ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อผลลัพธ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันใหม่กว่า (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเราจะสามารถให้การสนับสนุนได้อย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีการจัดรูปแบบหรือ JavaScript
กรดโพรพิโอนิก (PPA) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาบทบาทของการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรียในความผิดปกติทางระบบประสาท เช่น กลุ่มอาการออทิสติก เป็นที่ทราบกันดีว่า PPA สามารถรบกวนกระบวนการสร้าง การเผาผลาญ และการหมุนเวียนของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของ PPA ต่อพลวัต การแบ่งตัว และการรวมตัวของไมโทคอนเดรียยังคงเป็นปัญหา เนื่องจากกลไกเหล่านี้มีความซับซ้อนและเปลี่ยนแปลงตามเวลา ในที่นี้ เราใช้เทคนิคการถ่ายภาพเชิงปริมาณแบบเสริมเพื่อตรวจสอบว่า PPA ส่งผลต่อโครงสร้างจุลภาค รูปร่าง และพลวัตของไมโทคอนเดรียในเซลล์ SH-SY5Y ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์ประสาทอย่างไร PPA (5 mM) ทำให้พื้นที่ของไมโทคอนเดรียลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.01) เส้นผ่านศูนย์กลางและเส้นรอบวงของเฟเรตลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) และพื้นที่ 2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.01) การวิเคราะห์ตำแหน่งเหตุการณ์ของไมโทคอนเดรียแสดงให้เห็นว่ามีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ของเหตุการณ์การแบ่งตัวและการรวมตัว ซึ่งช่วยรักษาความสมบูรณ์ของเครือข่ายไมโทคอนเดรียภายใต้สภาวะความเครียด นอกจากนี้ การแสดงออกของ mRNA ของ cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) และ OPA1 (p < 0.05) ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ สิ่งนี้แสดงให้เห็นถึงการปรับเปลี่ยนรูปร่าง การสร้าง และพลวัตของไมโทคอนเดรียเพื่อรักษาการทำงานภายใต้สภาวะความเครียด ข้อมูลของเราให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับผลกระทบของ PPA ต่อพลวัตของไมโทคอนเดรีย และเน้นย้ำถึงประโยชน์ของเทคนิคการถ่ายภาพสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับกลไกการควบคุมที่ซับซ้อนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อความเครียดของไมโทคอนเดรีย
ไมโตคอนเดรียเป็นส่วนสำคัญในหน้าที่ต่างๆ ของเซลล์ นอกเหนือจากบทบาทปกติในการผลิตพลังงานและการสังเคราะห์สารชีวภาพ การเผาผลาญของไมโตคอนเดรียเป็นตัวควบคุมหลักของการส่งสัญญาณแคลเซียม สมดุลการเผาผลาญและรีดอกซ์ การส่งสัญญาณการอักเสบ การเปลี่ยนแปลงทางพันธุกรรม การเพิ่มจำนวนเซลล์ การแบ่งเซลล์ และการตายของเซลล์ตามโปรแกรม¹ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง การเผาผลาญของไมโตคอนเดรียมีความสำคัญต่อการพัฒนา การอยู่รอด และการทำงานของเซลล์ประสาท และมีส่วนเกี่ยวข้องอย่างกว้างขวางในอาการต่างๆ ของพยาธิสภาพทางระบบประสาท^2,3,4
ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา สถานะการเผาผลาญได้กลายเป็นตัวควบคุมหลักของการสร้างเซลล์ประสาท การแยกแยะ การเจริญเติบโต และความยืดหยุ่นของเซลล์ประสาท5,6 เมื่อไม่นานมานี้ รูปร่างและพลวัตของไมโทคอนเดรียได้กลายเป็นองค์ประกอบที่สำคัญอย่างยิ่งของการแบ่งเซลล์ ซึ่งเป็นกระบวนการแบบไดนามิกที่รักษาสภาพของไมโทคอนเดรียที่แข็งแรงภายในเซลล์ พลวัตของไมโทคอนเดรียถูกควบคุมโดยเส้นทางที่ซับซ้อนซึ่งพึ่งพาซึ่งกันและกัน ตั้งแต่การสร้างไมโทคอนเดรียและพลังงานชีวภาพ ไปจนถึงการแบ่งตัว การรวมตัว การขนส่ง และการกำจัดไมโทคอนเดรีย7,8 การหยุดชะงักของกลไกแบบบูรณาการเหล่านี้จะทำให้การรักษาสภาพของเครือข่ายไมโทคอนเดรียที่แข็งแรงบกพร่อง และมีผลกระทบอย่างมากต่อการพัฒนาของระบบประสาท9,10 อันที่จริง การทำงานที่ผิดปกติของพลวัตของไมโทคอนเดรียพบได้ในความผิดปกติทางจิตเวช ความเสื่อมของระบบประสาท และพัฒนาการของระบบประสาทหลายอย่าง รวมถึงกลุ่มอาการออทิสติก (ASD)11,12
ASD เป็นความผิดปกติทางพัฒนาการของระบบประสาทที่มีความหลากหลายและมีโครงสร้างทางพันธุกรรมและเอพิเจเนติกส์ที่ซับซ้อน การถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ ASD นั้นเป็นที่ยอมรับกัน แต่สาเหตุทางโมเลกุลที่อยู่เบื้องหลังยังคงไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ ข้อมูลที่สะสมจากแบบจำลองก่อนคลินิก การศึกษาทางคลินิก และชุดข้อมูลโมเลกุลแบบมัลติโอมิกส์ให้หลักฐานที่เพิ่มขึ้นเกี่ยวกับการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรียใน ASD13,14 ก่อนหน้านี้เราได้ทำการตรวจคัดกรองการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอทั่วทั้งจีโนมในกลุ่มผู้ป่วย ASD และระบุยีนที่มีการเมทิลเลชั่นแตกต่างกันซึ่งรวมกลุ่มกันตามเส้นทางการเผาผลาญของไมโทคอนเดรีย15 ต่อมาเราได้รายงานการเมทิลเลชั่นที่แตกต่างกันของตัวควบคุมหลักของการสร้างและการทำงานของไมโทคอนเดรีย ซึ่งสัมพันธ์กับจำนวนสำเนา mtDNA ที่เพิ่มขึ้นและโปรไฟล์การเผาผลาญในปัสสาวะที่เปลี่ยนแปลงไปใน ASD16 ข้อมูลของเราให้หลักฐานที่เพิ่มขึ้นว่าการทำงานและภาวะสมดุลของไมโทคอนเดรียมีบทบาทสำคัญในพยาธิสรีรวิทยาของ ASD ดังนั้น การปรับปรุงความเข้าใจเชิงกลไกเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างพลวัต รูปทรง และการทำงานของไมโทคอนเดรีย จึงเป็นเป้าหมายสำคัญของการวิจัยอย่างต่อเนื่องเกี่ยวกับโรคทางระบบประสาทที่มีลักษณะเฉพาะคือความผิดปกติของไมโทคอนเดรียในระดับรอง
เทคนิคทางโมเลกุลมักถูกนำมาใช้เพื่อศึกษาบทบาทของยีนเฉพาะในการตอบสนองต่อความเครียดของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม วิธีการนี้อาจมีข้อจำกัดเนื่องจากกลไกการควบคุมการแบ่งเซลล์มีหลายแง่มุมและเปลี่ยนแปลงตามเวลา นอกจากนี้ การแสดงออกที่แตกต่างกันของยีนไมโทคอนเดรียเป็นตัวบ่งชี้ทางอ้อมของการเปลี่ยนแปลงการทำงาน โดยเฉพาะอย่างยิ่งเนื่องจากโดยทั่วไปแล้วมีการวิเคราะห์ยีนเพียงจำนวนจำกัดเท่านั้น ดังนั้นจึงมีการเสนอวิธีการที่ตรงกว่าสำหรับการศึกษาการทำงานและชีวพลังงานของไมโทคอนเดรีย¹⁷ สัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียมีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับพลวัตของไมโทคอนเดรีย รูปร่าง การเชื่อมต่อ และโครงสร้างของไมโทคอนเดรียมีความสำคัญต่อการผลิตพลังงานและการอยู่รอดของไมโทคอนเดรียและเซลล์^5,18 ยิ่งไปกว่านั้น ส่วนประกอบต่างๆ ของการแบ่งเซลล์มุ่งเน้นไปที่การเปลี่ยนแปลงในสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย ซึ่งอาจทำหน้าที่เป็นจุดสิ้นสุดที่มีประโยชน์ของการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรียและเป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาเชิงกลไกในภายหลัง
สามารถสังเกตสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียได้โดยตรงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) ซึ่งช่วยให้สามารถศึกษาโครงสร้างระดับจุลภาคของเซลล์ได้อย่างละเอียด TEM สามารถมองเห็นสัณฐานวิทยา รูปร่าง และโครงสร้างของครีสตาของไมโทคอนเดรียได้โดยตรงที่ความละเอียดของไมโทคอนเดรียแต่ละตัว แทนที่จะอาศัยเพียงแค่การถอดรหัสยีน การแสดงออกของโปรตีน หรือพารามิเตอร์การทำงานของไมโทคอนเดรียในประชากรเซลล์17,19,20 นอกจากนี้ TEM ยังช่วยอำนวยความสะดวกในการศึกษาปฏิสัมพันธ์ระหว่างไมโทคอนเดรียและออร์แกเนลล์อื่นๆ เช่น เอนโดพลาสมิกเรติคูลัมและออโตฟาโกโซม ซึ่งมีบทบาทสำคัญในการทำงานและภาวะสมดุลของไมโทคอนเดรีย21,22 ดังนั้น TEM จึงเป็นจุดเริ่มต้นที่ดีสำหรับการศึกษาความผิดปกติของไมโทคอนเดรียก่อนที่จะมุ่งเน้นไปที่เส้นทางหรือยีนเฉพาะ เนื่องจากหน้าที่ของไมโตคอนเดรียมีความเกี่ยวข้องกับพยาธิวิทยาของระบบประสาทมากขึ้นเรื่อยๆ จึงมีความจำเป็นอย่างยิ่งที่จะต้องสามารถศึกษาลักษณะทางกายภาพและพลวัตของไมโตคอนเดรียในแบบจำลองเซลล์ประสาทในหลอดทดลองได้โดยตรงและในเชิงปริมาณ
ในบทความนี้ เราจะตรวจสอบพลวัตของไมโทคอนเดรียในแบบจำลองเซลล์ประสาทของความผิดปกติของไมโทคอนเดรียในภาวะออทิสติกสเปกตรัม ก่อนหน้านี้เราได้รายงานการเมทิลเลชันที่แตกต่างกันของโพรพิโอนิล-โคเอ็นไซม์คาร์บอกซิเลสเบตา (PCCB) ใน ASD15 ซึ่งเป็นหน่วยย่อยของเอนไซม์โพรพิโอนิล-โคเอ็นไซม์คาร์บอกซิเลส PCC ในไมโทคอนเดรีย การทำงานที่ผิดปกติของ PCC เป็นที่ทราบกันดีว่าทำให้เกิดการสะสมที่เป็นพิษของอนุพันธ์โพรพิโอนิล รวมถึงกรดโพรพิโอนิก (PPA)23,24,25 PPA ได้รับการพิสูจน์แล้วว่ารบกวนการเผาผลาญของเซลล์ประสาทและเปลี่ยนแปลงพฤติกรรมในร่างกาย และเป็นแบบจำลองสัตว์ที่ได้รับการยอมรับสำหรับการศึกษาเกี่ยวกับกลไกการพัฒนาของระบบประสาทที่เกี่ยวข้องกับ ASD26,27,28 นอกจากนี้ ยังมีรายงานว่า PPA รบกวนศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรีย การสร้าง และการหายใจในหลอดทดลอง และถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการสร้างแบบจำลองความผิดปกติของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาท29,30 อย่างไรก็ตาม ผลกระทบของการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก PPA ต่อรูปร่างและพลวัตของไมโทคอนเดรียยังคงเป็นที่เข้าใจได้ไม่ดีนัก
การศึกษานี้ใช้เทคนิคการถ่ายภาพเสริมเพื่อวัดผลกระทบของ PPA ต่อรูปร่าง พลวัต และการทำงานของไมโทคอนเดรียในเซลล์ SH-SY5Y ประการแรก เราได้พัฒนาวิธีการ TEM เพื่อแสดงภาพการเปลี่ยนแปลงในรูปร่างและโครงสร้างระดับจุลภาคของไมโทคอนเดรีย17,31,32 เนื่องจากไมโทคอนเดรียมีลักษณะเป็นพลวัต33 เราจึงใช้การวิเคราะห์ตัวระบุตำแหน่งเหตุการณ์ไมโทคอนเดรีย (MEL) เพื่อวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงในความสมดุลระหว่างเหตุการณ์การแบ่งตัวและการรวมตัว จำนวนและปริมาตรของไมโทคอนเดรียภายใต้ความเครียดจาก PPA สุดท้าย เราได้ตรวจสอบว่ารูปร่างและพลวัตของไมโทคอนเดรียมีความสัมพันธ์กับการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง การแบ่งตัว และการรวมตัวหรือไม่ โดยรวมแล้ว ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นถึงความท้าทายในการอธิบายความซับซ้อนของกลไกที่ควบคุมพลวัตของไมโทคอนเดรีย เราเน้นย้ำถึงประโยชน์ของ TEM ในการศึกษาลักษณะทางสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย ซึ่งเป็นจุดสิ้นสุดที่วัดได้ของการแบ่งเซลล์ในเซลล์ SH-SY5Y นอกจากนี้ เรายังเน้นย้ำว่าข้อมูลจาก TEM ให้ข้อมูลที่สมบูรณ์ที่สุดเมื่อรวมกับเทคนิคการถ่ายภาพที่สามารถบันทึกเหตุการณ์แบบไดนามิกที่เกิดขึ้นจากการตอบสนองต่อความเครียดทางเมตาบอลิซึม การศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกการควบคุมระดับโมเลกุลที่สนับสนุนการแบ่งเซลล์ของเซลล์ประสาทอาจให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับองค์ประกอบของไมโทคอนเดรียในระบบประสาทและโรคความเสื่อมของระบบประสาท
เพื่อกระตุ้นให้เกิดภาวะเครียดในไมโทคอนเดรีย เซลล์ SH-SY5Y ถูกบำบัดด้วย PPA โดยใช้โซเดียมโพรพิโอเนต (NaP) ความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM ก่อนการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) ตัวอย่างถูกนำไปเตรียมตัวอย่างด้วยความเย็นจัดโดยใช้การแช่แข็งด้วยแรงดันสูงและการแช่แข็ง (รูปที่ 1a) เราได้พัฒนาระบบวิเคราะห์ภาพไมโทคอนเดรียแบบอัตโนมัติเพื่อวัดพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาแปดประการของประชากรไมโทคอนเดรียในตัวอย่างทางชีววิทยา 3 ชุด เราพบว่าการบำบัดด้วย PPA ทำให้พารามิเตอร์สี่อย่างเปลี่ยนแปลงไปอย่างมีนัยสำคัญ ได้แก่ พื้นที่ 2, พื้นที่, เส้นรอบวง และเส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรต (รูปที่ 1b–e) พื้นที่ 2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งในการบำบัดด้วย PPA ความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM (p = 0.0183 และ p = 0.002 ตามลำดับ) (รูปที่ 1b) ในขณะที่พื้นที่ (p = 0.003), เส้นรอบวง (p = 0.0106) และเส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรตลดลงอย่างมีนัยสำคัญทั้งหมด พบว่ามีการลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p = 0.0172) ในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย PPA 5 mM เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 1c–e) การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของพื้นที่และเส้นรอบวงแสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย PPA 5 mM มีไมโทคอนเดรียที่เล็กลงและกลมขึ้น และไมโทคอนเดรียเหล่านี้มีความยาวน้อยกว่าในเซลล์ควบคุม ซึ่งสอดคล้องกับการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของเส้นผ่านศูนย์กลาง Feret ซึ่งเป็นพารามิเตอร์อิสระที่บ่งชี้ถึงการลดลงของระยะห่างที่ใหญ่ที่สุดระหว่างขอบอนุภาค มีการสังเกตการเปลี่ยนแปลงในโครงสร้างระดับจุลภาคของคริสเต้: คริสเต้มีความเด่นชัดน้อยลงภายใต้อิทธิพลของความเครียดจาก PPA (รูปที่ 1a แผง B) อย่างไรก็ตาม ภาพบางภาพไม่ได้สะท้อนโครงสร้างระดับจุลภาคของคริสเต้อย่างชัดเจน ดังนั้นจึงไม่ได้ทำการวิเคราะห์เชิงปริมาณของการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้ ข้อมูล TEM เหล่านี้อาจสะท้อนถึงสถานการณ์ที่เป็นไปได้สามประการ: (1) PPA เพิ่มการแบ่งตัวหรือยับยั้งการรวมตัว ทำให้ไมโทคอนเดรียที่มีอยู่หดตัวลง (2) การสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ที่เพิ่มขึ้นจะสร้างไมโทคอนเดรียขนาดเล็กกว่าเดิม หรือ (3) กระตุ้นกลไกทั้งสองพร้อมกัน แม้ว่าเงื่อนไขเหล่านี้จะไม่สามารถแยกแยะได้ด้วย TEM แต่การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่สำคัญบ่งชี้ถึงการเปลี่ยนแปลงในภาวะสมดุลและพลวัตของไมโทคอนเดรียภายใต้ความเครียดของ PPA เราจึงได้สำรวจพารามิเตอร์เพิ่มเติมเพื่อกำหนดลักษณะพลวัตเหล่านี้และกลไกที่เป็นไปได้ที่อยู่เบื้องหลังต่อไป
กรดโพรพิโอนิก (PPA) ปรับเปลี่ยนรูปร่างของไมโทคอนเดรีย (a) ภาพถ่ายจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) แสดงให้เห็นว่าขนาดของไมโทคอนเดรียลดลงและมีขนาดเล็กลงและกลมขึ้นเมื่อเพิ่มความเข้มข้นของ PPA โดยมีค่า 0 mM (ไม่ได้รับการรักษา), 3 mM และ 5 mM ตามลำดับ ลูกศรสีแดงชี้ไปยังไมโทคอนเดรีย (b–e) เซลล์ SH-SY5Y ที่ได้รับการรักษาด้วย PPA เป็นเวลา 24 ชั่วโมงถูกเตรียมสำหรับการถ่ายภาพด้วย TEM และวิเคราะห์ผลลัพธ์โดยใช้ Fiji/ImageJ พารามิเตอร์สี่ในแปดตัวแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเซลล์ควบคุม (ไม่ได้รับการรักษา, 0 mM PPA) และเซลล์ที่ได้รับการรักษา (3 mM และ 5 mM PPA) (b) บริเวณที่ 2, (c) พื้นที่, (d) เส้นรอบวง, (e) เส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรต การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ควบคุมเทียบกับการรักษา) และการทดสอบเปรียบเทียบหลายกลุ่มของดันเน็ตต์ถูกใช้เพื่อกำหนดความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) จุดข้อมูลแสดงถึงค่าเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียในแต่ละเซลล์ และแถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงถึงค่าเฉลี่ย ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SEM) ข้อมูลที่แสดงเป็นข้อมูลจาก n = 3 โดยมีเซลล์อย่างน้อย 24 เซลล์ต่อชุดการทดลอง มีการวิเคราะห์ภาพทั้งหมด 266 ภาพ * แสดงถึง p < 0.05, ** แสดงถึง p < 0.01
เพื่อศึกษาลักษณะเฉพาะของการตอบสนองของไมโทคอนเดรียต่อ PPA อย่างละเอียดมากขึ้น เราจึงย้อมไมโทคอนเดรียด้วยเทตราเมทิลโรดามีนเอทิลเอสเทอร์ (TMRE) และใช้กล้องจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์และการวิเคราะห์ MEL เพื่อระบุตำแหน่งและปริมาณของไมโทคอนเดรียหลังจาก 24 ชั่วโมงที่ความเข้มข้นของ PPA 3 และ 5 mM (รูปที่ 2a) หลังจากวิเคราะห์ MEL แล้ว ไมโทคอนเดรียจะถูกวิเคราะห์เพิ่มเติมเพื่อหาปริมาณจำนวนโครงสร้างของไมโทคอนเดรียและปริมาตรเฉลี่ยของพวกมัน เราสังเกตเห็นการเพิ่มขึ้นเล็กน้อยแต่มีนัยสำคัญของจำนวนเหตุการณ์การแบ่งตัวที่เกิดขึ้นที่ 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] เมื่อเทียบกับการแบ่งตัว [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)] และการรวมตัว [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] และการรวมตัว [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ 5 mM เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3b) จำนวนไมโทคอนเดรียเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทั้งที่ 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] และ 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (รูปที่ 3c) ในขณะที่ปริมาตรเฉลี่ยของโครงสร้างไมโทคอนเดรียแต่ละอันยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 3c) 3d) โดยรวมแล้ว สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการปรับเปลี่ยนพลวัตของไมโทคอนเดรียทำหน้าที่เป็นการตอบสนองเชิงชดเชยที่ช่วยรักษาความสมบูรณ์ของเครือข่ายไมโทคอนเดรียได้อย่างมีประสิทธิภาพ การเพิ่มขึ้นของจำนวนการแบ่งตัวที่ความเข้มข้น 3 mM ของ PPA บ่งชี้ว่าการเพิ่มขึ้นของจำนวนไมโทคอนเดรียส่วนหนึ่งเกิดจากการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรีย แต่เนื่องจากปริมาตรเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียยังคงไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ การสร้างไมโทคอนเดรียใหม่จึงไม่สามารถตัดออกไปได้ว่าเป็นการตอบสนองเชิงชดเชยเพิ่มเติม อย่างไรก็ตาม ข้อมูลเหล่านี้สอดคล้องกับโครงสร้างไมโทคอนเดรียขนาดเล็กและกลมที่สังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) และยังแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญในพลวัตของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก PPA ด้วย
กรดโพรพิโอนิก (PPA) กระตุ้นการปรับโครงสร้างไมโทคอนเดรียแบบไดนามิกเพื่อรักษาความสมบูรณ์ของเครือข่าย เซลล์ SH-SY5Y ถูกเพาะเลี้ยงและบำบัดด้วย PPA ความเข้มข้น 3 และ 5 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นย้อมด้วย TMRE และ Hoechst 33342 ตามด้วยการวิเคราะห์ MEL (a) ภาพถ่ายกล้องจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์ที่เป็นตัวแทน แสดงภาพสีและภาพฉายความเข้มสูงสุดแบบไบนารีที่เวลา 2 (t2) สำหรับแต่ละสภาวะ บริเวณที่เลือกซึ่งระบุไว้ในแต่ละภาพไบนารีจะถูกขยายและแสดงในรูปแบบ 3 มิติที่เฟรมเวลาที่แตกต่างกันสามเฟรม (t1-t3) เพื่อแสดงให้เห็นถึงพลวัตเมื่อเวลาผ่านไป เหตุการณ์การรวมตัวจะถูกเน้นด้วยสีเขียว เหตุการณ์การแยกตัวจะถูกเน้นด้วยสีเขียว แสดงด้วยสีแดง (b) จำนวนเฉลี่ยของเหตุการณ์ไดนามิกต่อสภาวะ (c) จำนวนเฉลี่ยของโครงสร้างไมโทคอนเดรียต่อเซลล์ (d) ปริมาตรเฉลี่ย (µm3) ของแต่ละโครงสร้างไมโทคอนเดรียต่อเซลล์ ข้อมูลที่แสดงเป็นตัวแทนของเซลล์ n = 15 เซลล์ต่อกลุ่มการรักษา แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) แถบมาตราส่วน = 10 μm, * p < 0.05
กรดโพรพิโอนิก (PPA) ทำให้เกิดการยับยั้งการถอดรหัสของยีนที่เกี่ยวข้องกับพลวัตของไมโทคอนเดรีย เซลล์ SH-SY5Y ได้รับการบำบัดด้วย PPA ที่ความเข้มข้น 3 และ 5 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง การหาปริมาณยีนสัมพัทธ์ทำได้โดยใช้ RT-qPCR และปรับค่าให้เป็นมาตรฐานเทียบกับ B2M ยีนที่เกี่ยวข้องกับการสร้างไมโทคอนเดรีย (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 และ (d) NFE2L2 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการรวมตัวและการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรีย (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 และ (i) DRP1 ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05) ได้รับการทดสอบโดยใช้ ANOVA แบบทางเดียว (กลุ่มควบคุมเทียบกับกลุ่มทดลอง) และการทดสอบเปรียบเทียบหลายกลุ่มของ Dunnett: * แสดงถึง p < 0.05, ** แสดงถึง p < 0.01 และ **** แสดงถึง p < 0.0001 แท่งกราฟแสดงค่าเฉลี่ยการแสดงออก ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM) ข้อมูลที่แสดงเป็นข้อมูลตัวอย่างทางชีววิทยาจำนวน n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) และ n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) ตามลำดับ
ข้อมูลจากการวิเคราะห์ด้วย TEM และ MEL บ่งชี้ว่า PPA เปลี่ยนแปลงรูปร่างและพลวัตของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม เทคนิคการถ่ายภาพเหล่านี้ไม่ได้ให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับกลไกพื้นฐานที่ขับเคลื่อนกระบวนการเหล่านี้ ดังนั้นเราจึงตรวจสอบการแสดงออกของ mRNA ของตัวควบคุมหลัก 9 ตัวของพลวัต การสร้าง และการแบ่งเซลล์ของไมโทคอนเดรีย ในการตอบสนองต่อการรักษาด้วย PPA เราวัดปริมาณของยีนมะเร็งไมอีโลมาเซลล์ (cMYC), ปัจจัยการหายใจในนิวเคลียส (NRF1), ปัจจัยการถอดรหัสไมโทคอนเดรีย 1 (TFAM), ปัจจัยการถอดรหัสคล้าย NFE2 BZIP (NFE2L2), โปรตีนคล้ายแกสตริน 2 (STOML2), โปรตีนฝ่อเส้นประสาทตา 1 (OPA1), ไมโทฟิวซิน 1 (MFN1), ไมโทฟิวซิน 2 (MFN2) และโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับไดนามิน 1 (DRP1) หลังจากได้รับการรักษาด้วย PPA ความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เราสังเกตพบการรักษาด้วย PPA ที่ความเข้มข้น 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 และ p < 0.0001 ตามลำดับ) และ 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) (รูปที่ 3a–c) การลดลงของการแสดงออกของ mRNA ขึ้นอยู่กับปริมาณยา: การแสดงออกของ cMYC, NRF1 และ TFAM ลดลง 5.7, 2.6 และ 1.9 เท่าที่ความเข้มข้น 3 mM ตามลำดับ และลดลง 11.2, 3 และ 2.2 เท่าที่ความเข้มข้น 5 mM ในทางตรงกันข้าม ยีน NFE2L2 ซึ่งเป็นยีนสำคัญในการสร้างรีดอกซ์ ไม่เปลี่ยนแปลงที่ความเข้มข้นใดๆ ของ PPA แม้ว่าจะสังเกตเห็นแนวโน้มการลดลงของการแสดงออกที่ขึ้นอยู่กับปริมาณยาเช่นเดียวกัน (รูปที่ 3d)
นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบการแสดงออกของยีนคลาสสิกที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการแบ่งตัวและการรวมตัวของไมโทคอนเดรีย STOML2 เชื่อว่ามีส่วนเกี่ยวข้องกับการรวมตัว ไมโทฟาจี และการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ และการแสดงออกของยีนนี้ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.0001) ที่ความเข้มข้น 3 mM (ลดลง 2.4 เท่า) และ 5 mM (ลดลง 2.8 เท่า) ของ PPA (รูปที่ 1) 3d) ในทำนองเดียวกัน การแสดงออกของยีนรวมตัว OPA1 ลดลงที่ความเข้มข้น 3 mM (ลดลง 1.6 เท่า) และ 5 mM (ลดลง 1.9 เท่า) ของ PPA (p = 0.006 และ p = 0.0024 ตามลำดับ) (รูปที่ 3f) อย่างไรก็ตาม เราไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในการแสดงออกของยีนรวมตัว MFN1, MFN2 หรือยีนแบ่งตัว DRP1 ภายใต้ความเครียดจาก PPA เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (รูปที่ 3g–i) นอกจากนี้ เราพบว่าระดับของโปรตีนที่เกี่ยวข้องกับการรวมตัวและการแยกตัวของไมโทคอนเดรีย 4 ชนิด (OPA1, MFN1, MFN2 และ DRP1) ไม่เปลี่ยนแปลงภายใต้สภาวะเดียวกัน (รูปที่ 4a–d) สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ ข้อมูลเหล่านี้สะท้อนถึงช่วงเวลาหนึ่งๆ และอาจไม่สะท้อนถึงการเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของโปรตีนหรือระดับกิจกรรมในช่วงเริ่มต้นของภาวะเครียดจาก PPA อย่างไรก็ตาม การลดลงอย่างมีนัยสำคัญของการแสดงออกของ cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 และ OPA1 บ่งชี้ถึงการควบคุมการถอดรหัสที่ผิดปกติอย่างมีนัยสำคัญของกระบวนการเผาผลาญ การสร้าง และพลวัตของไมโทคอนเดรีย นอกจากนี้ ข้อมูลเหล่านี้ยังเน้นย้ำถึงประโยชน์ของเทคนิคการถ่ายภาพเพื่อศึกษาการเปลี่ยนแปลงของหน้าที่ของไมโทคอนเดรียในขั้นสุดท้ายโดยตรง
ระดับโปรตีนของปัจจัยการรวมตัวและการแยกตัวไม่เปลี่ยนแปลงหลังจากได้รับการรักษาด้วยกรดโพรพิโอนิก (PPA) เซลล์ SH-SY5Y ได้รับการรักษาด้วย PPA ที่ความเข้มข้น 3 และ 5 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ระดับโปรตีนถูกวัดปริมาณโดยการวิเคราะห์ Western blot และระดับการแสดงออกถูกปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับโปรตีนทั้งหมด แสดงค่าเฉลี่ยการแสดงออกของโปรตีนและ Western blot ที่เป็นตัวแทนของโปรตีนเป้าหมายและโปรตีนทั้งหมด a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1 แท่งกราฟแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM) และข้อมูลที่แสดงเป็นตัวแทนของตัวอย่างทางชีววิทยา n = 3 การเปรียบเทียบหลายกลุ่ม (p < 0.05) ดำเนินการโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและการทดสอบของ Dunnett เจลและ blot ต้นฉบับแสดงในรูปที่ S1
ความผิดปกติของไมโทคอนเดรียมีความเกี่ยวข้องกับโรคหลายระบบ ตั้งแต่โรคเมตาบอลิซึม โรคหัวใจและหลอดเลือด โรคกล้ามเนื้อ ไปจนถึงโรคทางระบบประสาท1,10 โรคทางระบบประสาทเสื่อมและโรคที่เกี่ยวข้องกับระบบประสาทเสื่อมหลายชนิดมีความเกี่ยวข้องกับความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของออร์แกเนลล์เหล่านี้ตลอดช่วงชีวิตของสมอง โรคเหล่านี้ได้แก่ โรคพาร์กินสัน โรคอัลไซเมอร์ และ ASD3,4,18 อย่างไรก็ตาม การเข้าถึงเนื้อเยื่อสมองเพื่อศึกษาโรคเหล่านี้ทำได้ยาก โดยเฉพาะอย่างยิ่งในระดับกลไก ทำให้ระบบแบบจำลองเซลล์เป็นทางเลือกที่จำเป็น ในการศึกษานี้ เราใช้ระบบแบบจำลองเซลล์โดยใช้เซลล์ SH-SY5Y ที่ได้รับการบำบัดด้วย PPA เพื่อจำลองความผิดปกติของไมโทคอนเดรียที่พบในโรคทางระบบประสาท โดยเฉพาะอย่างยิ่งโรคออทิสติกสเปกตรัม การใช้แบบจำลอง PPA นี้เพื่อศึกษาพลวัตของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาทอาจให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับสาเหตุของ ASD
เราได้สำรวจความเป็นไปได้ในการใช้ TEM เพื่อดูการเปลี่ยนแปลงของรูปร่างไมโทคอนเดรีย สิ่งสำคัญคือต้องทราบว่าต้องใช้ TEM อย่างถูกต้องเพื่อให้ได้ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด การเตรียมตัวอย่างแช่แข็งช่วยให้การรักษาสภาพโครงสร้างของเซลล์ประสาทดีขึ้น โดยการตรึงส่วนประกอบของเซลล์และลดการเกิดสิ่งแปลกปลอมไปพร้อมกัน34 สอดคล้องกับเรื่องนี้ เราพบว่าเซลล์ SH-SY5Y ที่มีลักษณะคล้ายเซลล์ประสาทมีออร์แกเนลล์ภายในเซลล์ที่สมบูรณ์และไมโทคอนเดรียที่ยาวขึ้น (รูปที่ 1a) สิ่งนี้เน้นให้เห็นถึงประโยชน์ของเทคนิคการเตรียมตัวอย่างแช่แข็งสำหรับการศึกษารูปร่างไมโทคอนเดรียในแบบจำลองเซลล์ประสาท แม้ว่าการวัดเชิงปริมาณมีความสำคัญต่อการวิเคราะห์ข้อมูล TEM อย่างเป็นกลาง แต่ก็ยังไม่มีข้อสรุปว่าควรวัดพารามิเตอร์เฉพาะใดบ้างเพื่อยืนยันการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของไมโทคอนเดรีย จากงานวิจัยจำนวนมากที่ศึกษาสัณฐานวิทยาของไมโตคอนเดรียในเชิงปริมาณ17,31,32 เราได้พัฒนาระบบวิเคราะห์ภาพไมโตคอนเดรียอัตโนมัติที่วัดพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาแปดประการ ได้แก่ พื้นที่ พื้นที่2 อัตราส่วนความยาวต่อความกว้าง เส้นรอบวง ความเป็นวงกลม ระดับความกลม เส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรต และความกลม
ในบรรดาตัวแปรเหล่านั้น PPA ลดพื้นที่ 2 พื้นที่ เส้นรอบวง และเส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรตลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1b–e) ซึ่งแสดงให้เห็นว่าไมโทคอนเดรียมีขนาดเล็ลงและกลมขึ้น ซึ่งสอดคล้องกับการศึกษาครั้งก่อนที่แสดงให้เห็นว่าพื้นที่ของไมโทคอนเดรียลดลงหลังจากความเครียดของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก PPA30 เป็นเวลา 72 ชั่วโมง ลักษณะทางสัณฐานวิทยาเหล่านี้อาจบ่งชี้ถึงการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรีย ซึ่งเป็นกระบวนการที่จำเป็นในการแยกส่วนประกอบที่เสียหายออกจากเครือข่ายไมโทคอนเดรียเพื่อส่งเสริมการย่อยสลายผ่านไมโทฟาจี35,36,37 ในทางกลับกัน การลดลงของขนาดไมโทคอนเดรียโดยเฉลี่ยอาจเกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นของการสร้างใหม่ ซึ่งส่งผลให้เกิดไมโทคอนเดรียขนาดเล็กขึ้น การแบ่งตัวหรือการสร้างใหม่ที่เพิ่มขึ้นแสดงถึงการตอบสนองชดเชยเพื่อรักษากระบวนการแบ่งเซลล์เมื่อเกิดความเครียดของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม ไม่สามารถตัดความเป็นไปได้ของการเจริญเติบโตของไมโทคอนเดรียที่ลดลง การรวมตัวที่บกพร่อง หรือสภาวะอื่นๆ ออกไปได้
แม้ว่าภาพความละเอียดสูงที่สร้างขึ้นโดย TEM จะช่วยให้สามารถกำหนดลักษณะทางสัณฐานวิทยาในระดับของไมโทคอนเดรียแต่ละตัวได้ แต่วิธีนี้จะสร้างภาพสองมิติ ณ จุดเวลาเดียวเท่านั้น เพื่อศึกษาการตอบสนองแบบไดนามิกต่อความเครียดทางเมตาบอลิซึม เราจึงย้อมไมโทคอนเดรียด้วย TMRE และใช้กล้องจุลทรรศน์แบบไทม์แลปส์ร่วมกับการวิเคราะห์ MEL ซึ่งช่วยให้สามารถมองเห็นการเปลี่ยนแปลงในเครือข่ายไมโทคอนเดรียแบบสามมิติได้ในปริมาณมากตลอดเวลา33,38 เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยแต่มีนัยสำคัญในพลวัตของไมโทคอนเดรียภายใต้ความเครียดจาก PPA (รูปที่ 2) ที่ความเข้มข้น 3 mM จำนวนเหตุการณ์การแบ่งตัวเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่เหตุการณ์การรวมตัวยังคงเท่าเดิมกับกลุ่มควบคุม การเพิ่มขึ้นของจำนวนทั้งเหตุการณ์การแบ่งตัวและการรวมตัวถูกสังเกตที่ความเข้มข้น 5 mM ของ PPA แต่การเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เป็นสัดส่วนโดยประมาณ ซึ่งบ่งชี้ว่าจลนศาสตร์การแบ่งตัวและการรวมตัวถึงสมดุลที่ความเข้มข้นสูงขึ้น (รูปที่ 2b) ปริมาตรเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียยังคงไม่เปลี่ยนแปลงทั้งที่ความเข้มข้นของ PPA 3 และ 5 mM ซึ่งแสดงให้เห็นว่าความสมบูรณ์ของเครือข่ายไมโทคอนเดรียยังคงอยู่ (รูปที่ 2d) สิ่งนี้สะท้อนให้เห็นถึงความสามารถของเครือข่ายไมโทคอนเดรียแบบไดนามิกในการตอบสนองต่อความเครียดทางเมตาบอลิซึมระดับอ่อนเพื่อรักษาสภาวะสมดุลได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยไม่ทำให้เครือข่ายแตกตัว ที่ความเข้มข้นของ PPA 3 mM การเพิ่มขึ้นของการแบ่งตัวนั้นเพียงพอที่จะส่งเสริมการเปลี่ยนไปสู่สมดุลใหม่ แต่จำเป็นต้องมีการปรับเปลี่ยนจลนศาสตร์ที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเพื่อตอบสนองต่อความเครียดที่เกิดจากความเข้มข้นของ PPA ที่สูงขึ้น
จำนวนไมโทคอนเดรียเพิ่มขึ้นที่ความเข้มข้นของ PPA ทั้งสองระดับ แต่ปริมาตรเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียไม่ได้เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 2c) นี่อาจเป็นผลมาจากการสร้างใหม่หรือการแบ่งตัวที่เพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ในกรณีที่ปริมาตรเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียไม่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ก็มีความเป็นไปได้มากกว่าที่การสังเคราะห์จะเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ข้อมูลในรูปที่ 2 สนับสนุนการมีอยู่ของกลไกการชดเชยสองอย่าง ได้แก่ การเพิ่มขึ้นของจำนวนเหตุการณ์การแบ่งตัว ซึ่งสอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรีย และการเพิ่มขึ้นของจำนวนเหตุการณ์ ซึ่งสอดคล้องกับการสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ ท้ายที่สุดแล้ว การชดเชยแบบไดนามิกสำหรับความเครียดระดับอ่อนอาจประกอบด้วยกระบวนการที่เกิดขึ้นพร้อมกันซึ่งเกี่ยวข้องกับการแบ่งตัว การรวมตัว การสร้างใหม่ และไมโทฟาจี แม้ว่าผู้เขียนก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นว่า PPA ช่วยเพิ่มการแบ่งตัวของเซลล์30,39 และไมโทฟาจี29 แต่เราได้ให้หลักฐานสำหรับการปรับเปลี่ยนพลวัตของการแบ่งตัวและการรวมตัวของไมโทคอนเดรียเพื่อตอบสนองต่อ PPA ข้อมูลเหล่านี้ยืนยันการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่สังเกตได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) และให้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับกลไกที่เกี่ยวข้องกับการทำงานผิดปกติของไมโตคอนเดรียที่เกิดจาก PPA
เนื่องจากการวิเคราะห์ด้วย TEM และ MEL ไม่ได้ให้หลักฐานโดยตรงเกี่ยวกับกลไกการควบคุมยีนที่อยู่เบื้องหลังการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่สังเกตได้ เราจึงตรวจสอบการแสดงออกของ RNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ การสร้าง และพลวัตของไมโทคอนเดรีย โปรโตออนโคยีน cMYC เป็นปัจจัยการถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมไมโทคอนเดรีย ไกลโคไลซิส การเผาผลาญกรดอะมิโนและกรดไขมัน40 นอกจากนี้ cMYC ยังเป็นที่รู้จักกันดีว่าควบคุมการแสดงออกของยีนไมโทคอนเดรียเกือบ 600 ยีนที่เกี่ยวข้องกับการถอดรหัส การแปล และการประกอบเชิงซ้อนของไมโทคอนเดรีย รวมถึง NRF1 และ TFAM41 NRF1 และ TFAM เป็นตัวควบคุมหลักสองตัวของการแบ่งเซลล์ โดยทำหน้าที่อยู่ปลายน้ำของ PGC-1α เพื่อกระตุ้นการจำลองแบบ mtDNA เส้นทางนี้ถูกกระตุ้นโดยการส่งสัญญาณ cAMP และ AMPK และมีความไวต่อการใช้พลังงานและความเครียดทางเมตาบอลิซึม นอกจากนี้ เรายังตรวจสอบ NFE2L2 ซึ่งเป็นตัวควบคุมปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชันของการสร้างไมโทคอนเดรีย เพื่อพิจารณาว่าผลกระทบของ PPA อาจเกิดจากความเครียดจากออกซิเดชันหรือไม่
แม้ว่าการแสดงออกของ NFE2L2 จะยังคงไม่เปลี่ยนแปลง แต่เราพบว่าการแสดงออกของ cMYC, NRF1 และ TFAM ลดลงอย่างสม่ำเสมอตามปริมาณยาหลังจากได้รับการรักษาด้วย PPA ความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (รูปที่ 3a–c) ก่อนหน้านี้มีรายงานว่าการลดลงของการแสดงออกของ cMYC เป็นการตอบสนองต่อความเครียดของไมโทคอนเดรีย42 และในทางกลับกัน การลดลงของการแสดงออกของ cMYC สามารถทำให้เกิดความผิดปกติของไมโทคอนเดรียได้โดยการปรับโครงสร้างการเผาผลาญของไมโทคอนเดรีย การเชื่อมต่อเครือข่าย และการโพลาไรเซชันของเยื่อหุ้มเซลล์43 ที่น่าสนใจคือ cMYC ยังมีส่วนเกี่ยวข้องในการควบคุมการแบ่งตัวและการรวมตัวของไมโทคอนเดรีย42,43 และเป็นที่ทราบกันดีว่าเพิ่มการฟอสโฟรีเลชันของ DRP1 และการกำหนดตำแหน่งของไมโทคอนเดรียในระหว่างการแบ่งเซลล์44 ตลอดจนเป็นตัวกลางในการปรับโครงสร้างทางสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียในเซลล์ต้นกำเนิดประสาท45 อันที่จริง ไฟโบรบลาสต์ที่ขาด cMYC แสดงให้เห็นขนาดของไมโทคอนเดรียที่ลดลง ซึ่งสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากความเครียดของ PPA43 ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์ที่น่าสนใจแต่ยังไม่ชัดเจนระหว่าง cMYC และพลวัตของไมโทคอนเดรีย ซึ่งเป็นเป้าหมายที่น่าสนใจสำหรับการศึกษาการปรับโครงสร้างที่เกิดจากความเครียดของ PPA ในอนาคต
การลดลงของ NRF1 และ TFAM สอดคล้องกับบทบาทของ cMYC ในฐานะตัวกระตุ้นการถอดรหัสที่สำคัญ ข้อมูลเหล่านี้ยังสอดคล้องกับการศึกษาในเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ก่อนหน้านี้ที่แสดงให้เห็นว่า PPA ลดการแสดงออกของ mRNA ของ NRF1 ที่ 22 ชั่วโมง ซึ่งสัมพันธ์กับการลดลงของ ATP และการเพิ่มขึ้นของ ROS46 ผู้เขียนเหล่านั้นยังรายงานว่าการแสดงออกของ TFAM เพิ่มขึ้นที่ 8.5 ชั่วโมง แต่กลับสู่ระดับพื้นฐานที่ 22 ชั่วโมง ในทางตรงกันข้าม Kim et al. (2019) แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ mRNA ของ TFAM ลดลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากได้รับความเครียดจาก PPA เป็นเวลา 4 ชั่วโมงในเซลล์ SH-SY5Y อย่างไรก็ตาม หลังจาก 72 ชั่วโมง การแสดงออกของโปรตีน TFAM เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและจำนวนสำเนา mtDNA ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ดังนั้น การลดลงของจำนวนยีนการสร้างไมโทคอนเดรียที่เราสังเกตเห็นหลังจาก 24 ชั่วโมงไม่ได้ตัดความเป็นไปได้ที่การเพิ่มขึ้นของจำนวนไมโทคอนเดรียจะเกี่ยวข้องกับการกระตุ้นการสร้างไมโทคอนเดรียในช่วงเวลาที่เร็วกว่านั้น การศึกษาครั้งก่อนๆ แสดงให้เห็นว่า PPA เพิ่มระดับ mRNA และโปรตีนของ PGC-1α ในเซลล์ SH-SY5Y อย่างมีนัยสำคัญที่ 4 ชั่วโมง 30 นาที ในขณะที่กรดโพรพิโอนิกช่วยเพิ่มการสร้างไมโทคอนเดรียในเซลล์ตับลูกวัวผ่าน PGC-1α ที่ 12 ชั่วโมง 39 นาที ที่น่าสนใจคือ PGC-1α ไม่เพียงแต่เป็นตัวควบคุมการถอดรหัสโดยตรงของ NRF1 และ TFAM เท่านั้น แต่ยังแสดงให้เห็นว่าควบคุมกิจกรรมของ MFN2 และ DRP1 โดยการควบคุมการแบ่งตัวและการรวมตัวด้วย47 เมื่อพิจารณาร่วมกันแล้ว สิ่งนี้เน้นให้เห็นถึงกลไกที่เชื่อมโยงกันอย่างใกล้ชิดในการควบคุมการตอบสนองชดเชยของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก PPA ยิ่งไปกว่านั้น ข้อมูลของเราสะท้อนให้เห็นถึงการควบคุมการถอดรหัสที่ผิดปกติอย่างมีนัยสำคัญของการสร้างและการเผาผลาญภายใต้ความเครียดจาก PPA
ยีน STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 และ DRP1 เป็นหนึ่งในตัวควบคุมหลักของการแบ่งตัว การรวมตัว และพลวัตของไมโทคอนเดรีย37,48,49 นอกจากนี้ยังมียีนอื่นๆ อีกมากมายที่เกี่ยวข้องกับพลวัตของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม ก่อนหน้านี้พบว่า STOML2, OPA1 และ MFN2 มีการเมทิลเลชั่นที่แตกต่างกันในกลุ่มผู้ป่วย ASD16 และการศึกษาอิสระหลายชิ้นได้รายงานการเปลี่ยนแปลงของปัจจัยการถอดรหัสเหล่านี้เพื่อตอบสนองต่อความเครียดของไมโทคอนเดรีย50,51 52 การแสดงออกของทั้ง OPA1 และ STOML2 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อได้รับการรักษาด้วย PPA ที่ความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM (รูปที่ 3e, f) OPA1 เป็นหนึ่งในตัวควบคุมการรวมตัวของไมโทคอนเดรียแบบคลาสสิกผ่านการโต้ตอบโดยตรงกับ MFN1 และ 2 และมีบทบาทในการปรับโครงสร้างของคริสตาและสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย53 บทบาทที่แท้จริงของ STOML2 ในพลวัตของไมโทคอนเดรียยังคงไม่ชัดเจน แต่หลักฐานบ่งชี้ว่ามันมีบทบาทในการรวมตัวของไมโทคอนเดรีย การสร้างไมโทคอนเดรียใหม่ และการกำจัดไมโทคอนเดรียที่เสียหาย
STOML2 มีส่วนเกี่ยวข้องในการรักษาระบบหายใจของไมโทคอนเดรียและการสร้างคอมเพล็กซ์ของห่วงโซ่การหายใจ54,55 และแสดงให้เห็นว่าสามารถเปลี่ยนแปลงลักษณะการเผาผลาญของเซลล์มะเร็งได้อย่างมาก56 การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่า STOML2 ส่งเสริมศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียและการสร้างใหม่ผ่านการโต้ตอบกับ BAN และคาร์ดิโอลิปิน55, 57, 58 นอกจากนี้ การศึกษาอิสระยังแสดงให้เห็นว่าการโต้ตอบระหว่าง STOML2 และ PINK1 ควบคุมไมโทฟาจี59,60 ที่น่าสังเกตคือ มีรายงานว่า STOML2 โต้ตอบโดยตรงและทำให้ MFN2 มีเสถียรภาพ และยังมีบทบาทสำคัญในการทำให้ไอโซฟอร์ม OPA1 ที่ยาวมีเสถียรภาพโดยการยับยั้งโปรตีเอสที่รับผิดชอบต่อการย่อยสลาย OPA153,61,62 การลดลงของการแสดงออกของ STOML2 ที่สังเกตได้ในปฏิกิริยา PPA อาจทำให้โปรตีนฟิวชั่นเหล่านี้ไวต่อการย่อยสลายมากขึ้นผ่านทางวิถีที่ขึ้นอยู่กับยูบิควิตินและโปรตีเอโซม48 แม้ว่าบทบาทที่แท้จริงของ STOML2 และ OPA1 ในการตอบสนองแบบไดนามิกต่อ PPA จะยังไม่ชัดเจน แต่การแสดงออกที่ลดลงของยีนฟิวชั่นเหล่านี้ (รูปที่ 3) อาจทำให้สมดุลระหว่างการแบ่งตัวและการรวมตัวเสียไป และส่งผลให้ขนาดของไมโทคอนเดรียลดลง (รูปที่ 3) 1)
ในทางกลับกัน การแสดงออกของโปรตีน OPA1 ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงหลังจาก 24 ชั่วโมง ในขณะที่ระดับ mRNA และโปรตีนของ MFN1, MFN2 หรือ DRP1 ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญหลังจากได้รับการรักษาด้วย PPA (รูปที่ 3g-i, รูปที่ 4) ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการควบคุมปัจจัยเหล่านี้ที่เกี่ยวข้องกับการรวมตัวและการแยกตัวของไมโทคอนเดรีย อย่างไรก็ตาม ควรสังเกตว่ายีนทั้งสี่นี้ยังได้รับการควบคุมโดยการดัดแปลงหลังการถอดรหัส (PTMs) ที่ควบคุมกิจกรรมของโปรตีน OPA1 มีตัวแปรการต่อเชื่อมทางเลือกแปดแบบที่ถูกตัดด้วยเอนไซม์ในไมโทคอนเดรียเพื่อสร้างไอโซฟอร์มที่แตกต่างกันสองแบบ 63 ความสมดุลระหว่างไอโซฟอร์มยาวและสั้นในที่สุดจะกำหนดบทบาทของ OPA1 ในการรวมตัวของไมโทคอนเดรียและการบำรุงรักษาเครือข่ายไมโทคอนเดรีย64 กิจกรรมของ DRP1 ถูกควบคุมโดยการฟอสโฟรีเลชันของโปรตีนไคเนส II ที่ขึ้นอยู่กับแคลเซียม/แคลโมดูลิน (CaMKII) ในขณะที่การสลายตัวของ DRP1 ถูกควบคุมโดยการยูบิควิตินเนชันและการซูโมอิเลชัน65 สุดท้ายนี้ ทั้ง DRP1 และ MFN1/2 เป็น GTPase ดังนั้นกิจกรรมอาจได้รับอิทธิพลจากอัตราการผลิต GTP ในไมโทคอนเดรีย 66 ดังนั้น แม้ว่าการแสดงออกของโปรตีนเหล่านี้จะคงที่ แต่อาจไม่ได้สะท้อนถึงกิจกรรมหรือตำแหน่งของโปรตีนที่ไม่เปลี่ยนแปลง67,68 อันที่จริง ชุดโปรตีน PTM ที่มีอยู่มักทำหน้าที่เป็นแนวป้องกันด่านแรกที่รับผิดชอบในการตอบสนองต่อความเครียดเฉียบพลัน ในสภาวะที่มีความเครียดทางเมตาบอลิซึมระดับปานกลางในแบบจำลองของเรา เป็นไปได้ว่า PTM ส่งเสริมกิจกรรมที่เพิ่มขึ้นของโปรตีนฟิวชั่นและฟิสชันเพื่อฟื้นฟูความสมบูรณ์ของไมโทคอนเดรียอย่างเพียงพอโดยไม่จำเป็นต้องมีการกระตุ้นยีนเหล่านี้เพิ่มเติมในระดับ mRNA หรือโปรตีน
โดยรวมแล้ว ข้อมูลข้างต้นเน้นให้เห็นถึงการควบคุมรูปร่างของไมโทคอนเดรียที่ซับซ้อนและขึ้นอยู่กับเวลา รวมถึงความท้าทายในการอธิบายกลไกเหล่านี้ ในการศึกษาการแสดงออกของยีน จำเป็นต้องระบุยีนเป้าหมายเฉพาะในวิถีการทำงานก่อน อย่างไรก็ตาม ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่ายีนในวิถีการทำงานเดียวกันไม่ได้ตอบสนองต่อความเครียดเดียวกันในลักษณะเดียวกัน อันที่จริง การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่ายีนที่แตกต่างกันในวิถีการทำงานเดียวกันอาจแสดงรูปแบบการตอบสนองตามเวลาที่แตกต่างกัน30,46 นอกจากนี้ยังมีกลไกหลังการถอดรหัสที่ซับซ้อนซึ่งขัดขวางความสัมพันธ์ระหว่างการถอดรหัสและการทำงานของยีน การศึกษาโปรตีโอมิกส์สามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับผลกระทบของ PTMs และการทำงานของโปรตีน แต่ก็มีข้อท้าทายเช่นกัน ได้แก่ วิธีการที่มีปริมาณงานต่ำ อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง และความละเอียดต่ำ
ในบริบทนี้ การศึกษาสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียโดยใช้ TEM และ MEL มีศักยภาพอย่างมากในการตอบคำถามพื้นฐานเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างพลวัตและหน้าที่ของไมโทคอนเดรีย และอิทธิพลที่มีต่อโรค ที่สำคัญที่สุด TEM เป็นวิธีการโดยตรงในการวัดสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรีย ซึ่งเป็นจุดสิ้นสุดของการทำงานผิดปกติและพลวัตของไมโทคอนเดรีย51 MEL ยังเป็นวิธีการโดยตรงในการมองเห็นเหตุการณ์การแบ่งตัวและการรวมตัวในสภาพแวดล้อมของเซลล์แบบสามมิติ ทำให้สามารถวัดปริมาณการปรับโครงสร้างของไมโทคอนเดรียแบบไดนามิกได้ แม้ว่าจะไม่มีการเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนก็ตาม33 ในที่นี้ เราเน้นถึงประโยชน์ของเทคนิคการถ่ายภาพไมโทคอนเดรียในโรคไมโทคอนเดรียทุติยภูมิ โรคเหล่านี้มักมีลักษณะเฉพาะคือความเครียดทางเมตาบอลิซึมเรื้อรังที่ไม่รุนแรง ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือการปรับโครงสร้างของเครือข่ายไมโทคอนเดรียอย่างละเอียดอ่อน มากกว่าความเสียหายของไมโทคอนเดรียแบบเฉียบพลัน อย่างไรก็ตาม การชดเชยของไมโทคอนเดรียที่จำเป็นในการรักษากระบวนการแบ่งเซลล์ภายใต้ความเครียดเรื้อรังนั้นมีผลกระทบต่อการทำงานอย่างมาก ในบริบทของประสาทวิทยาศาสตร์ ความเข้าใจที่ดีขึ้นเกี่ยวกับกลไกการชดเชยเหล่านี้อาจให้ข้อมูลสำคัญเกี่ยวกับพยาธิสภาพทางประสาทหลายด้านที่เกี่ยวข้องกับการทำงานผิดปกติของไมโทคอนเดรีย
โดยสรุปแล้ว ข้อมูลของเราเน้นย้ำถึงประโยชน์ของเทคนิคการถ่ายภาพในการทำความเข้าใจผลกระทบเชิงหน้าที่ของปฏิสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างการแสดงออกของยีน การดัดแปลงโปรตีน และกิจกรรมของโปรตีนที่ควบคุมพลวัตของไมโทคอนเดรียในเซลล์ประสาท เราใช้ PPA เพื่อจำลองความผิดปกติของไมโทคอนเดรียในแบบจำลองเซลล์ประสาทเพื่อให้ได้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับองค์ประกอบของไมโทคอนเดรียใน ASD เซลล์ SH-SY5Y ที่ได้รับการรักษาด้วย PPA แสดงให้เห็นการเปลี่ยนแปลงในรูปร่างของไมโทคอนเดรีย: ไมโทคอนเดรียมีขนาดเล็กและกลม และคริสเต้ไม่ชัดเจนเมื่อสังเกตด้วย TEM การวิเคราะห์ MEL แสดงให้เห็นว่าการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้เกิดขึ้นพร้อมกับการเพิ่มขึ้นของเหตุการณ์การแบ่งตัวและการรวมตัวเพื่อรักษาสภาพเครือข่ายไมโทคอนเดรียเพื่อตอบสนองต่อความเครียดทางเมตาบอลิซึมเล็กน้อย ยิ่งไปกว่านั้น PPA ยังรบกวนการควบคุมการถอดรหัสของเมตาบอลิซึมและภาวะสมดุลของไมโทคอนเดรียอย่างมีนัยสำคัญ เราได้ระบุ cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 และ OPA1 ว่าเป็นตัวควบคุมไมโทคอนเดรียที่สำคัญซึ่งถูกรบกวนโดยความเครียดจาก PPA และอาจมีบทบาทในการเป็นตัวกลางในการเปลี่ยนแปลงรูปร่างและหน้าที่ของไมโทคอนเดรียที่เกิดจาก PPA จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมในอนาคตเพื่อทำความเข้าใจการเปลี่ยนแปลงตามเวลาของการแสดงออกของยีนและกิจกรรมของโปรตีน ตำแหน่ง และการดัดแปลงหลังการแปลรหัสที่เกิดจาก PPA ให้ดียิ่งขึ้น ข้อมูลของเราเน้นให้เห็นถึงความซับซ้อนและการพึ่งพาซึ่งกันและกันของกลไกการควบคุมที่เป็นตัวกลางในการตอบสนองต่อความเครียดของไมโทคอนเดรีย และแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของ TEM และเทคนิคการถ่ายภาพอื่นๆ สำหรับการศึกษาเชิงกลไกที่เจาะจงมากขึ้น
เซลล์สายพันธุ์ SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich เซลล์ SH-SY5Y ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเซลล์ Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 nutrient mixture (DMEM/F-12) และ L-glutamine (SC09411, ScienCell) ในขวดเพาะเลี้ยงขนาด 25 cm2 เสริมด้วยซีรั่มจากลูกวัว (FBS) 20% (10493106, ThermoFisher Scientific) และเพนิซิลลิน-สเตรปโตไมซิน 1% (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) ที่อุณหภูมิ 37 °C และความเข้มข้นของ CO2 5% เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงต่อจนมีความหนาแน่น 80% โดยใช้ trypsin-EDTA 0.05% (15400054, ThermoFisher Scientific) จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 300 g และเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่นประมาณ 7 × 10⁵ เซลล์/มล. การทดลองทั้งหมดดำเนินการกับเซลล์ SH-SY5Y ที่ยังไม่แตกต่างระหว่างช่วงการเพาะเลี้ยงที่ 19–22 PPA ถูกให้ในรูปของ NaP ละลายผง NaP (CAS No. 137-40-6, สูตรเคมี C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) ในน้ำ MilliQ อุ่นให้มีความเข้มข้น 1 M และเก็บไว้ที่ 4 °C ในวันที่ทำการรักษา ให้เจือจางสารละลายนี้ด้วย PPA 1 M ให้มีความเข้มข้น 3 mM และ 5 mM ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรัม (DMEM/F-12 ที่มี L-glutamine) ความเข้มข้นของสารที่ใช้ในการทดลองทั้งหมด ได้แก่ ไม่มี PPA (0 mM, กลุ่มควบคุม), 3 mM และ 5 mM PPA โดยทำการทดลองซ้ำอย่างน้อย 3 ตัวอย่างทางชีวภาพ
เซลล์ SH-SY5Y ถูกเพาะเลี้ยงในขวดขนาด 25 cm³ ในอัตรา 5.5 × 10⁵ เซลล์/มล. และเลี้ยงไว้เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เติมสาร PPA ลงในขวดก่อนการบ่ม 24 ชั่วโมง เก็บเซลล์โดยใช้โปรโตคอลการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมตามปกติ (อธิบายไว้ข้างต้น) ละลายเซลล์ในสารละลายกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% และ PBS 1 เท่า ปริมาตร 100 µl และเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 4 °C จนกว่าจะทำการประมวลผล นำเซลล์ SH-SY5Y ไปปั่นเหวี่ยงอย่างรวดเร็วเพื่อแยกเซลล์และกำจัดสารละลายกลูตารัลดีไฮด์ 2.5% และ PBS 1 เท่า ละลายตะกอนในเจลอะกาโรส 4% ที่เตรียมในน้ำกลั่น (อัตราส่วนปริมาตรของอะกาโรสต่อตะกอนคือ 1:1) วางชิ้นอะกาโรสบนตะแกรงบนแผ่นเรียบและเคลือบด้วย 1-เฮกซาดีซีนก่อนแช่แข็งด้วยแรงดันสูง ตัวอย่างถูกแช่แข็งในอะซิโตนแห้ง 100% ที่อุณหภูมิ -90°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง จากนั้นจึงเพิ่มอุณหภูมิเป็น -80°C และเติมสารละลายออสเมียมเตตระออกไซด์ 1% และกลูตารัลดีไฮด์ 0.1% ลงไป ตัวอย่างถูกเก็บไว้ที่อุณหภูมิ -80°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หลังจากนั้น อุณหภูมิจะค่อยๆ เพิ่มขึ้นจนถึงอุณหภูมิห้องในหลายวัน โดยลดลงจาก -80°C เหลือ -50°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ลดลงเหลือ -30°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ลดลงเหลือ -10°C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง และสุดท้ายจนถึงอุณหภูมิห้อง
หลังจากเตรียมตัวอย่างด้วยความเย็นจัดแล้ว ตัวอย่างจะถูกชุบด้วยเรซินและตัดเป็นชิ้นบางพิเศษ (ประมาณ 100 นาโนเมตร) โดยใช้เครื่องตัดชิ้นเนื้อขนาดเล็กพิเศษ Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) ชิ้นเนื้อถูกย้อมด้วยยูรานิลอะซิเตต 2% และตะกั่วซิเตรต จากนั้นจึงสังเกตตัวอย่างโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (เดิมชื่อ FEI), Eindhoven, เนเธอร์แลนด์) ที่ทำงานที่ 200 kV (ตัวส่งสัญญาณ Lab6) และกล้อง CCD Gatan (Gatan, สหราชอาณาจักร) ที่ติดตั้งตัวกรองพลังงาน Tridiem
ในการทดลองซ้ำทางเทคนิคแต่ละครั้ง จะมีการเก็บภาพเซลล์เดี่ยวอย่างน้อย 24 ภาพ รวมทั้งหมด 266 ภาพ ภาพทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้มาโคร Region of Interest (ROI) และมาโคร Mitochondria มาโคร Mitochondria นี้อิงตามวิธีการที่ตีพิมพ์แล้ว17,31,32 และช่วยให้สามารถประมวลผลภาพ TEM แบบกลุ่มกึ่งอัตโนมัติใน Fiji/ImageJ69 ได้ โดยสรุปคือ ภาพจะถูกกลับด้านและกลับด้านโดยใช้การลบพื้นหลังแบบ rolling ball (รัศมี 60 พิกเซล) และตัวกรองแบบ bandpass FFT (โดยใช้ขอบเขตบนและล่าง 60 และ 8 พิกเซลตามลำดับ) และการระงับเส้นแนวตั้งด้วยความคลาดเคลื่อนของทิศทาง 5% ภาพที่ประมวลผลแล้วจะถูกกำหนดเกณฑ์โดยอัตโนมัติโดยใช้อัลกอริทึมเอนโทรปีสูงสุด และสร้างมาสก์ไบนารี บริเวณภาพที่เกี่ยวข้องกับ ROI ที่เลือกด้วยตนเองในภาพ TEM ดิบจะถูกแยกออกมา โดยระบุลักษณะของไมโทคอนเดรียและไม่รวมเยื่อหุ้มพลาสมาและบริเวณที่มีความคมชัดสูงอื่นๆ สำหรับแต่ละ ROI ที่สกัดออกมา อนุภาคไบนารีที่มีขนาดใหญ่กว่า 600 พิกเซลจะถูกวิเคราะห์ และวัดพื้นที่อนุภาค เส้นรอบวง แกนหลักและแกนรอง เส้นผ่านศูนย์กลางเฟเรต ความกลม และความเป็นวงกลม โดยใช้ฟังก์ชันการวัดในตัวของ Fiji/ImageJ ตาม Merrill, Flippo และ Strack (2017) พื้นที่ 2 อัตราส่วนด้านของอนุภาค (อัตราส่วนแกนหลักต่อแกนรอง) และปัจจัยรูปร่าง (FF) จะถูกคำนวณจากข้อมูลเหล่านี้ โดยที่ FF = เส้นรอบวง 2/4pi x พื้นที่ คำจำกัดความของสูตรพาราเมตริกสามารถพบได้ใน Merrill, Flippo และ Strack (2017) มาโครที่กล่าวถึงมีอยู่ใน GitHub (ดูคำชี้แจงความพร้อมใช้งานของข้อมูล) โดยเฉลี่ยแล้ว มีการวิเคราะห์อนุภาคประมาณ 5,600 อนุภาคต่อการรักษา PPA รวมทั้งหมดประมาณ 17,000 อนุภาค (ข้อมูลไม่ได้แสดงไว้)
เซลล์ SH-SH5Y ถูกวางในจานเพาะเลี้ยง 8 ช่อง (ThermoFisher, #155411) เพื่อให้เซลล์ยึดเกาะข้ามคืน จากนั้นจึงนำไปบ่มด้วย TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) และ Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) ภาพถูกบันทึกโดยใช้เลเซอร์ 405 nm และ 561 nm เป็นเวลา 10 นาที และภาพดิบถูกบันทึกเป็น z-stack ที่ประกอบด้วยภาพไมโครกราฟ 10 ภาพ โดยมีระยะห่าง az 0.2 μm ระหว่างเฟรมภาพ ณ จุดเวลาต่อเนื่อง 12 จุด ภาพถูกเก็บรวบรวมโดยใช้แพลตฟอร์มความละเอียดสูงพิเศษ Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) โดยใช้เลนส์ LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 ภาพต่างๆ ได้รับการวิเคราะห์ใน ImageJ โดยใช้ขั้นตอนการทำงานที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้และปลั๊กอิน ImageJ เพื่อวัดเหตุการณ์การรวมตัวและการแยกตัว จำนวนโครงสร้างไมโทคอนเดรียโดยเฉลี่ย และปริมาตรไมโทคอนเดรียโดยเฉลี่ยต่อเซลล์33 มาโคร MEL มีให้บริการบน GitHub (ดูคำชี้แจงเกี่ยวกับความพร้อมใช้งานของข้อมูล)
เซลล์ SH-SY5Y ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงหกหลุมที่ความหนาแน่น 0.3 × 10⁶ เซลล์/มล. เป็นเวลา 24 ชั่วโมงก่อนการบำบัด สกัด RNA โดยใช้โปรโตคอล Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย: เติมบัฟเฟอร์สลาย RNA 300 ไมโครลิตรลงในแต่ละหลุมก่อนนำออก และสลายตัวอย่างแต่ละตัวเป็นขั้นตอนสุดท้ายด้วยน้ำปราศจาก DNase/RNase 30 ไมโครลิตร ตรวจสอบปริมาณและคุณภาพของตัวอย่างทั้งหมดโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-Vis NanoDrop ND-1000 สกัดโปรตีนทั้งหมดจากสารละลายเซลล์โดยใช้บัฟเฟอร์สลาย RIPA 200 ไมโครลิตร และวัดความเข้มข้นของโปรตีนโดยใช้การทดสอบโปรตีน Bradford⁷⁰
การสังเคราะห์ cDNA ดำเนินการโดยใช้ชุดอุปกรณ์สังเคราะห์ cDNA Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน สังเคราะห์ cDNA ในปฏิกิริยา 20 ไมโครลิตร โดยใช้ RNA ทั้งหมด 0.7 ถึง 1 ไมโครกรัม ไพรเมอร์ถูกเลือกจากเอกสารที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (ตาราง S1) และโพรบที่เกี่ยวข้องได้รับการออกแบบโดยใช้เครื่องมือ PrimerQuest จาก Integrated DNA Technologies ยีนที่สนใจทั้งหมดได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานโดยเทียบกับยีน B2M ในนิวเคลียส การแสดงออกของยีน STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC และ OPA1 ถูกวัดโดย RT-qPCR มาสเตอร์มิกซ์ประกอบด้วยเอนไซม์ LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับ 10 μM, cDNA และน้ำเกรด PCR เพื่อให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 10 μL สำหรับแต่ละปฏิกิริยา การแสดงออกของยีนการแบ่งตัวและการแยกตัว (DRP1, MFN1/2) ถูกวัดโดยใช้ TaqMan multiplex assays ใช้ Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) ตามคำแนะนำของผู้ผลิตโดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย มาสเตอร์มิกซ์ multiplex RT-qPCR ประกอบด้วยเอนไซม์ LUNA Taq polymerase 1X, ไพรเมอร์ไปข้างหน้าและย้อนกลับ 10 μM, โพรบ 10 μM, cDNA และน้ำเกรด PCR ทำให้ได้ปริมาตรสุดท้าย 20 μL สำหรับแต่ละปฏิกิริยา ทำการ RT-qPCR โดยใช้ Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—หมายเลขซีเรียล: R0618110) เงื่อนไขการหมุนเวียนแสดงอยู่ในตาราง S1 ตัวอย่าง cDNA ทั้งหมดถูกขยายซ้ำ 3 ครั้ง และสร้างเส้นโค้งมาตรฐานโดยใช้ชุดการเจือจาง 10 เท่า ตัวอย่างที่ผิดปกติในตัวอย่างซ้ำ 3 ครั้งที่มีค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของเกณฑ์รอบ (Ct) >0.5 จะถูกลบออกจากการวิเคราะห์เพื่อให้แน่ใจว่าข้อมูลสามารถทำซ้ำได้30,72 การแสดงออกของยีนสัมพัทธ์คำนวณโดยใช้วิธี 2-ΔΔCt79
นำตัวอย่างโปรตีน (60 μg) มาผสมกับ Laemmli loading buffer ในอัตราส่วน 2:1 แล้วนำไปแยกด้วยเจลโปรตีนใส 12% (Bio-Rad #1610184) จากนั้นถ่ายโอนโปรตีนไปยังเมมเบรน PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) โดยใช้ระบบ Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad) ทำการบล็อกเมมเบรนและบ่มด้วยแอนติบอดีปฐมภูมิที่เหมาะสม (OPA1, MFN1, MFN2 และ DRP1) (เจือจาง 1:1000) เป็นเวลา 48 ชั่วโมง ตามด้วยการบ่มด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิ (1:10,000) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นทำการถ่ายภาพเมมเบรนโดยใช้ Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) และบันทึกภาพโดยใช้ระบบ Bio-Rad ChemiDoc MP ใช้โปรแกรม ImageLab เวอร์ชัน 6.1 ในการวิเคราะห์ Western blot เจลและแผ่นบล็อตต้นฉบับแสดงในรูปที่ S1 ข้อมูลเกี่ยวกับแอนติบอดีแสดงในตาราง S2
ชุดข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ยและค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐานของค่าเฉลี่ย (SEM) จากตัวอย่างอิสระอย่างน้อยสามตัวอย่าง ชุดข้อมูลได้รับการทดสอบความปกติโดยใช้การทดสอบ Shapiro-Wilks (เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น) ก่อนที่จะถือว่ามีการกระจายแบบเกาส์เซียนและค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานเท่ากัน และดำเนินการวิเคราะห์ต่อไป นอกจากการวิเคราะห์ชุดข้อมูลโดยใช้ Fisher's MEL LSD (p < 0.05), การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (ANOVA) (ค่าเฉลี่ยกลุ่มทดลองเทียบกับกลุ่มควบคุม) และการทดสอบเปรียบเทียบหลายกลุ่มของ Dunnett เพื่อหาความสำคัญทางสถิติ (p < 0.05) ค่า p ที่มีนัยสำคัญจะแสดงในกราฟเป็น *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 การวิเคราะห์ทางสถิติและกราฟทั้งหมดดำเนินการและสร้างขึ้นโดยใช้ GraphPad Prism 9.4.0
มาโคร Fiji/ImageJ สำหรับการวิเคราะห์ภาพ TEM เปิดให้ใช้งานได้ทั่วไปบน GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro ส่วนมาโคร Mitochondrial Event Locator (MEL) เปิดให้ใช้งานได้ทั่วไปบน GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
Meiliana A., Devi NM และ Vijaya A. ไมโตคอนเดรีย: ตัวควบคุมหลักของการเผาผลาญ การรักษาสมดุล ความเครียด ความชรา และเอพิเจเนติกส์ วารสารวิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ของอินโดนีเซีย 13, 221–241 (2021)
Ben-Shachar, D. ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียหลายด้านในโรคจิตเภท คอมเพล็กซ์ I เป็นเป้าหมายทางพยาธิวิทยาที่เป็นไปได้ วารสาร Schizophrenia. resource. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. และ Beal, MF ความผิดปกติของไมโตคอนเดรียในโรคพาร์กินสัน J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016)
Sharma VK, Singh TG และ Mehta V. ไมโตคอนเดรียที่เครียด: เป้าหมายของการรุกรานในโรคอัลไซเมอร์ Mitochondria 59, 48–57 (2021)
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF และ Ferreira GK ไมโตคอนเดรียและสมอง: พลังงานชีวภาพและอื่นๆ สารพิษต่อระบบประสาท แหล่งข้อมูล 36, 219–238 (2019)
Rangaraju, V. และคณะ ไมโตคอนเดรียที่มีบทบาทหลากหลาย: ผลกระทบของไมโตคอนเดรียต่อการพัฒนาและการเกิดโรคของเซลล์ประสาท วารสารประสาทวิทยาศาสตร์ 39, 8200–8208 (2019)
Cardaño-Ramos, C. และ Morais, VA การสร้างไมโตคอนเดรียในเซลล์ประสาท: อย่างไรและที่ไหน ความเป็นสากล J. Mohr. วิทยาศาสตร์ 22, 13059 (2021)
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. และ Zhao, J. การควบคุมพลวัตของไมโตคอนเดรียในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม: โอกาสและความท้าทาย front. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020)
Khacho, M. และ Slack, RS พลวัตของไมโตคอนเดรียในการควบคุมการสร้างเซลล์ประสาท: จากสมองที่กำลังพัฒนาไปจนถึงสมองผู้ใหญ่ development. dynamic. 247, 47–53 (2018)