาห์ แถบมาตราส่วน 20 μm OE คือ การแสดงออกเกิน FC คือ การเปลี่ยนแปลงแบบเท่าตัว
สุดท้ายนี้ เราได้ตรวจสอบความสำคัญของการอยู่รอดของเซลล์ที่ถูกกระตุ้นด้วยเพอร์ออกซิเดสใน PN ที่มีความผิดปกติของ OXPHOS เราสร้าง AAV-shRNA (short hairpin RNA) ที่เข้ารหัส mCherry ซึ่งกำหนดเป้าหมายเฉพาะ mRNA ของ PCx ในหนู (AAV-shPCx) และฉีดไวรัสหรือตัวควบคุมแบบสุ่ม (AAV-scr) เข้าไปในสมองส่วนซีรีเบลลัมของหนู Mfn2cKO การฉีดทำในสัปดาห์ที่สี่ของอายุ (รูปที่ 5A) เพื่อให้เกิดการลดระดับ PCx อย่างมีประสิทธิภาพในช่วงเวลาที่การแสดงออกของ PCx เพิ่มขึ้น (รูปที่ 3C) และชั้นเซลล์ PN ยังคงสมบูรณ์ (รูปที่ 1A) เป็นที่น่าสังเกตว่าการลดระดับ PCx (รูปที่ S8A) นำไปสู่การเร่งการตายของ PN อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งจำกัดอยู่เฉพาะในวงแหวนที่ติดเชื้อ (รูปที่ 5, B และ C) เพื่อทำความเข้าใจกลไกของผลกระทบทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากการควบคุม PCx ที่เพิ่มขึ้น เราได้ศึกษาสถานะรีดอกซ์ของ PN หลังจากการลดระดับ PCx และการแสดงออกของไบโอเซนเซอร์เชิงแสง Grx1-roGFP2 ที่ส่งผ่าน AAV พร้อมกัน (รูปที่ S8, B ถึง D) เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ของศักยภาพรีดอกซ์ของเปปไทด์กลูตาไธโอน (38) จากนั้น เราได้ทำการสร้างภาพด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอนฟลูออเรสเซนซ์ (FLIM) ในชิ้นส่วนสมองเฉียบพลันของหนู Mfn2cKO อายุ 7 สัปดาห์หรือหนูควบคุมที่เป็นพี่น้องร่วมครอกเดียวกัน เพื่อตรวจจับการเปลี่ยนแปลงที่อาจเกิดขึ้นในสถานะรีดอกซ์ของไซโตพลาสซึมหลังจากตรวจสอบเงื่อนไข FLIM แล้ว (รูปที่ S8, E ถึง G) การวิเคราะห์แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในสถานะออกซิเดชันของ PN ของ Mfn2cKO ที่ขาดการแสดงออกของ PCx ซึ่งแตกต่างจากเซลล์ประสาทควบคุมหรือ PN ของ Mfn2cKO ที่แสดงออกเฉพาะ shRNA แบบสุ่ม (รูปที่ 5, D และ E) เมื่อการแสดงออกของ PCx ลดลง เปอร์เซ็นต์ของ Mfn2cKO PN ที่แสดงสภาวะออกซิไดซ์สูงเพิ่มขึ้นมากกว่าสามเท่า (รูปที่ 5E) ซึ่งบ่งชี้ว่าการเพิ่มการแสดงออกของ PCx ช่วยรักษาความสามารถในการรีด็อกซ์ของเซลล์ประสาทที่เสื่อมสภาพ
(A) แผนภาพแสดงตารางการทดลองสำหรับการฉีด AAV ที่เข้ารหัส shPCx เมื่อวิถีเมตาบอลิซึมที่ระบุถูกกระตุ้น (B) ภาพถ่ายคอนโฟคอลตัวอย่างของส่วนสมองน้อยในหนู Mfn2cKO อายุ 8 สัปดาห์ที่ได้รับการถ่ายทอดและติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อต้านแคลซิเนอรินเมื่ออายุ 4 สัปดาห์ แถบมาตราส่วน 450 μm (C) การหาปริมาณความหนาแน่นของเซลล์ Purkinje ในลูปที่ได้รับการถ่ายทอด AAV (การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว; n = 3 ถึง 4 ตัว) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน; ***P<0.001 (D) ภาพ FLIM ตัวอย่างแสดงอายุขัยเฉลี่ยของ PN อายุ 7 สัปดาห์ที่แสดงเซนเซอร์รีดอกซ์กลูตาไธโอน Grx1-roGFP2 ภายใต้เงื่อนไขการทดลองที่ระบุ อัตราส่วน LUT (ตารางค้นหา): ช่วงเวลาการอยู่รอด (ในพิโควินาที) แถบมาตราส่วน 25 μm (E) ฮิสโตแกรมแสดงการกระจายของค่าอายุการใช้งานของ Grx1-roGFP2 จาก (D) (n=158 ถึง 368 เซลล์ในหนูสองตัวภายใต้แต่ละสภาวะ) แผนภูมิวงกลมเหนือฮิสโตแกรมแต่ละอันแสดงจำนวนเซลล์ที่มีค่าอายุการใช้งานยาวนานกว่า (สีแดง ออกซิไดซ์) หรือสั้นกว่า (สีน้ำเงิน รีดิวซ์) อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเกิน 1 SD ของค่าอายุการใช้งานเฉลี่ยใน CTRL-AAV-scr (F) แบบจำลองที่เสนอแสดงให้เห็นถึงผลการป้องกันของการเพิ่มระดับของ PCx ในเซลล์ประสาท
โดยสรุปแล้ว ข้อมูลที่เรานำเสนอในที่นี้แสดงให้เห็นว่า การแสดงออกของ MFN2 อีกครั้งสามารถช่วยฟื้นฟู PN ขั้นสูงที่มีภาวะขาด OXPHOS อย่างรุนแรง การลดลงของ mtDNA อย่างรุนแรง และสัณฐานวิทยาคล้าย ista ที่ผิดปกติอย่างมากได้อย่างสมบูรณ์ ทำให้เกิดความก้าวหน้าอย่างต่อเนื่องแม้ในโรคขั้นสูง การเสื่อมของระบบประสาทเป็นหลักฐานที่สามารถย้อนกลับได้ของระยะก่อนการตายของเซลล์ ความยืดหยุ่นทางเมตาบอลิซึมในระดับนี้ได้รับการเน้นย้ำเพิ่มเติมโดยความสามารถของเซลล์ประสาทในการเหนี่ยวนำให้เกิดภาวะหลอดเลือดแดงแข็ง (การปรับวงจร TCA ใหม่) ซึ่งยับยั้งการแสดงออกของ PCx ใน PN ที่ขาด OXPHOS และเพิ่มการตายของเซลล์ จึงมีบทบาทในการป้องกัน (รูปที่ 5F)
ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้แสดงหลักฐานว่าการตอบสนองของเซลล์ประสาทต่อความผิดปกติของ OXPHOS คือการค่อยๆ เปลี่ยนไปเป็นภาวะหลอดเลือดแดงแข็งตัวแบบวงจร TCA ผ่านทางเส้นทางการกระตุ้นที่แตกต่างกันซึ่งถูกกระตุ้นโดยโปรแกรมเมตาบอลิซึม เราได้ยืนยันการวิเคราะห์โปรตีนด้วยวิธีการเสริมหลายวิธี และพบว่าเมื่อเผชิญกับความผิดปกติของไมโทคอนเดรียอย่างรุนแรง เซลล์ประสาทจะมีรูปแบบของความยืดหยุ่นทางเมตาบอลิซึมที่ไม่เคยรู้จักมาก่อน ที่น่าประหลาดใจคือ กระบวนการเชื่อมต่อใหม่ทั้งหมดไม่ได้บ่งชี้ถึงสภาวะเมตาบอลิซึมขั้นสุดท้ายที่มาพร้อมกับการเสื่อมของระบบประสาทอย่างค่อยเป็นค่อยไปและไม่สามารถย้อนกลับได้ แต่ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่ามันอาจเป็นกลไกการชดเชยการทำงานของเซลล์ประสาทแม้ในระยะก่อนการตายของเซลล์ การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่าเซลล์ประสาทมีความยืดหยุ่นทางเมตาบอลิซึมในร่างกายในระดับสูง ข้อเท็จจริงนี้พิสูจน์ได้ว่าการนำ MFN2 กลับมาใช้ใหม่ในภายหลังสามารถย้อนกลับการแสดงออกของเครื่องหมายเมตาบอลิซึมที่สำคัญและป้องกันการเสื่อมของเซลล์ประสาทได้ ในทางตรงกันข้าม มันยับยั้งภาวะหลอดเลือดแดงแข็งตัวและเร่งการทำงานของเส้นประสาท
หนึ่งในผลการค้นพบที่น่าสนใจที่สุดในการวิจัยของเราคือ PN ที่ขาด OXPHOS สามารถปรับเปลี่ยนการเผาผลาญของวงจร TCA ได้โดยการเพิ่มการทำงานของเอนไซม์ที่กระตุ้นให้เกิดภาวะหลอดเลือดแดงแข็งตัวโดยเฉพาะ การจัดเรียงการเผาผลาญใหม่เป็นลักษณะทั่วไปของเซลล์มะเร็ง ซึ่งบางส่วนอาศัยกลูตามีนเพื่อเสริมสารตัวกลางของวงจร TCA เพื่อสร้างสารเทียบเท่ารีดิวซ์ ซึ่งขับเคลื่อนห่วงโซ่การหายใจและรักษาการผลิตสารตั้งต้นของการสังเคราะห์ไขมันและนิวคลีโอไทด์ (39, 40) การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าในเนื้อเยื่อส่วนปลายที่ประสบกับความผิดปกติของ OXPHOS การเชื่อมต่อใหม่ของการเผาผลาญกลูตามีน/กลูตาเมตก็เป็นลักษณะเด่นเช่นกัน (5, 41) โดยทิศทางการเข้าสู่ของกลูตามีนในวงจร TCA ขึ้นอยู่กับความรุนแรงของการบาดเจ็บของ OXPHOS (41) อย่างไรก็ตาม ยังขาดหลักฐานที่ชัดเจนเกี่ยวกับความคล้ายคลึงกันของความยืดหยุ่นในการเผาผลาญของเซลล์ประสาทในร่างกายและความเกี่ยวข้องที่เป็นไปได้ในบริบทของโรค จากการศึกษาในหลอดทดลองเมื่อเร็ว ๆ นี้ พบว่าเซลล์ประสาทคอร์เทกซ์หลักสามารถเคลื่อนย้ายกลุ่มกลูตาเมตเพื่อการส่งสัญญาณประสาท ซึ่งส่งเสริมการเผาผลาญออกซิเดชันและภาวะหลอดเลือดแดงแข็งภายใต้สภาวะความเครียดทางเมตาบอลิซึม (42) เป็นที่น่าสังเกตว่าภายใต้การยับยั้งทางเภสัชวิทยาของเอนไซม์ซัคซิเนตดีไฮโดรจีเนสในวัฏจักร TCA เชื่อกันว่าการคาร์บอกซิเลชันของไพรูเวตจะช่วยรักษาการสังเคราะห์ออกซาโลอะซิเตตในเซลล์ประสาทแกรนูลของสมองน้อยที่เพาะเลี้ยง (34) อย่างไรก็ตาม ความสำคัญทางสรีรวิทยาของกลไกเหล่านี้ต่อเนื้อเยื่อสมอง (ซึ่งเชื่อกันว่าภาวะหลอดเลือดแดงแข็งส่วนใหญ่จำกัดอยู่ที่แอสโทรไซต์) ยังคงมีความสำคัญทางสรีรวิทยาอย่างมาก (43) ในกรณีนี้ ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่า PN ที่เสียหายจาก OXPHOS ในร่างกายสามารถเปลี่ยนไปเป็นการย่อยสลาย BCAA และการคาร์บอกซิเลชันของไพรูเวต ซึ่งเป็นแหล่งเสริมหลักสองแหล่งของสารตัวกลางในกลุ่ม TCA แม้ว่าจะมีการเสนอว่าการสลายตัวของ BCAA มีส่วนช่วยในการเผาผลาญพลังงานของเซลล์ประสาท นอกเหนือจากบทบาทของกลูตาเมตและ GABA ในการส่งสัญญาณประสาท (44) แต่ก็ยังไม่มีหลักฐานสำหรับกลไกเหล่านี้ในร่างกาย ดังนั้นจึงคาดเดาได้ง่ายว่าเซลล์ประสาทที่ทำงานผิดปกติสามารถชดเชยการบริโภคสารตัวกลางของ TCA ที่เกิดจากกระบวนการดูดซึมได้โดยอัตโนมัติโดยการเพิ่มภาวะหลอดเลือดแข็งตัว โดยเฉพาะอย่างยิ่ง อาจจำเป็นต้องมีการเพิ่มระดับของ PCx เพื่อรักษาระดับความต้องการกรดแอสปาร์ติกที่เพิ่มขึ้น ซึ่งมีการแนะนำในเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวที่มีความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย (45) อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์เมตาโบลิกของเราไม่ได้เปิดเผยการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญใดๆ ในระดับคงที่ของกรดแอสปาร์ติกในเซลล์ประสาท Mfn2cKO (รูปที่ S6A) ซึ่งน่าจะสะท้อนถึงการใช้กรดแอสปาร์ติกในการเผาผลาญที่แตกต่างกันระหว่างเซลล์ที่กำลังแบ่งตัวและเซลล์ประสาทหลังการแบ่งตัว แม้ว่ากลไกที่แน่นอนของการเพิ่มระดับ PCx ในเซลล์ประสาทที่ทำงานผิดปกติในร่างกายยังคงต้องได้รับการระบุลักษณะ แต่เราได้แสดงให้เห็นว่าการตอบสนองก่อนกำหนดนี้มีบทบาทสำคัญในการรักษาสถานะรีดอกซ์ของเซลล์ประสาท ซึ่งได้รับการพิสูจน์แล้วในการทดลอง FLIM บนชิ้นส่วนสมองน้อย โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การป้องกันไม่ให้ PN เพิ่มระดับ PCx สามารถนำไปสู่สถานะออกซิไดซ์มากขึ้นและเร่งการตายของเซลล์ การกระตุ้นการย่อยสลาย BCAA และการคาร์บอกซิเลชันของไพรูเวตไม่ใช่วิธีที่จะระบุลักษณะเนื้อเยื่อส่วนปลายของความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย (7) ดังนั้น ดูเหมือนว่าสิ่งเหล่านี้จะเป็นคุณลักษณะสำคัญของเซลล์ประสาทที่ขาด OXPHOS แม้ว่าจะไม่ใช่คุณลักษณะเดียวก็ตาม ซึ่งมีความสำคัญต่อการเสื่อมของระบบประสาท
โรคของสมองน้อยเป็นโรคความเสื่อมของระบบประสาทชนิดหนึ่งที่มีความหลากหลาย ซึ่งมักแสดงอาการเป็นภาวะเสียการทรงตัวและมักทำให้เซลล์ประสาท PN เสียหาย (46) เซลล์ประสาทกลุ่มนี้มีความเปราะบางต่อความผิดปกติของไมโทคอนเดรียเป็นพิเศษ เนื่องจากความเสื่อมเฉพาะเจาะจงในหนูนั้นเพียงพอที่จะทำให้เกิดอาการทางมอเตอร์หลายอย่างที่เป็นลักษณะเฉพาะของโรคเสียการทรงตัวของไขสันหลังและสมองน้อยในมนุษย์ (16, 47, 48) จากรายงานพบว่าแบบจำลองหนูทรานส์เจนิกที่มียีนกลายพันธุ์มีความเกี่ยวข้องกับโรคเสียการทรงตัวของไขสันหลังและสมองน้อยในมนุษย์และมีความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย (49, 50) ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของการศึกษาผลที่ตามมาของการขาด OXPHOS ใน PNPH ดังนั้นจึงเหมาะสมอย่างยิ่งที่จะแยกและศึกษาเซลล์ประสาทกลุ่มนี้อย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม เนื่องจากเซลล์ประสาท PN มีความไวต่อแรงดันมากและคิดเป็นสัดส่วนน้อยของประชากรเซลล์สมองน้อยทั้งหมด การแยกเซลล์เหล่านี้อย่างเลือกสรรทั้งเซลล์จึงยังคงเป็นความท้าทายสำหรับงานวิจัยที่ใช้โอไมซ์หลายๆ งาน แม้ว่าจะแทบเป็นไปไม่ได้เลยที่จะกำจัดสิ่งปนเปื้อนจากเซลล์ชนิดอื่นได้อย่างสมบูรณ์ (โดยเฉพาะเนื้อเยื่อของผู้ใหญ่) แต่เราได้รวมขั้นตอนการแยกเซลล์ที่มีประสิทธิภาพเข้ากับ FACS เพื่อให้ได้จำนวนเซลล์ประสาทที่มีชีวิตเพียงพอสำหรับการวิเคราะห์โปรตีนในขั้นตอนต่อไป และมีความครอบคลุมของโปรตีนค่อนข้างสูง (ประมาณ 3000 โปรตีน) เมื่อเทียบกับชุดข้อมูลที่มีอยู่ของสมองน้อยทั้งหมด (51) ด้วยการรักษาความมีชีวิตของเซลล์ทั้งหมด วิธีที่เรานำเสนอในที่นี้ไม่เพียงแต่ช่วยให้เราตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในวิถีการเผาผลาญในไมโทคอนเดรียเท่านั้น แต่ยังตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงในไซโทพลาสมิกที่เกี่ยวข้อง ซึ่งเป็นการเสริมการใช้แท็กเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียเพื่อเพิ่มจำนวนเซลล์ชนิดใหม่สำหรับการนับจำนวนไมโทคอนเดรียในเนื้อเยื่อที่ซับซ้อน (52, 53) วิธีที่เราอธิบายนี้ไม่เพียงเกี่ยวข้องกับการศึกษาเซลล์ Purkinje เท่านั้น แต่ยังสามารถนำไปใช้กับเซลล์ชนิดใดก็ได้เพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงการเผาผลาญในสมองที่เป็นโรค รวมถึงแบบจำลองอื่นๆ ของความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย
ในที่สุด เราได้ระบุช่วงเวลาที่เหมาะสมในการรักษาในระหว่างกระบวนการปรับเปลี่ยนเมตาบอลิซึมนี้ ซึ่งสามารถย้อนกลับสัญญาณสำคัญของความเครียดในเซลล์ได้อย่างสมบูรณ์และป้องกันการเสื่อมของเซลล์ประสาท ดังนั้น การทำความเข้าใจผลกระทบทางด้านการทำงานของการปรับเปลี่ยนโครงสร้างที่อธิบายไว้ในที่นี้ อาจให้ข้อมูลเชิงลึกพื้นฐานเกี่ยวกับวิธีการรักษาที่เป็นไปได้สำหรับการรักษาความสามารถในการอยู่รอดของเซลล์ประสาทในระหว่างความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย การวิจัยในอนาคตที่มุ่งเน้นการวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงในเมตาบอลิซึมของพลังงานในเซลล์สมองประเภทอื่น ๆ เป็นสิ่งจำเป็นเพื่อเปิดเผยความสามารถในการประยุกต์ใช้หลักการนี้กับโรคทางระบบประสาทอื่น ๆ อย่างเต็มที่
หนู MitoPark ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้แล้ว (31) หนู C57BL/6N ที่มี loxP ล้อมรอบยีน Mfn2 ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้แล้ว (18) และผสมพันธุ์กับหนู L7-Cre (23) จากนั้นลูกหลานที่เป็นเฮเทโรไซกัสคู่ที่ได้จะถูกผสมพันธุ์กับหนูโฮโมไซกัส Mfn2loxP/Mfn2loxP เพื่อสร้างยีนน็อคเอาท์เฉพาะ Purkinje สำหรับ Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) ในการผสมพันธุ์ย่อย อัลลีล Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) ถูกนำเข้ามาผ่านการผสมพันธุ์เพิ่มเติม (20) ขั้นตอนการทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของยุโรป ระดับชาติ และระดับสถาบัน และได้รับการอนุมัติจาก LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Germany การทดลองกับสัตว์ยังเป็นไปตามแนวทางของสหพันธ์สมาคมวิทยาศาสตร์สัตว์ทดลองแห่งยุโรปด้วย
หลังจากให้ยาสลบแก่หญิงตั้งครรภ์และทำการสลายกระดูกสันหลังส่วนคอแล้ว จะทำการแยกตัวอ่อนหนู (E13) ออกมา จากนั้นทำการแยกเนื้อเยื่อชั้นนอกของสมองในสารละลาย Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) ที่เสริมด้วย 10 mM Hepes และนำไปเพาะเลี้ยงใน Dulbecco's Modified Eagle's Medium ที่มีเอนไซม์ papain (20 U/ml) และ cysteine ​​(1 μg/ml) นำเนื้อเยื่อไปบ่มใน DMEM และทำการแยกเซลล์โดยการย่อยด้วยเอนไซม์ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 20 นาที แล้วทำการบดด้วยเครื่องบดใน DMEM ที่เสริมด้วยซีรั่มจากลูกวัว 10% นำเซลล์ไปเพาะเลี้ยงบนแผ่นกระจกที่เคลือบด้วยโพลีไลซีนในความหนาแน่น 2×10⁶ เซลล์ต่อจานเพาะเลี้ยงขนาด 6 ซม. หรือในความหนาแน่น 0.5×10⁵ เซลล์/ซม.² สำหรับการวิเคราะห์ด้วยภาพ หลังจากผ่านไป 4 ชั่วโมง สารละลายเลี้ยงเซลล์ถูกเปลี่ยนเป็นสารละลาย Neurobasal ปราศจากซีรัมที่มีส่วนผสมของ B27 1% และ GlutaMax 0.5 mM จากนั้นเซลล์ประสาทจะถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิ 37°C และความเข้มข้นของ CO2 5% ตลอดการทดลอง และให้อาหารสัปดาห์ละครั้ง เพื่อกระตุ้นการเกิดการรวมตัวใหม่ในหลอดทดลอง ในวันที่สองของการเลี้ยงเซลล์ประสาทในหลอดทดลอง จะใช้เวกเตอร์ไวรัส AAV9 ปริมาณ 3 μl (จานเพาะเลี้ยง 24 หลุม) หรือ 0.5 μl (จานเพาะเลี้ยง 24 หลุม) ในการบำบัดเซลล์ประสาท: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, หมายเลขแคตตาล็อก 105530-AAV9) และ AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, หมายเลขแคตตาล็อก 105545-AAV9)
ดีเอ็นเอเสริมของเมาส์ Mfn1 และ Mfn2 (ได้จากพลาสมิด Addgene หมายเลข #23212 และ #23213 ตามลำดับ) ถูกทำเครื่องหมายด้วยลำดับ V5 (GKPIPNPLLGLDST) ที่ปลาย C-terminus และเชื่อมต่อกับ mCherry อย่างถูกต้องผ่านลำดับ T2A Grx1-roGFP2 เป็นของขวัญจาก Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) โดยการแทนที่คาสเซ็ต tdTomato โดยใช้วิธีการโคลนนิ่งแบบดั้งเดิม คาสเซ็ตดังกล่าวถูกโคลนนิ่งย่อยลงในโครงสร้างพื้นฐาน pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (หมายเลขอ้างอิง Addgene 28306) เพื่อสร้างเวกเตอร์ pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 และ pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 ตามลำดับ กลยุทธ์ที่คล้ายกันนี้ถูกใช้เพื่อสร้างเวกเตอร์ควบคุม pAAV-CAG-FLEX-mCherry ในการสร้างโครงสร้าง AAV-shPCx จำเป็นต้องใช้พลาสมิดเวกเตอร์ AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) ซึ่งประกอบด้วยลำดับ DNA ที่เข้ารหัส shRNA ที่กำหนดเป้าหมายไปยัง PCx ของหนู (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ U6 และใช้ mCherry ภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ CMV การผลิตเวกเตอร์ AAV เสริมดำเนินการตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Cell Biolabs) โดยสรุปคือ ใช้พลาสมิดถ่ายโอนที่มี mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ถ่ายทอดยีน mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) หรือ Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) เข้าสู่เซลล์ 293AAV แบบชั่วคราว รวมถึงพลาสมิดบรรจุโปรตีนแคปซิด AAV1 และโปรตีนเสริม โดยใช้วิธีแคลเซียมฟอสเฟต ได้สารละลายไวรัสแบบดิบโดยการแช่แข็งและละลายซ้ำในอ่างน้ำแข็งแห้ง/เอทานอล และสลายเซลล์ในสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (PBS) เวกเตอร์ AAV ได้รับการทำให้บริสุทธิ์โดยการปั่นเหวี่ยงความเร็วสูงแบบไล่ระดับไอโอไดซานอลแบบไม่ต่อเนื่อง (24 ชั่วโมงที่ 32,000 รอบต่อนาทีและ 4°C) และทำให้เข้มข้นโดยใช้ตัวกรองปั่นเหวี่ยง Amicon ultra-15 ไทเตอร์จีโนมของ AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 สำเนาจีโนม (GC)/มล.], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/มล.), AAV1-CAG-FLEX ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (54) โดยวัดด้วย PCR เชิงปริมาณแบบเรียลไทม์ (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/มล.) และ AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/มล.)
เซลล์ประสาทปฐมภูมิถูกขูดออกในสารละลาย 1x PBS ที่เย็นจัด นำไปปั่นแยกตะกอน แล้วบดให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ไลซิส 0.5% Triton X-100 / 0.5% sodium deoxycholate/PBS ที่มีสารยับยั้งฟอสฟาเทสและโปรตีเอส (Roche) การหาปริมาณโปรตีนทำโดยใช้การทดสอบกรดไบซินโคนินิก (Thermo Fisher Scientific) จากนั้นโปรตีนถูกแยกโดย SDS-โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโทรโฟเรซิส แล้วถ่ายโอนไปยังเยื่อโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์ (GE Healthcare) ปิดกั้นตำแหน่งที่ไม่จำเพาะและบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิ (ดูรายละเอียดในตาราง S1) ในนม 5% ใน TBST (Tris-buffered saline with Tween) ขั้นตอนการล้างและแอนติบอดีทุติยภูมิใน TBST บ่ม บ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิข้ามคืนที่ +4°C หลังจากล้างแล้ว ให้ใช้แอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ต่อมา เมื่อนำแผ่นบล็อตเดียวกันไปบ่มกับแอนติบอดีต่อ β-actin ก็ยืนยันได้ว่าปริมาณโปรตีนที่ใส่ลงไปเท่ากัน การตรวจจับทำได้โดยการแปลงเป็นเคมีเรืองแสงและเพิ่มความสว่างของเคมีเรืองแสง (GE Healthcare)
เซลล์ประสาทที่เพาะเลี้ยงไว้บนแผ่นกระจกปิดสไลด์ก่อนหน้านี้ จะถูกตรึงด้วยสารละลายพาราฟอร์มาลดีไฮด์ (PFA) 4% ในบัฟเฟอร์ PBS ณ จุดเวลาที่กำหนด ที่อุณหภูมิห้อง เป็นเวลา 10 นาที จากนั้น แผ่นกระจกปิดสไลด์จะถูกทำให้ซึมผ่านด้วยสารละลาย Triton X-100 0.1% ในบัฟเฟอร์ PBS เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิห้อง แล้วจึงแช่ในบัฟเฟอร์สำหรับบล็อก [อัลบูมินจากซีรั่มวัว (BSA) 3% ในบัฟเฟอร์ PBS] ในวันที่สอง แผ่นกระจกปิดสไลด์จะถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์สำหรับบล็อก และบ่มด้วยแอนติบอดีรองที่ติดฟลูออโรฟอร์ที่เหมาะสม เป็นเวลา 2 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิห้อง สุดท้าย ตัวอย่างจะถูกล้างอย่างทั่วถึงในบัฟเฟอร์ PBS ที่ย้อมสีด้วย 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) แล้วตรึงบนสไลด์กล้องจุลทรรศน์ด้วย Aqua-Poly/Mount
หนูทดลอง (ทั้งตัวผู้และตัวเมีย) ถูกทำให้สลบโดยการฉีดคีตามีน (130 มก./กก.) และไซลาซีน (10 มก./กก.) เข้าทางช่องท้อง และให้ยาแก้ปวดคาร์โปรเฟน (5 มก./กก.) ใต้ผิวหนัง จากนั้นวางหนูไว้ในเครื่องมือผ่าตัดสมองแบบสเตอริโอแท็กติก (Kopf) ที่ติดตั้งแผ่นให้ความอบอุ่น เปิดกะโหลกศีรษะและใช้สว่านทันตกรรมเจาะส่วนของเปลือกสมองส่วนซีรีเบลลัมที่ตรงกับกระดูกไมทรัล (จากแลมบ์ดา: หาง 1.8, ด้านข้าง 1, ตรงกับกลีบที่ 4 และ 5) ใช้เข็มฉีดยาโค้งเจาะรูเล็กๆ บนกะโหลกศีรษะอย่างระมัดระวังเพื่อหลีกเลี่ยงการทำลายหลอดเลือดด้านล่าง จากนั้นค่อยๆ สอดหลอดแก้วขนาดเล็กเข้าไปในรูเล็กๆ (จาก -1.3 ถึง -1 ทางด้านหน้าของเยื่อหุ้มสมองชั้นนอก) และฉีด AAV ปริมาณ 200 ถึง 300 นาโนลิตร เข้าไปในไมโครอินเจคเตอร์ (Narishige) ด้วยเข็มฉีดยาแบบมือ (Narishige) หลายๆ ครั้งด้วยแรงดันต่ำ ในช่วงเวลา 10 ถึง 20 นาที หลังจากฉีดแล้ว ให้วางหลอดแก้วไว้ต่ออีก 10 นาที เพื่อให้ไวรัสแพร่กระจายอย่างสมบูรณ์ หลังจากดึงหลอดแก้วออกแล้ว ให้เย็บแผลอย่างระมัดระวังเพื่อลดการอักเสบของแผลและช่วยให้สัตว์ฟื้นตัว สัตว์ได้รับการรักษาด้วยยาแก้ปวด (caspofen) เป็นเวลาหลายวันหลังการผ่าตัด ในระหว่างนั้นจะมีการตรวจสอบสภาพร่างกายของสัตว์อย่างระมัดระวัง และทำการุณยฆาตสัตว์ตามเวลาที่กำหนด ขั้นตอนทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของยุโรป ระดับชาติ และระดับสถาบัน และได้รับการอนุมัติจากสำนักงานสิ่งแวดล้อมและคุ้มครองผู้บริโภคแห่งรัฐนอร์ทไรน์-เวสต์ฟาเลีย ประเทศเยอรมนี
สัตว์ทดลองถูกทำให้สลบด้วยคีตามีน (100 มก./กก.) และไซลาซีน (10 มก./กก.) จากนั้นจึงทำการล้างหัวใจด้วย 0.1 M PBS ก่อน แล้วจึงล้างด้วย 4% PFA ใน PBS เนื้อเยื่อถูกแยกและตรึงใน 4% PFA/PBS ค้างคืนที่ 4°C ใช้มีดสั่น (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) ในการเตรียมส่วนตัดตามแนวตั้ง (หนา 50 μm) จากสมองที่ตรึงไว้ใน PBS เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น การย้อมสีส่วนตัดแบบลอยตัวจะดำเนินการตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (13) ที่อุณหภูมิห้องและทำการกวน โดยสรุปคือ ขั้นแรก ชิ้นส่วนที่ได้จะถูกทำให้ซึมผ่านได้ด้วย 0.5% Triton X-100/PBS เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง สำหรับบางอีพิโทป (Pcx และ Shmt2) ให้ใช้บัฟเฟอร์ tris-EDTA ที่ 80°C (pH 9) ให้ความร้อนชิ้นส่วนเป็นเวลา 25 นาทีแทนขั้นตอนนี้ ขั้นตอนต่อไป นำชิ้นเนื้อไปบ่มกับแอนติบอดีหลัก (ดูตาราง S1) ในบัฟเฟอร์สำหรับบล็อก (3% BSA/PBS) ที่อุณหภูมิ 4°C ค้างคืนพร้อมคนให้เข้ากัน วันรุ่งขึ้น ล้างชิ้นเนื้อด้วยบัฟเฟอร์สำหรับบล็อก และบ่มกับแอนติบอดีรองที่ติดฟลูออโรฟอร์ที่เหมาะสมเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง สุดท้าย ล้างชิ้นเนื้อให้สะอาดด้วย PBS ย้อมสีด้วย DAPI แล้วตรึงด้วย AquaPolymount บนสไลด์กล้องจุลทรรศน์
ใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งคอนโฟคอล (TCS SP8-X หรือ TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ที่ติดตั้งเลเซอร์แสงขาวและเลเซอร์ไดโอดอัลตราไวโอเลต 405 ในการถ่ายภาพตัวอย่าง โดยการกระตุ้นฟลูออโรฟอร์และเก็บสัญญาณด้วย Hybrid Detector (HyDs) ซอฟต์แวร์ LAS-X ถูกใช้เพื่อรวบรวมภาพซ้อนตามการสุ่มตัวอย่างแบบ Nyquist ในโหมดลำดับ: สำหรับแผงที่ไม่ใช่เชิงปริมาณ สัญญาณที่มีพลวัตสูง (ตัวอย่างเช่น ในเซลล์ร่างกายและเดนไดรต์) mtYFP ใช้ HyD เพื่อตรวจจับจำนวน PN ในโหมด BrightR ใช้การกำหนดช่วงเวลาตั้งแต่ 0.3 ถึง 6 ns เพื่อลดพื้นหลัง
การถ่ายภาพเซลล์ที่คัดแยกแบบเรียลไทม์ หลังจากคัดแยกเซลล์ในอาหารเลี้ยงเซลล์ Neurobasal-A ที่มีสารเสริม B27 1% และ GlutaMax 0.5 mM แล้ว เซลล์จะถูกนำไปเพาะเลี้ยงบนสไลด์แก้วเคลือบโพลี-แอล-ไลซีน (μ-Slide8 Well, Ibidi, หมายเลขแคตตาล็อก 80826) ทันที จากนั้นเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 37°C และ CO2 5% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้เซลล์เกาะติด การถ่ายภาพแบบเรียลไทม์ดำเนินการโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งคอนโฟคอล Leica SP8 ที่ติดตั้งเลเซอร์สีขาว เลนส์วัตถุ HyD 63× [ค่ารูรับแสงเชิงตัวเลข (NA) 1.4] และแท่นให้ความร้อน
หนูทดลองถูกทำให้สลบอย่างรวดเร็วด้วยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์และตัดหัวออก จากนั้นจึงนำสมองออกจากกะโหลกอย่างรวดเร็วและหั่นเป็นชิ้นบางๆ หนา 200 ไมโครเมตร (สำหรับการทดลองติดฉลาก 13C) หรือ 275 ไมโครเมตร (สำหรับการทดลองสองโฟตอน) ตามแนวตั้งฉากกับตัวหนู โดยบรรจุวัสดุต่อไปนี้ลงในชิ้นเนื้อสมอง ไอศกรีม (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) บรรจุด้วยสารต่อไปนี้: น้ำแข็งเย็นจัด 125 มิลลิโมลาร์ อิ่มตัวด้วยคาร์บอน (95% O2 และ 5% CO2) แคลเซียมต่ำ + ของเหลวไขสันหลังเทียม (ACSF) NaCl, KCl 2.5 มิลลิโมลาร์, สารละลายบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 1.25 มิลลิโมลาร์, NaHCO3 25 มิลลิโมลาร์, กลูโคส 25 มิลลิโมลาร์, CaCl2 0.5 มิลลิโมลาร์ และ MgCl2 3.5 มิลลิโมลาร์ (ความดันออสโมติก 310 ถึง 330 มิลลิโมล) นำชิ้นส่วนสมองที่ได้ไปใส่ในห้องบ่มก่อนที่มีแคลเซียมสูงกว่า + สารละลาย ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-กลูโคส, 1.0 mM CaCl2 และ 2.0 mM MgCl2) ที่ pH 7.4 และความเข้มข้น 310 ถึง 320 มิลลิโมล
ในระหว่างกระบวนการถ่ายภาพ ชิ้นเนื้อถูกย้ายไปยังห้องถ่ายภาพเฉพาะ และทำการทดลองภายใต้การไหลเวียนของ ACSF อย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิคงที่ 32° ถึง 33°C ใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนแบบมัลติโฟตอน (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ที่ติดตั้งเลนส์วัตถุ Leica 25x (NA 0.95, น้ำ) และเลเซอร์ Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) สำหรับการถ่ายภาพชิ้นเนื้อ และโมดูล FLIM (PicoHarp300, PicoQuant)
การวัด FLIM ของ Grx1-roGFP2 การเปลี่ยนแปลงสถานะรีดอกซ์ในไซโตพลาสซึมของเซลล์ประสาท PN ถูกวัดโดยใช้ FLIM แบบสองโฟตอนในชิ้นสมองตามแนวระนาบ โดยที่ไบโอเซนเซอร์ Grx1-roGFP2 กำหนดเป้าหมายไปที่เซลล์ประสาท PN ในชั้นเซลล์ประสาท PN เลือกบริเวณการเก็บข้อมูลประมาณ 50 ถึง 80 ไมโครเมตรใต้พื้นผิวของชิ้นสมอง เพื่อให้แน่ใจว่ามีเซลล์ประสาท PN ที่มีชีวิต (กล่าวคือ ไม่มีโครงสร้างเป็นเม็ดหรือการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ประสาทตามเดนไดรต์) และมีเซนเซอร์ roGFP2 บวกสองตัวและ AAV ที่เข้ารหัส shRNA PCx หรือลำดับควบคุม (แต่ละตัวแสดงออก mCherry ร่วมด้วย) เก็บภาพแบบสแต็กเดียวด้วยการซูมดิจิทัล 2 เท่า [ความยาวคลื่นกระตุ้น: 890 นาโนเมตร; 512 นาโนเมตร 512 พิกเซล] การตรวจจับ: ใช้ตัวกรอง HyD ภายใน, ตัวกรองฟลูออเรสซีนไอโซไทโอไซยาเนต (FITC) และการเฉลี่ยภาพภายใน 2 ถึง 3 นาที เพื่อให้แน่ใจว่ามีการรวบรวมโฟตอนเพียงพอ (รวม 1000 โฟตอน) สำหรับการปรับเส้นโค้ง ความไวของโพรบ Grx1-roGFP2 และการตรวจสอบเงื่อนไข FLIM ดำเนินการโดยการตรวจสอบค่าอายุการใช้งานของ roGFP2 เมื่อเติม H2O2 10 mM จากภายนอกลงใน ACSF ที่ใช้ในการให้สารอาหาร (เพื่อเพิ่มการออกซิเดชันให้สูงสุด ส่งผลให้อายุการใช้งานเพิ่มขึ้น) จากนั้นเติมไดไทโอไทรทอล 2 mM (เพื่อลดระดับการรีดักชันให้น้อยที่สุด ส่งผลให้อายุการใช้งานลดลง) (รูปที่ S8, D ถึง G) ใช้ซอฟต์แวร์ FLIMfit 5.1.1 ในการวิเคราะห์ผลลัพธ์ที่ได้มา ปรับเส้นโค้งการสลายตัวแบบเอกซ์โปเนนเชียลเดี่ยวของภาพทั้งหมดให้เข้ากับ IRF (ฟังก์ชันการตอบสนองของเครื่องมือ) ที่วัดได้ และ χ² มีค่าประมาณ 1 ในการคำนวณอายุการใช้งานของ PN เดี่ยว จะวาดมาสก์รอบตัวประสาทด้วยมือ และใช้อายุการใช้งานเฉลี่ยในแต่ละมาสก์สำหรับการหาปริมาณ
การวิเคราะห์ศักยภาพของไมโทคอนเดรีย หลังจากบ่มส่วนตัดเฉียบพลันด้วย TMRM ความเข้มข้น 100 nM ที่เติมลงใน ACSF ที่ไหลเวียนโดยตรงเป็นเวลา 30 นาทีแล้ว จึงทำการวัดการเปลี่ยนแปลงศักยภาพของไมโทคอนเดรียในเซลล์ Purkinje Somali (PNs) โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบสองโฟตอน การถ่ายภาพ TMRM ทำได้โดยการกระตุ้นโพรบที่ความยาวคลื่น 920 nm และใช้ HyD ภายใน (tetramethylrhodamine isothiocyanate: 585/40 nm) เพื่อเก็บสัญญาณ ส่วนการถ่ายภาพ mtYFP นั้น ใช้ความยาวคลื่นกระตุ้นเดียวกันแต่ใช้ HyD ภายในที่แตกต่างกัน (FITC: 525/50) ใช้ปลั๊กอิน Image Calculator ของ ImageJ เพื่อประเมินศักยภาพของไมโทคอนเดรียในระดับเซลล์เดี่ยว กล่าวโดยย่อ สมการของปลั๊กอิน: สัญญาณ = นาที (mtYFP, TMRM) ใช้ในการระบุบริเวณไมโทคอนเดรียที่แสดงสัญญาณ TMRM ในเซลล์ Purkinje Somali ในภาพคอนโฟคอลแบบเรียงซ้อนเดี่ยวของช่องสัญญาณที่เกี่ยวข้อง จากนั้น พื้นที่พิกเซลในมาสก์ที่ได้จะถูกวัดปริมาณ และปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับภาพสแต็กเดี่ยวที่มีค่าเกณฑ์ที่สอดคล้องกันของช่อง mtYFP เพื่อให้ได้สัดส่วนของไมโทคอนเดรียที่แสดงถึงศักยภาพของไมโทคอนเดรีย
ภาพถูกประมวลผลด้วยซอฟต์แวร์ Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) สำหรับภาพสแกนกระเบื้องนั้น จะทำการประกอบภาพกระเบื้องแต่ละแผ่นโดยใช้อัลกอริทึมการต่อภาพอัตโนมัติที่ซอฟต์แวร์ LAS-X จัดให้ หลังจากปรับเทียบภาพแล้ว ให้ใช้ ImageJ และ Adobe Photoshop เพื่อประมวลผลภาพเพิ่มเติมและปรับความสว่างและความคมชัดให้สม่ำเสมอ ใช้ Adobe Illustrator สำหรับการเตรียมงานกราฟิก
การวิเคราะห์จุดโฟกัสของ mtDNA จำนวนของรอยโรค mtDNA ถูกวัดปริมาณในส่วนของสมองน้อยที่ติดฉลากด้วยแอนติบอดีต่อ DNA โดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอล แต่ละพื้นที่เป้าหมายถูกสร้างขึ้นสำหรับตัวเซลล์และนิวเคลียสของแต่ละเซลล์ และคำนวณพื้นที่ที่เกี่ยวข้องโดยใช้ปลั๊กอิน Multi Measure (ซอฟต์แวร์ ImageJ) ลบพื้นที่นิวเคลียสออกจากพื้นที่ตัวเซลล์เพื่อให้ได้พื้นที่ไซโตพลาสซึม สุดท้าย ใช้ปลั๊กอิน Analyze Particles (ซอฟต์แวร์ ImageJ) เพื่อวัดปริมาณจุด DNA ในไซโตพลาสซึมที่บ่งชี้ mtDNA บนภาพเกณฑ์โดยอัตโนมัติ และผลลัพธ์ที่ได้ถูกปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับค่าเฉลี่ย PN ของหนู CTRL ผลลัพธ์แสดงเป็นจำนวนนิวคลีโอไซด์เฉลี่ยต่อเซลล์
การวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีน ใช้ปลั๊กอิน Image Calculator ของ ImageJ เพื่อประเมินการแสดงออกของโปรตีนใน PN ในระดับเซลล์เดี่ยว กล่าวโดยย่อ ในภาพคอนโฟคอลแบบชั้นเดียวของช่องสัญญาณที่เกี่ยวข้อง ผ่านสมการ: สัญญาณ = นาที (mtYFP, แอนติบอดี) จะสามารถระบุบริเวณไมโทคอนเดรียที่แสดงปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันต่อแอนติบอดีบางชนิดใน Purkina ได้ จากนั้นจะทำการวัดปริมาณพื้นที่พิกเซลในมาสก์ที่ได้ และปรับให้เป็นมาตรฐานบนภาพสแต็กเดี่ยวที่มีค่าเกณฑ์ที่สอดคล้องกันของช่องสัญญาณ mtYFP เพื่อให้ได้สัดส่วนของโปรตีนที่แสดงในไมโทคอนเดรีย
การวิเคราะห์ความหนาแน่นของเซลล์ Purkinje ใช้ปลั๊กอิน Cell Counter ของ ImageJ ในการประเมินความหนาแน่นของเซลล์ Purkinje โดยการหารจำนวนเซลล์ Purkinje ที่นับได้ด้วยความยาวของวงแหวนสมองน้อยที่เซลล์เหล่านั้นครอบครองอยู่
การเตรียมและการเก็บตัวอย่าง สมองจากกลุ่มควบคุมและหนู Mfn2cKO ถูกตรึงด้วยสารละลาย 2% PFA/2.5% กลูตารัลดีไฮด์ ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M (PB) จากนั้นจึงตัดเป็นชิ้นตามแนวขวางโดยใช้เครื่องตัดเนื้อเยื่อ (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (ความหนา 50 ถึง 60 μm) จากนั้นตรึงในบัฟเฟอร์ PB ที่มี 1% เตตระออกไซด์และ 1.5% โพแทสเซียมเฟอร์โรไซยาไนด์ ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ล้างชิ้นเนื้อด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง แล้วย้อมด้วยเอทานอล 70% ที่มี 1% ยูรานิลอะซิเตต เป็นเวลา 20 นาที จากนั้น นำชิ้นส่วนไปทำให้แห้งด้วยแอลกอฮอล์ที่มีความเข้มข้นต่างกัน และฝังในเรซินอีพ็อกซี Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, หมายเลขแคตตาล็อก 14040) ระหว่างแผ่นกระจกเคลือบซิลิคอน และสุดท้าย นำไปอบให้แข็งตัวที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เลือกบริเวณเปลือกสมองส่วนซีรีเบลลัม และตัดชิ้นส่วนบางพิเศษขนาด 50 นาโนเมตรด้วยเครื่อง Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) แล้ววางบนตะแกรงทองแดงขนาด 2×1 มม. ที่เคลือบด้วยฟิล์มโพลีสไตรีน ย้อมชิ้นส่วนด้วยสารละลายยูรานิลอะซิเตต 4% ในน้ำ เป็นเวลา 10 นาที ล้างด้วยน้ำหลายครั้ง จากนั้นย้อมด้วยเรย์โนลด์ลีดซิเตรตในน้ำ เป็นเวลา 10 นาที แล้วล้างด้วยน้ำหลายครั้ง ภาพถ่ายจุลทรรศน์อิเล็กตรอนได้มาจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านแสง Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) โดยใช้กล้องดิจิทัล TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ประเทศเยอรมนี
สำหรับหนูที่ติดเชื้อ AAV สมองจะถูกแยกและหั่นเป็นชิ้นบางๆ หนา 1 มม. ตามแนวตั้ง และตรวจสอบซีรีเบลลัมโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์เพื่อระบุวงแหวนที่ติดเชื้อ AAV (นั่นคือ วงแหวนที่แสดงออก mCherry) เฉพาะการทดลองที่การฉีด AAV ส่งผลให้ประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนในชั้นเซลล์ Purkinje สูงมาก (เช่น เกือบทั้งชั้น) ในวงแหวนซีรีเบลลัมอย่างน้อยสองวงที่ต่อเนื่องกันเท่านั้นที่จะถูกนำมาใช้ วงแหวนที่ได้รับการถ่ายทอดยีน AAV จะถูกตัดแยกด้วยกล้องจุลทรรศน์เพื่อทำการตรึงเนื้อเยื่อข้ามคืน (4% PFA และ 2.5% กลูตารัลดีไฮด์ในบัฟเฟอร์โคโคเอต 0.1 M) และดำเนินการต่อ สำหรับการฝังใน EPON เนื้อเยื่อที่ตรึงแล้วจะถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์โซเดียมโคโคเอต 0.1 M (Applichem) และบ่มด้วย 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) ในบัฟเฟอร์โซเดียมโคโคเอต 0.1 M (Applichem) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง จากนั้นล้างเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ทำซ้ำ 3 ครั้งด้วยบัฟเฟอร์โคคาไมด์ 0.1 M จากนั้นใช้เอทานอลความเข้มข้นที่เพิ่มขึ้นเรื่อยๆ บ่มสารละลายเอทานอลแต่ละชนิดที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 15 นาที เพื่อทำให้เนื้อเยื่อแห้ง นำเนื้อเยื่อไปแช่ในโพรพิลีนออกไซด์และบ่มค้างคืนใน EPON (Sigma-Aldrich) ที่อุณหภูมิ 4°C นำเนื้อเยื่อไปแช่ใน EPON สดที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง แล้วฝังในพาราฟินที่อุณหภูมิ 62°C เป็นเวลา 72 ชั่วโมง ใช้เครื่องตัดเนื้อเยื่อละเอียดพิเศษ (Leica Microsystems, UC6) และมีดเพชร (Diatome, Biel, Switzerland) ตัดชิ้นเนื้อบางพิเศษขนาด 70 นาโนเมตร ย้อมด้วยยูรานิลอะซิเตต 1.5% เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C และย้อมด้วยสารละลายตะกั่วซิเตรตเป็นเวลา 4 นาที ภาพถ่ายอิเล็กตรอนไมโครสโคปได้มาจากการใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่านแสง JEM-2100 Plus (JEOL) ที่ติดตั้งกล้อง Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) และซอฟต์แวร์ DigitalMicrograph (Gatan) สำหรับการวิเคราะห์ ภาพถ่ายอิเล็กตรอนไมโครสโคปถูกบันทึกด้วยการซูมดิจิทัล 5000 เท่า หรือ 10,000 เท่า
การวิเคราะห์ทางสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย สำหรับการวิเคราะห์ทั้งหมด เส้นขอบของไมโทคอนเดรียแต่ละตัวถูกวาดด้วยมือในภาพดิจิทัลโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ พารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาต่างๆ ได้รับการวิเคราะห์ ความหนาแน่นของไมโทคอนเดรียแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ที่ได้จากการหารพื้นที่ทั้งหมดของไมโทคอนเดรียในแต่ละเซลล์ด้วยพื้นที่ของไซโทพลาสซึม (พื้นที่ไซโทพลาสซึม = พื้นที่เซลล์ - พื้นที่นิวเคลียสของเซลล์) × 100 ความกลมของไมโทคอนเดรียคำนวณโดยใช้สูตร [4π∙(พื้นที่/เส้นรอบวง²)] สัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียได้รับการวิเคราะห์และแบ่งออกเป็นสองประเภท (“ทรงกระบอก” และ “ทรงกระบอก”) ตามรูปร่างหลักของมัน
การวิเคราะห์จำนวนและความหนาแน่นของออโตฟาโกโซม/ไลโซโซม ใช้โปรแกรม ImageJ ในการวาดเส้นขอบของออโตฟาโกโซม/ไลโซโซมแต่ละอันในภาพดิจิทัลด้วยตนเอง พื้นที่ของออโตฟาโกโซม/ไลโซโซมแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ โดยคำนวณจากการหารพื้นที่รวมของโครงสร้างออโตฟาโกโซม/ไลโซโซมในแต่ละเซลล์ด้วยพื้นที่ไซโตพลาสซึม (พื้นที่ไซโตพลาสซึม = พื้นที่เซลล์ - พื้นที่นิวเคลียส) × 100 ความหนาแน่นของออโตฟาโกโซม/ไลโซโซมคำนวณโดยการหารจำนวนรวมด้วยจำนวนโครงสร้างออโตฟาโกโซม/ไลโซโซมต่อเซลล์ (ในแง่ของพื้นที่ไซโตพลาสซึม) (พื้นที่ไซโตพลาสซึม = พื้นที่เซลล์ - พื้นที่นิวเคลียส)
การติดฉลากสำหรับการตัดชิ้นส่วนสมองเฉียบพลันและการเตรียมตัวอย่าง สำหรับการทดลองที่ต้องการการติดฉลากกลูโคส ให้ย้ายชิ้นส่วนสมองเฉียบพลันไปยังห้องบ่มล่วงหน้า ซึ่งประกอบด้วยคาร์บอนอิ่มตัว (95% O2 และ 5% CO2), แคลเซียมสูง + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM บัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-กลูโคส, 1.0 mM CaCl2 และ 2.0 mM MgCl2 ปรับ pH เป็น 7.4 และ 310 ถึง 320 mOsm) ซึ่งกลูโคสจะถูกแทนที่ด้วย 13C6-กลูโคส (Eurisotop, หมายเลขแคตตาล็อก CLM-1396) สำหรับการทดลองที่ต้องการการติดฉลากไพรูเวต ให้ย้ายชิ้นส่วนสมองที่เตรียมใหม่ไปยังสารละลาย ACSF ที่มี Ca2+ สูงกว่า (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-กลูโคส, 1.0 mM CaCl2 และเติม 2.0 mM MgCl2 ปรับ pH เป็น 7.4 และ 310 ถึง 320 mOsm) และเติม 1 mM 1-[1-13C]ไพรูเวต (Eurisotop, หมายเลขแคตตาล็อก CLM-1082) บ่มชิ้นส่วนเป็นเวลา 90 นาทีที่ 37°C เมื่อสิ้นสุดการทดลอง ชิ้นส่วนตัวอย่างถูกล้างอย่างรวดเร็วด้วยสารละลายในน้ำ (pH 7.4) ที่มีแอมโมเนียมคาร์บอเนต 75 mM จากนั้นนำไปบดให้เป็นเนื้อเดียวกันในอะซีโตไนไตรล์ (ACN): เมทานอล: น้ำ ในอัตราส่วน 40:40:20 (ปริมาตรต่อปริมาตร) หลังจากบ่มชิ้นส่วนตัวอย่างบนน้ำแข็งเป็นเวลา 30 นาที ตัวอย่างถูกนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 21,000 g เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C และส่วนที่เป็นของเหลวใสถูกทำให้แห้งในเครื่อง SpeedVac concentrator ก้อนเมตาบอไลต์แห้งที่ได้ถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่าจะถึงเวลาวิเคราะห์
การวิเคราะห์กรดอะมิโนที่ติดฉลาก 13C ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรี สำหรับการวิเคราะห์ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรี (LC-MS) เม็ดเมตาบอไลต์จะถูกแขวนลอยใหม่ในน้ำเกรด LC-MS 75 ไมโครลิตร (Honeywell) หลังจากปั่นเหวี่ยงที่ 21,000 g เป็นเวลา 5 นาทีที่อุณหภูมิ 4°C สารละลายใส 20 ไมโครลิตรจะถูกนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์การไหลของกรดอะมิโน ในขณะที่สารสกัดที่เหลือจะถูกนำไปใช้ทันทีสำหรับการวิเคราะห์แอนไอออน (ดูด้านล่าง) การวิเคราะห์กรดอะมิโนดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลการสร้างอนุพันธ์เบนโซอิลคลอไรด์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (55, 56) ขั้นตอนแรก เติมโซเดียมคาร์บอเนต 100 mM (Sigma-Aldrich) ปริมาณ 10 μl ลงในสารสกัดเมตาบอไลต์ 20 μl จากนั้นเติมเบนโซอิลคลอไรด์ 2% (Sigma-Aldrich) ปริมาณ 10 μl ลงในอะซีโตไนไตรล์ (ACN) เกรด LC ผสมให้เข้ากันด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยง (vortex) สักครู่ แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 21,000 g เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิ 20°C ถ่ายส่วนของเหลวใสที่ได้ลงในหลอดตัวอย่างอัตโนมัติขนาด 2 ml ที่มีตัวแทรกแก้วทรงกรวย (ปริมาตร 200 μl) นำตัวอย่างไปวิเคราะห์โดยใช้ระบบ LC ประสิทธิภาพสูงพิเศษ Acquity iClass (Waters) ที่เชื่อมต่อกับเครื่องแมสสเปกโทรเมตรีความแม่นยำสูงความละเอียดสูง Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific) สำหรับการวิเคราะห์ ฉีดตัวอย่างที่ผ่านการดัดแปลงแล้ว 2 ไมโครลิตร เข้าไปในคอลัมน์ซิลิกา T3 ความแข็งแรงสูง ขนาด 100×1.0 มม. (Waters) ที่บรรจุอนุภาคขนาด 1.8 ไมโครเมตร อัตราการไหลอยู่ที่ 100 ไมโครลิตร/นาที และระบบบัฟเฟอร์ประกอบด้วยบัฟเฟอร์ A (แอมโมเนียมฟอร์เมต 10 มิลลิโมลาร์ และกรดฟอร์มิก 0.15% ในน้ำ) และบัฟเฟอร์ B (ACN) การไล่ระดับความเข้มข้นเป็นดังนี้: 0% B ที่ 0 นาที; 0% B, 0 ถึง 15% B ที่ 0 ถึง 0.1 นาที; 15 ถึง 17% B ที่ 0.1 ถึง 0.5 นาที; 17 ถึง 55% B ที่ 0.5 ถึง 14 นาที; 55 ถึง 70% B ที่ 14 ถึง 14.5 นาที; 14.5 ถึง 70 ถึง 100% B ที่ 18 นาที; 100% B ที่ 18 ถึง 19 นาที; 100 ถึง 0% B ที่ 19 ถึง 19.1 นาที; 0% B ที่ 19.1 ถึง 28 นาที (55, 56) เครื่องสเปกโทรเมตรมวล QE-HF ทำงานในโหมดไอออนไนเซชันบวก โดยมีช่วงมวล m/z (อัตราส่วนมวลต่อประจุ) ตั้งแต่ 50 ถึง 750 ความละเอียดที่ใช้คือ 60,000 และเป้าหมายไอออนควบคุมการขยาย (AGC) ที่ได้คือ 3×10⁶ และเวลาไอออนสูงสุดคือ 100 มิลลิวินาที แหล่งกำเนิดไอออนไนเซชันแบบอิเล็กโทรสเปรย์ความร้อน (ESI) ทำงานที่แรงดันสเปรย์ 3.5 kV อุณหภูมิของท่อแคปิลลารี 250°C การไหลของอากาศหุ้ม 60 AU (หน่วยตามอำเภอใจ) และการไหลของอากาศเสริม 20 AU 250°C เลนส์ S ถูกตั้งค่าไว้ที่ 60 AU
การวิเคราะห์กรดอินทรีย์ที่ติดฉลาก 13C ด้วยเทคนิคแอนไอออนโครมาโทกราฟี-MS ตะกอนเมตาบอไลต์ที่เหลือ (55 μl) ถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบไอออนโครมาโทกราฟีของ Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ที่เชื่อมต่อกับเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี QE-HF (Thermo Fisher Scientific) โดยสรุปคือ ฉีดสารสกัดเมตาบอไลต์ 5 μl เข้าไปในคอลัมน์ Dionex IonPac AS11-HC ที่ติดตั้ง HPLC (2 มม. × 250 มม., ขนาดอนุภาค 4 μm, Thermo Fisher Scientific) ในโหมด push-in partial loop ด้วยอัตราส่วนการบรรจุ 1 และใช้คอลัมน์ป้องกัน Dionex IonPac AG11-HC (2 มม. x 50 มม., 4 μm, Thermo Fisher Scientific) รักษาอุณหภูมิคอลัมน์ไว้ที่ 30°C และตั้งค่าเครื่องป้อนตัวอย่างอัตโนมัติไว้ที่ 6°C ใช้คาร์ทริจโพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ที่บรรจุน้ำปราศจากไอออนเพื่อสร้างกราเดียนต์โพแทสเซียมไฮดรอกไซด์ผ่านเครื่องกำเนิดตัวชะล้าง การแยกสารเมตาบอไลต์ที่อัตราการไหล 380 ไมโครลิตร/นาที โดยใช้กราเดียนต์ดังต่อไปนี้: 0 ถึง 3 นาที, KOH 10 มิลลิโมลาร์; 3 ถึง 12 นาที, KOH 10 ถึง 50 มิลลิโมลาร์; 12 ถึง 19 นาที, KOH 50 ถึง 100 มิลลิโมลาร์; 19 ถึง 21 นาที, KOH 100 มิลลิโมลาร์; 21 ถึง 21.5 นาที, KOH 100 ถึง 10 มิลลิโมลาร์ จากนั้นปรับสมดุลคอลัมน์ใหม่ด้วย KOH 10 มิลลิโมลาร์ เป็นเวลา 8.5 นาที
สารเมตาบอไลต์ที่ถูกชะออกมาจะถูกผสมกับกระแสไอโซโพรพานอลเสริม 150 ไมโครลิตร/นาที หลังคอลัมน์ แล้วส่งไปยังเครื่องแมสสเปกโทรเมตรีความละเอียดสูงที่ทำงานในโหมดไอออนไนเซชันเชิงลบ เครื่อง MS ตรวจสอบช่วงมวลตั้งแต่ m/z 50 ถึง 750 ด้วยความละเอียด 60,000 AGC ถูกตั้งค่าเป็น 1×10⁶ และเวลาไอออนสูงสุดถูกตั้งไว้ที่ 100 มิลลิวินาที แหล่งกำเนิด ESI แบบให้ความร้อนทำงานที่แรงดันสเปรย์ 3.5 กิโลโวลต์ การตั้งค่าอื่นๆ ของแหล่งกำเนิดไอออนมีดังนี้: อุณหภูมิของแคปิลลารี 275°C; อัตราการไหลของก๊าซชีท 60 AU; อัตราการไหลของก๊าซเสริม 20 AU ที่ 300°C และการตั้งค่าเลนส์ S เป็น 60 AU
การวิเคราะห์ข้อมูลของเมตาบอไลต์ที่ติดฉลาก 13C ใช้ซอฟต์แวร์ TraceFinder (เวอร์ชัน 4.2, Thermo Fisher Scientific) สำหรับการวิเคราะห์ข้อมูลอัตราส่วนไอโซโทป มีการตรวจสอบเอกลักษณ์ของสารประกอบแต่ละชนิดโดยใช้สารประกอบอ้างอิงที่เชื่อถือได้และวิเคราะห์อย่างอิสระ เพื่อทำการวิเคราะห์การเสริมไอโซโทป พื้นที่ของโครมาโตแกรมไอออนที่สกัด (XIC) ของไอโซโทป 13C แต่ละตัว (Mn) จะถูกสกัดจาก [M + H] + โดยที่ n คือจำนวนคาร์บอนของสารประกอบเป้าหมาย ใช้ในการวิเคราะห์กรดอะมิโน หรือ [MH] + ใช้ในการวิเคราะห์แอนไอออน ความแม่นยำของมวลของ XIC น้อยกว่าห้าส่วนต่อล้าน และความแม่นยำของ RT คือ 0.05 นาที การวิเคราะห์การเสริมไอโซโทปทำได้โดยการคำนวณอัตราส่วนของไอโซโทปที่ตรวจพบแต่ละตัวต่อผลรวมของไอโซโทปทั้งหมดของสารประกอบที่เกี่ยวข้อง อัตราส่วนเหล่านี้จะแสดงเป็นค่าเปอร์เซ็นต์สำหรับแต่ละไอโซโทป และผลลัพธ์จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์โมลาร์ของการเสริมไอโซโทป (MPE) ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (42)
นำเซลล์ประสาทแช่แข็งมาบดให้เป็นเนื้อเดียวกันในเมทานอล 80% (v/v) ที่เย็นจัด เขย่า และบ่มที่อุณหภูมิ -20°C เป็นเวลา 30 นาที เขย่าตัวอย่างอีกครั้งและคนให้เข้ากันที่อุณหภูมิ +4°C เป็นเวลา 30 นาที นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ 21,000 g เป็นเวลา 5 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นเก็บส่วนของเหลวใสที่ได้และทำให้แห้งโดยใช้เครื่อง SpeedVac concentrator ที่อุณหภูมิ 25°C เพื่อนำไปวิเคราะห์ต่อไป ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ทำการวิเคราะห์ LC-MS กับกรดอะมิโนของเซลล์ที่คัดแยกแล้ว โดยใช้ TraceFinder (เวอร์ชัน 4.2, Thermo Fisher Scientific) ในการวิเคราะห์ข้อมูลโดยใช้มวลโมโนไอโซโทปของแต่ละสารประกอบ การปรับค่าควอนไทล์ของข้อมูลเมตาบอไลต์ทำโดยใช้ซอฟต์แวร์ preprocessCore (57)
การเตรียมชิ้นเนื้อ หนูทดลองถูกทำให้สลบอย่างรวดเร็วด้วยก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์และตัดหัว จากนั้นนำสมองออกจากกะโหลกอย่างรวดเร็ว และใช้มีดสั่นที่บรรจุน้ำแข็ง (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) ตัดสมองเป็นชิ้นตามแนวระนาบขนาด 300 ถึง 375 ไมโครเมตร การทำให้เป็นแก๊สด้วยคาร์บอนเย็น (95% O2 และ 5% CO2) แคลเซียมต่ำ + ACSF (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 และ 6.0 mM MgCl2 ปรับ pH เป็น 7.4 และ 310 ถึง 330 mOsm) นำชิ้นส่วนสมองที่ได้มาใส่ในห้องที่มี Ca2+ ACSF ที่มีความเข้มข้นสูงกว่า (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl2 และ 3.5 mM MgCl2) ที่ pH 7.4 และ 310 ถึง 320 mOsm เก็บชิ้นส่วนไว้ประมาณ 20 ถึง 30 นาที เพื่อให้ชิ้นส่วนคืนสภาพก่อนทำการบันทึก
การบันทึก ใช้แท่นวางกล้องจุลทรรศน์ที่มีห้องบันทึกแบบคงที่และเลนส์วัตถุแบบแช่น้ำ 20x (Scientifica) สำหรับการบันทึกทั้งหมด เซลล์ Purkinje ที่คาดว่าจะเป็นนั้นถูกระบุโดย (i) ขนาดของเซลล์ (ii) ตำแหน่งทางกายวิภาคของสมองน้อย และ (iii) การแสดงออกของยีนรายงาน mtYFP ที่เรืองแสง ปิเปตแบบแพทช์ที่มีความต้านทานปลาย 5 ถึง 11 เมกะโอห์ม ถูกดึงออกมาด้วยหลอดแก้วโบโรซิลิเกต (GB150-10, 0.86 มม. × 1.5 มม. × 100 มม., Science Products, Hofheim, Germany) และปิเปตแนวนอน Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA) การบันทึกทั้งหมดดำเนินการโดยใช้เครื่องขยายสัญญาณแพทช์แคลมป์ ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Germany) ซึ่งควบคุมโดยซอฟต์แวร์ Signal (เวอร์ชัน 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) การทดลองถูกบันทึกที่อัตราการสุ่มตัวอย่าง 12.5 kHz สัญญาณถูกกรองด้วยตัวกรองเบสเซลแบบผ่านสั้นสองตัวที่มีความถี่ตัดที่ 1.3 และ 10 กิโลเฮิร์ตซ์ ตามลำดับ ความจุของเมมเบรนและปิเปตได้รับการชดเชยโดยวงจรชดเชยโดยใช้ตัวขยายสัญญาณ การทดลองทั้งหมดดำเนินการภายใต้การควบคุมของกล้อง Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Germany) ซึ่งควบคุมโดยซอฟต์แวร์ Hokawo (เวอร์ชัน 2.8, Hamamatsu, Gerden, Germany)
การกำหนดค่าและการวิเคราะห์เซลล์ทั้งหมดตามปกติ ก่อนการบันทึก ให้เติมสารละลายภายในลงในปิเปต ซึ่งประกอบด้วยสารต่อไปนี้: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM โพแทสเซียมกลูโคเนต, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (Mg), 0.5 mM กัวโนซีนไตรฟอสเฟต (GTP) (Na) และ 10.0 mM ครีเอตินีนฟอสเฟต ปรับ pH เป็น 7.25 และความดันออสโมติกเป็น 290 mOsm (ซูโครส) ทันทีหลังจากใช้แรง 0 pA เพื่อทำให้เยื่อหุ้มเซลล์แตก จะทำการวัดศักย์ไฟฟ้าของเยื่อหุ้มเซลล์ขณะพัก วัดความต้านทานอินพุตโดยการใช้กระแสไฟฟ้าไฮเปอร์โพลาไรซ์ที่ -40, -30, -20 และ -10 pA วัดขนาดของการตอบสนองของแรงดันไฟฟ้า และใช้กฎของโอห์มในการคำนวณความต้านทานอินพุต บันทึกกิจกรรมที่เกิดขึ้นเองโดยธรรมชาติด้วยการควบคุมแรงดันไฟฟ้าเป็นเวลา 5 นาที และระบุและวัด sPSC ใน Igor Pro (เวอร์ชัน 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) โดยใช้สคริปต์การจดจำแบบกึ่งอัตโนมัติ วัดเส้นโค้ง IV และกระแสไฟฟ้าคงที่โดยการควบคุมแบตเตอรี่ที่ศักย์ไฟฟ้าต่าง ๆ (เริ่มต้นจาก -110 mV) และเพิ่มแรงดันไฟฟ้าทีละ 5 mV ทดสอบการสร้าง AP โดยการใช้กระแสไฟฟ้ากระตุ้น ควบคุมเซลล์ที่ -70 mV ในขณะที่ใช้กระแสไฟฟ้ากระตุ้น ปรับขนาดขั้นตอนของแต่ละหน่วยการบันทึกแยกกัน (10 ถึง 60 pA) คำนวณความถี่ AP สูงสุดโดยการนับจำนวนพัลส์ที่ทำให้เกิดความถี่ AP สูงสุดด้วยตนเอง วิเคราะห์เกณฑ์ AP โดยใช้ค่าอนุพันธ์อันดับสองของพัลส์กระตุ้นที่ทำให้เกิด AP อย่างน้อยหนึ่งตัว
การกำหนดค่าและการวิเคราะห์แพทช์แบบเจาะรู ทำการบันทึกแพทช์แบบเจาะรูโดยใช้โปรโตคอลมาตรฐาน ใช้ปิเปตที่ปราศจาก ATP และ GTP ซึ่งไม่มีส่วนประกอบต่อไปนี้: กลูโคเนต K 128 mM, KCl 10 mM, Hepes 10 mM, EGTA 0.1 mM และ MgCl2 2 mM และปรับ pH เป็น 7.2 (โดยใช้ KOH) งดเว้น ATP และ GTP จากสารละลายภายในเซลล์เพื่อป้องกันการซึมผ่านของเยื่อหุ้มเซลล์ที่ไม่สามารถควบคุมได้ เติมปิเปตแพทช์ด้วยสารละลายภายในที่มีแอมโฟเทอริซิน (ประมาณ 200 ถึง 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) เพื่อให้ได้บันทึกแพทช์แบบเจาะรู แอมโฟเทอริซินละลายในไดเมทิลซัลฟอกไซด์ (ความเข้มข้นสุดท้าย: 0.1 ถึง 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich) ความเข้มข้นของ DMSO ที่ใช้ไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อเซลล์ประสาทที่ศึกษา ในระหว่างกระบวนการเจาะเซลล์ประสาท ความต้านทานของช่องสัญญาณ (Ra) จะถูกตรวจสอบอย่างต่อเนื่อง และการทดลองจะเริ่มต้นหลังจากที่แอมพลิจูดของ Ra และ AP มีความเสถียรแล้ว (20-40 นาที) กิจกรรมที่เกิดขึ้นเองจะถูกวัดโดยใช้การควบคุมแรงดันไฟฟ้าและ/หรือกระแสไฟฟ้าเป็นเวลา 2 ถึง 5 นาที การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้ Igor Pro (เวอร์ชัน 7.05.2, WaveMetrics, สหรัฐอเมริกา), Excel (เวอร์ชัน 2010, Microsoft Corporation, Redmond, สหรัฐอเมริกา) และ GraphPad Prism (เวอร์ชัน 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) สหรัฐอเมริกา เพื่อระบุ AP ที่เกิดขึ้นเอง จะใช้ปลั๊กอิน NeuroMatic v3.0c ของ IgorPro ซึ่งจะระบุ AP โดยอัตโนมัติโดยใช้เกณฑ์ที่กำหนด ซึ่งจะถูกปรับแยกกันสำหรับแต่ละบันทึก โดยใช้ช่วงเวลาของสไปค์ จะกำหนดความถี่ของสไปค์ด้วยความถี่สไปค์ทันทีสูงสุดและความถี่สไปค์เฉลี่ย
การแยก PN โดยการปรับให้เข้ากับโปรโตคอลที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้ PN ได้รับการทำให้บริสุทธิ์จากซีรีเบลลัมของหนูในระยะที่กำหนด (58) โดยสรุปคือ ซีรีเบลลัมถูกผ่าและสับละเอียดในสารละลายแยกส่วนที่เย็นจัด [ปราศจาก HBSS Ca2+ และ Mg2+ เสริมด้วยกลูโคส 20 mM เพนิซิลลิน (50 U/ml) และสเตรปโตมัยซิน (0.05 mg/ml)] จากนั้นย่อยสารละลายในปาเปน [HBSS เสริมด้วย 1-ซิสเทอีน·HCl (1 mg/ml) ปาเปน (16 U/ml) และดีออกซีไรโบนิวคลีเอส I (DNase I; 0.1 mg/ml)] บำบัดเป็นเวลา 30 นาทีที่ 30°C ขั้นแรก ล้างเนื้อเยื่อในสารละลาย HBSS ที่มีเมือกไข่ (10 มก./มล.), BSA (10 มก./มล.) และ DNase (0.1 มก./มล.) ที่อุณหภูมิห้องเพื่อป้องกันการย่อยด้วยเอนไซม์ จากนั้น บดเนื้อเยื่อเบาๆ ในสารละลาย HBSS ที่มีกลูโคส 20 มิลลิโมลาร์ ผสมกับเพนิซิลลิน (50 ยูนิต/มล.), สเตรปโตมัยซิน (0.05 มก./มล.) และ DNase (0.1 มก./มล.) เพื่อแยกเซลล์เดี่ยวออกมา กรองสารละลายเซลล์ที่ได้ผ่านตะแกรงกรองเซลล์ขนาด 70 ไมโครเมตร จากนั้นปั่นแยกเซลล์ด้วยเครื่องเหวี่ยง (1110 รอบต่อนาที, 5 นาที, 4°C) และแขวนลอยเซลล์ใหม่ในสารละลายคัดแยก [HBSS เสริมด้วยกลูโคส 20 มิลลิโมลาร์, ซีรัมจากลูกวัว 20%, เพนิซิลลิน (50 ยูนิต/มล.) และสเตรปโตมัยซิน (0.05 มก./มล.)] ประเมินความมีชีวิตของเซลล์ด้วยโพรพิเดียมไอโอไดด์และปรับความหนาแน่นของเซลล์ให้เป็น 1×10⁶ ถึง 2×10⁶ เซลล์/มล. ก่อนทำการวิเคราะห์ด้วยเครื่องฟลูออโรไซโตเมตรี สารละลายแขวนลอยจะถูกกรองผ่านตะแกรงกรองเซลล์ขนาด 50 ไมโครเมตร
เครื่องวิเคราะห์เซลล์ด้วยแสงเลเซอร์ (Flow cytometer) ทำการคัดแยกเซลล์ที่อุณหภูมิ 4°C โดยใช้เครื่อง FACSAria III (BD Biosciences) และซอฟต์แวร์ FACSDiva (BD Biosciences, เวอร์ชัน 8.0.1) ทำการคัดแยกเซลล์โดยใช้หัวฉีดขนาด 100 μm ภายใต้ความดัน 20 psi ที่อัตราประมาณ 2800 เหตุการณ์/วินาที เนื่องจากเกณฑ์การคัดกรองแบบดั้งเดิม (ขนาดเซลล์ การแยกแยะแบบสองโหมด และลักษณะการกระเจิง) ไม่สามารถรับประกันการแยก PN ออกจากเซลล์ชนิดอื่นได้อย่างถูกต้อง จึงกำหนดกลยุทธ์การคัดกรองโดยอาศัยการเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างความเข้มของ YFP และการเรืองแสงอัตโนมัติในหนู mitoYFP+ ​​​​และหนูควบคุม mitoYFP − YFP ถูกกระตุ้นโดยการฉายแสงเลเซอร์ความยาวคลื่น 488 nm ไปที่ตัวอย่าง และตรวจจับสัญญาณโดยใช้ตัวกรองแบบแถบความถี่ 530/30 nm ในหนู mitoYFP+ ​​​​ความเข้มสัมพัทธ์ของยีนรายงาน Rosa26-mitoYFP ยังถูกนำมาใช้เพื่อแยกแยะส่วนของตัวเซลล์ประสาทและส่วนของแอกซอนด้วย 7-AAD ถูกกระตุ้นด้วยเลเซอร์สีเหลือง 561 นาโนเมตร และตรวจจับด้วยตัวกรองแบบแถบความถี่ 675/20 นาโนเมตร เพื่อแยกเซลล์ที่ตายแล้วออก ในขณะเดียวกัน เพื่อแยกเซลล์แอสโทรไซต์ สารละลายเซลล์ถูกย้อมด้วย ACSA-2-APC จากนั้นตัวอย่างถูกฉายแสงด้วยเลเซอร์ 640 นาโนเมตร และใช้ตัวกรองแบบแถบความถี่ 660/20 นาโนเมตร เพื่อตรวจจับสัญญาณ
เซลล์ที่เก็บรวบรวมได้ถูกแยกตะกอนโดยการปั่นเหวี่ยง (1110 รอบต่อนาที, 5 นาที, 4°C) และเก็บรักษาไว้ที่ -80°C จนกว่าจะใช้งาน หนู Mfn2cKO และลูกหนูในครอกเดียวกันจะถูกจัดกลุ่มในวันเดียวกันเพื่อลดความแปรปรวนของขั้นตอน การนำเสนอและการวิเคราะห์ข้อมูล FACS ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA)
ดังที่กล่าวไว้ข้างต้น (59) มีการใช้ PCR แบบเรียลไทม์เพื่อแยก DNA จากเซลล์ประสาทที่คัดแยกแล้วสำหรับการหาปริมาณ mtDNA ในภายหลัง ความเป็นเส้นตรงและความไวของเกณฑ์ได้รับการทดสอบเบื้องต้นโดยการทำ qPCR กับจำนวนเซลล์ที่แตกต่างกัน กล่าวโดยสรุปคือ รวบรวม PN จำนวน 300 เซลล์ในบัฟเฟอร์ไลซิสซึ่งประกอบด้วย tris-HCl 50 mM (pH 8.5), EDTA 1 mM, Tween 20 0.5% และโปรตีนเนส K (200 ng/ml) และบ่มที่ 55°C เป็นเวลา 120 นาที จากนั้นบ่มเซลล์ต่อที่ 95°C เป็นเวลา 10 นาทีเพื่อให้แน่ใจว่าโปรตีนเนส K ถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์ ใช้โพรบ TaqMan (Thermo Fisher) ที่จำเพาะต่อ mt-Nd1 ในการวัด mtDNA โดยใช้ PCR กึ่งเชิงปริมาณในระบบ 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) ยีน Science (หมายเลขแคตตาล็อก Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, หมายเลขแคตตาล็อก AIVI3E8) และ 18S (Thermo Fisher Scientific, หมายเลขแคตตาล็อก Hs99999901_s1)
การเตรียมตัวอย่างโปรตีโอม โดยการให้ความร้อนแก่สารละลายที่ 95°C เป็นเวลา 10 นาที และใช้คลื่นเสียงอัลตราโซนิกในบัฟเฟอร์ไลซิส [6 M กัวนิดีนคลอไรด์, 10 mM ทริส(2-คาร์บอกซีเอทิล) ฟอสฟีนไฮโดรคลอไรด์, 10 mM คลอโรอะเซตาไมด์ และ 100 mM ทริส-ไฮโดรคลอไรด์] สลายเซลล์ประสาทแช่แข็งใน HCl ด้วยเครื่อง Bioruptor (Diagenode) เป็นเวลา 10 นาที (พัลส์ 30 วินาที / ช่วงหยุด 30 วินาที) ตัวอย่างถูกเจือจาง 1:10 ใน 20 mM ทริส-ไฮโดรคลอไรด์ (pH 8.0) ผสมกับทริปซินโกลด์ 300 ng (Promega) และบ่มค้างคืนที่ 37°C เพื่อให้ย่อยสมบูรณ์ ในวันที่สอง ตัวอย่างถูกปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 g เป็นเวลา 20 นาที สารละลายส่วนบนถูกเจือจางด้วยกรดฟอร์มิก 0.1% และสารละลายถูกกำจัดเกลือออกด้วย StageTips ที่ทำขึ้นเอง ตัวอย่างถูกทำให้แห้งในเครื่อง SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) ที่อุณหภูมิ 45°C จากนั้นเปปไทด์ถูกแขวนลอยในกรดฟอร์มิก 0.1% ตัวอย่างทั้งหมดถูกเตรียมพร้อมกันโดยบุคคลเดียวกัน เพื่อวิเคราะห์ตัวอย่างแอสโทรไซต์ เปปไทด์ที่กำจัดเกลือแล้ว 4 ไมโครกรัมถูกติดฉลากด้วยแท็กมวลแบบคู่ (TMT10plex หมายเลขแคตตาล็อก 90110 Thermo Fisher Scientific) ด้วยอัตราส่วนเปปไทด์ต่อรีเอเจนต์ TMT เท่ากับ 1:20 สำหรับการติดฉลาก TMT นั้น นำรีเอเจนต์ TMT 0.8 มิลลิกรัม มาละลายในอะซิโตไนไตรล์ (ACN) ปราศจากน้ำ 70 ไมโครลิตร จากนั้นนำเปปไทด์ที่แห้งแล้วมาละลายใน TEAB (ไตรเอทิลแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต) 0.1 M 9 ไมโครลิตร แล้วเติมรีเอเจนต์ TMT ใน ACN 7 ไมโครลิตรลงไป ความเข้มข้นอยู่ที่ 43.75% หลังจากบ่มเป็นเวลา 60 นาที ให้หยุดปฏิกิริยาด้วยไฮดรอกซีลามีน 5% 2 ไมโครลิตร รวบรวมเปปไทด์ที่ติดฉลากแล้ว ทำให้แห้ง ละลายใหม่ในกรดฟอร์มิก (FA) 0.1% 200 ไมโครลิตร แบ่งออกเป็นสองส่วน แล้วกำจัดเกลือออกโดยใช้ StageTips ที่ทำขึ้นเอง โดยใช้เครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) ครึ่งหนึ่งของสารละลายสองส่วนถูกแยกส่วนบนคอลัมน์โครมาโทกราฟี Acquity ขนาด 1 มม. x 150 มม. ที่บรรจุด้วยอนุภาค C18 ขนาด 130 Å/1.7 μm (Waters, หมายเลขแคตตาล็อก SKU: 186006935) Thermo Fisher Scientific) แยกเปปไทด์ที่อัตราการไหล 30 μl/นาที โดยแยกจากบัฟเฟอร์ B 1% ถึง 50% เป็นเวลา 85 นาที ด้วยการไล่ระดับแบบขั้นบันไดเป็นเวลา 96 นาที จากบัฟเฟอร์ B 50% ถึง 95% เป็นเวลา 3 นาที จากนั้นเป็นเวลา 8 นาทีสำหรับบัฟเฟอร์ B 95% บัฟเฟอร์ A คือ 5% ACN และ 10 mM แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต (ABC) และบัฟเฟอร์ B คือ 80% ACN และ 10 mM ABC เก็บเศษส่วนทุกๆ 3 นาที แล้วรวมเข้าเป็นสองกลุ่ม (1 + 17, 2 + 18 เป็นต้น) จากนั้นทำให้แห้งในเครื่องปั่นเหวี่ยงสุญญากาศ
การวิเคราะห์ LC-MS/MS สำหรับการวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรี เปปไทด์ (หมายเลข r119.aq) ถูกแยกบนคอลัมน์วิเคราะห์ PicoFrit ขนาด 25 ซม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 75 ไมโครเมตร (เลนส์วัตถุใหม่ หมายเลขชิ้นส่วน PF7508250) ที่ติดตั้งด้วยตัวกลาง ReproSil-Pur 120 C18-AQ ขนาด 1.9 ไมโครเมตร (Dr. Maisch, วัสดุ) โดยใช้ EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, เยอรมนี) คอลัมน์ถูกรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 50°C บัฟเฟอร์ A และ B คือกรดฟอร์มิก 0.1% ในน้ำ และกรดฟอร์มิก 0.1% ในอะซีโตไนไตรล์ 80% ตามลำดับ เปปไทด์ถูกแยกจากบัฟเฟอร์ B 6% ถึง 31% เป็นเวลา 65 นาที และจากบัฟเฟอร์ B 31% ถึง 50% เป็นเวลา 5 นาที ด้วยอัตราการไหล 200 นาโนลิตร/นาที เปปไทด์ที่ถูกชะออกมาจะถูกวิเคราะห์ด้วยเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific) การวัดค่า m/z ของสารตั้งต้นเปปไทด์ทำด้วยความละเอียด 120,000 ในช่วง 350 ถึง 1500 m/z โดยใช้พลังงานการชนแบบนอร์มาไลซ์ 27% สารตั้งต้นที่แรงที่สุดที่มีสถานะประจุ 2 ถึง 6 จะถูกเลือกสำหรับการแตกตัวด้วยไอออนแทรปพลังงานสูง (HCD) ตั้งเวลาวงจรไว้ที่ 1 วินาที ค่า m/z ของชิ้นส่วนเปปไทด์ถูกวัดในไอออนแทรปโดยใช้เป้าหมาย AGC ที่เล็กที่สุดคือ 5×10⁴ และเวลาการฉีดสูงสุด 86 มิลลิวินาที หลังจากแตกตัวแล้ว สารตั้งต้นจะถูกใส่ไว้ในรายการยกเว้นแบบไดนามิกเป็นเวลา 45 วินาที เปปไทด์ที่ติดฉลาก TMT ถูกแยกบนคอลัมน์ Acclaim PepMap ขนาด 50 ซม. 75 ไมโครเมตร (Thermo Fisher Scientific, หมายเลขแคตตาล็อก 164942) และสเปกตรัมการเคลื่อนที่ถูกวิเคราะห์บนเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ที่ติดตั้งอุปกรณ์ไอออนรูปคลื่นอสมมาตรสนามสูง (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific) ซึ่งทำงานที่แรงดันชดเชยสองค่าคือ −50 และ −70 V MS3 ที่เลือกโดยอิงจากพรีเคอร์เซอร์การซิงโครไนซ์ถูกใช้สำหรับการวัดสัญญาณไอออนรายงาน TMT การแยกเปปไทด์ดำเนินการบน EASY-nLC 1200 โดยใช้การชะแบบไล่ระดับเชิงเส้น 90% ด้วยความเข้มข้นของบัฟเฟอร์ 6% ถึง 31%; บัฟเฟอร์ A คือ 0.1% FA และบัฟเฟอร์ B คือ 0.1% FA และ 80% ACN คอลัมน์วิเคราะห์ทำงานที่อุณหภูมิ 50°C ใช้โปรแกรม FreeStyle (เวอร์ชัน 1.6, Thermo Fisher Scientific) เพื่อแยกไฟล์ต้นฉบับตามแรงดันชดเชย FAIMS
การระบุและการหาปริมาณโปรตีน โดยใช้เครื่องมือค้นหา Andromeda ที่ผสานรวมอยู่ ข้อมูลต้นฉบับได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ MaxQuant เวอร์ชัน 1.5.2.8 (https://maxquant.org/) นอกเหนือจากลำดับ Cre recombinase และ YFP ที่ได้จาก Aequorea victoria แล้ว สเปกตรัมของชิ้นส่วนเปปไทด์ยังถูกค้นหาเพื่อหาลำดับมาตรฐานและลำดับไอโซฟอร์มของโปรตีโอมอ้างอิงของหนู (Proteome ID UP000000589 ดาวน์โหลดจาก UniProt ในเดือนพฤษภาคม 2017) การออกซิเดชันของเมไทโอนีนและการอะเซทิเลชันของโปรตีนที่ปลาย N-terminus ถูกกำหนดให้เป็นการดัดแปลงแบบแปรผัน การเมทิลเลชันของคาร์บาโมอิลของซิสเทอีนถูกกำหนดให้เป็นการดัดแปลงแบบคงที่ พารามิเตอร์การย่อยถูกตั้งค่าเป็น “specificity” และ “trypsin/P” จำนวนเปปไทด์และเรเซอร์เปปไทด์ขั้นต่ำที่ใช้ในการระบุโปรตีนคือ 1 จำนวนเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกันขั้นต่ำคือ 0 ภายใต้เงื่อนไขของการจับคู่แผนที่เปปไทด์ อัตราการระบุโปรตีนคือ 0.01 เปิดใช้งานตัวเลือก “Second Peptide” ใช้ตัวเลือก “match between runs” เพื่อถ่ายโอนการระบุที่สำเร็จระหว่างไฟล์ต้นฉบับที่แตกต่างกัน ใช้ค่าอัตราส่วนขั้นต่ำ LFQ เท่ากับ 1 สำหรับการหาปริมาณแบบไม่ใช้ฉลาก (LFQ) (60) ความเข้มของ LFQ จะถูกกรองสำหรับค่าที่ถูกต้องอย่างน้อยสองค่าในกลุ่มจีโนไทป์อย่างน้อยหนึ่งกลุ่มในแต่ละจุดเวลา และจะถูกขยายจากการกระจายแบบปกติที่มีความกว้าง 0.3 และเลื่อนลง 1.8 ใช้แพลตฟอร์มการคำนวณ Perseus (https://maxquant.net/perseus/) และ R (https://r-project.org/) เพื่อวิเคราะห์ผลลัพธ์ LFQ ใช้การทดสอบ t แบบสองทางปานกลางจากแพ็คเกจซอฟต์แวร์ limma สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกัน (61) การวิเคราะห์ข้อมูลเชิงสำรวจดำเนินการโดยใช้ ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally และ pheatmap ข้อมูลโปรตีโอมิกส์แบบ TMT ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ MaxQuant เวอร์ชัน 1.6.10.43 ค้นหาข้อมูลโปรตีโอมิกส์ดิบจากฐานข้อมูลโปรตีโอมิกส์ของมนุษย์ UniProt ซึ่งดาวน์โหลดเมื่อเดือนกันยายน 2018 การวิเคราะห์นี้รวมถึงปัจจัยการแก้ไขความบริสุทธิ์ของไอโซโทปที่ผู้ผลิตจัดให้ ใช้ limma ใน R สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกัน ข้อมูลต้นฉบับ ผลการค้นหาในฐานข้อมูล และขั้นตอนการทำงานและการวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดถูกจัดเก็บไว้ใน ProteomeXchange alliance ผ่านทางคลังข้อมูลพันธมิตร PRIDE ด้วยตัวระบุชุดข้อมูล PXD019690
การระบุหน้าที่การทำงานช่วยเสริมการวิเคราะห์ให้ดียิ่งขึ้น ใช้เครื่องมือ Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) เพื่อตรวจสอบความหลากหลายของคำศัพท์การระบุหน้าที่การทำงานของชุดข้อมูล ณ สัปดาห์ที่ 8 (รูปที่ 1) โดยสรุปคือ ใช้รายการโปรตีนเชิงปริมาณที่ได้จากการวิเคราะห์ข้อมูล LC-MS/MS (tandem mass spectrometry) โดยใช้เกณฑ์การกรองดังต่อไปนี้: เลือก Mus musculus เป็นสายพันธุ์และพื้นหลัง และเลือกหมวดหมู่ที่มีค่า P ที่ปรับโดย Benjamini สำหรับการเสริมความเข้มข้นที่ 0.05 หรือต่ำกว่า ถือว่ามีนัยสำคัญ สำหรับกราฟนี้ แสดงหมวดหมู่ส่วนเกินห้าอันดับแรกในแต่ละคลัสเตอร์ตามค่า P ที่ปรับแล้ว ทำการวิเคราะห์การแสดงออกของโปรตีนตามช่วงเวลาโดยใช้การทดสอบ t หลายครั้ง โดยใช้โปรแกรมการเพิ่มประสิทธิภาพเชิงเส้นสองขั้นตอนของ Benjamini, Krieger และ Yekutieli (Q = 5%) กับผู้สมัครที่สำคัญที่ระบุในแต่ละหมวดหมู่ และวิเคราะห์แต่ละแถวแยกกัน ไม่จำเป็นต้องใช้ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานที่สม่ำเสมอ
เพื่อเปรียบเทียบผลลัพธ์ของการศึกษานี้กับฐานข้อมูลที่เผยแพร่และสร้างแผนภาพเวนน์ในรูปที่ 1 เราได้รวมรายการโปรตีนเชิงปริมาณเข้ากับคำอธิบายประกอบ MitoCarta 2.0 (24) ใช้เครื่องมือออนไลน์ Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) เพื่อสร้างแผนภาพ
สำหรับข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับขั้นตอนทางสถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ โปรดดูส่วนที่เกี่ยวข้องในหัวข้อ วัสดุและวิธีการ สำหรับการทดลองอื่นๆ ทั้งหมด สามารถดูข้อมูลโดยละเอียดได้ในคำอธิบายภาพที่เกี่ยวข้อง เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ข้อมูลทั้งหมดแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SEM) และการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GraphPad Prism 8.1.2
สำหรับเอกสารประกอบเพิ่มเติมของบทความนี้ โปรดดูที่ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
บทความนี้เป็นบทความที่เข้าถึงได้โดยเสรี ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ซึ่งอนุญาตให้ใช้งาน แจกจ่าย และทำสำเนาซ้ำในสื่อใดๆ ก็ได้ ตราบใดที่การใช้งานขั้นสุดท้ายไม่ใช่เพื่อผลกำไรทางการค้า และข้อสมมติฐานคือผลงานต้นฉบับถูกต้อง อ้างอิง
หมายเหตุ: เราขอให้คุณระบุที่อยู่อีเมลของคุณก็เพื่อให้ผู้ที่คุณแนะนำไปยังเพจทราบว่าคุณต้องการให้พวกเขาเห็นอีเมลนั้นและไม่ใช่สแปม เราจะไม่เก็บรวบรวมที่อยู่อีเมลใดๆ ทั้งสิ้น
คำถามนี้ใช้เพื่อทดสอบว่าคุณเป็นผู้เยี่ยมชมหรือไม่ และเพื่อป้องกันการส่งสแปมโดยอัตโนมัติ
โดย E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ลาร์สัน
การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของเซลล์ประสาทที่ทำงานผิดปกติเผยให้เห็นว่าโปรแกรมการเผาผลาญถูกกระตุ้นขึ้นเพื่อต่อต้านการเสื่อมของเซลล์ประสาท
โดย E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. ลาร์สัน
การวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์ของเซลล์ประสาทที่ทำงานผิดปกติเผยให้เห็นว่าโปรแกรมการเผาผลาญถูกกระตุ้นขึ้นเพื่อต่อต้านการเสื่อมของเซลล์ประสาท
©2020 สมาคมอเมริกันเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ สงวนลิขสิทธิ์. AAAS เป็นหุ้นส่วนของ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef และ COUNTER วิทยาศาสตร์ก้าวหน้า ISSN 2375-2548