ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
อนุภาคนาโนอินซูลิน (NPs) ที่มีปริมาณการบรรจุสูงได้ถูกนำไปประยุกต์ใช้ในรูปแบบยาต่างๆ งานวิจัยนี้มีจุดมุ่งหมายเพื่อประเมินผลของกระบวนการอบแห้งแบบแช่แข็งและการอบแห้งแบบพ่นต่อโครงสร้างของอนุภาคนาโนไคโตซานที่บรรจุอินซูลิน โดยใช้หรือไม่ใช้แมนนิทอลเป็นสารป้องกันการแข็งตัว นอกจากนี้ยังได้ประเมินคุณภาพของอนุภาคนาโนเหล่านี้โดยการละลายใหม่ ก่อนการอบแห้ง ขนาดอนุภาคของอนุภาคนาโนไคโตซาน/โซเดียมไตรโพลีฟอสเฟต/อินซูลินที่เชื่อมโยงกันนั้นได้รับการปรับให้เหมาะสมที่ 318 นาโนเมตร ค่า PDI เท่ากับ 0.18 ประสิทธิภาพการห่อหุ้มเท่ากับ 99.4% และปริมาณการบรรจุเท่ากับ 25.01% หลังจากการละลายใหม่ อนุภาคนาโนทั้งหมด ยกเว้นอนุภาคที่ผลิตโดยวิธีการอบแห้งแบบแช่แข็งโดยไม่ใช้แมนนิทอล ยังคงรักษารูปทรงทรงกลมไว้ เมื่อเปรียบเทียบกับอนุภาคนาโนที่มีแมนนิทอลที่อบแห้งด้วยวิธีการพ่น อนุภาคนาโนที่อบแห้งด้วยวิธีการพ่นโดยไม่ใช้แมนนิทอลก็แสดงให้เห็นถึงคุณภาพที่ดีขึ้นเช่นกัน อนุภาคขนาดเฉลี่ยที่เล็กที่สุด (376 นาโนเมตร) และปริมาณการบรรจุสูงสุด (25.02%) โดยมีอัตราการห่อหุ้มที่ใกล้เคียงกัน (98.7%) และ PDI (0.20) โดยใช้เทคนิคการอบแห้งหรือการอบแห้งแบบแช่แข็ง อนุภาคนาโนที่อบแห้งด้วยการพ่นแห้งโดยไม่ใช้แมนนิทอลยังส่งผลให้มีการปลดปล่อยอินซูลินเร็วที่สุดและมีประสิทธิภาพการดูดซึมเข้าสู่เซลล์สูงสุด งานวิจัยนี้แสดงให้เห็นว่าการพ่นแห้งสามารถทำให้แห้งอนุภาคนาโนของอินซูลินได้โดยไม่จำเป็นต้องใช้สารป้องกันการแข็งตัวเมื่อเทียบกับวิธีการอบแห้งแบบแช่แข็งแบบดั้งเดิม ทำให้มีความสามารถในการบรรจุที่มากขึ้น ความต้องการสารเติมแต่งที่น้อยลง และต้นทุนการดำเนินงานที่ต่ำลง ซึ่งเป็นข้อได้เปรียบที่สำคัญ
นับตั้งแต่การค้นพบในปี 19221,2,3 อินซูลินและยาเตรียมจากอินซูลินได้ช่วยชีวิตผู้ป่วยโรคเบาหวานประเภทที่ 1 (T1DM) และโรคเบาหวานประเภทที่ 2 (T2DM) อย่างไรก็ตาม เนื่องจากคุณสมบัติของอินซูลินที่เป็นโปรตีนที่มีโมเลกุลขนาดใหญ่ อินซูลินจึงจับตัวกันได้ง่าย ถูกย่อยสลายโดยเอนไซม์โปรตีโอไลติก และถูกกำจัดออกไปโดยกระบวนการเผาผลาญครั้งแรก ผู้ที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคเบาหวานประเภทที่ 1 จำเป็นต้องฉีดอินซูลินตลอดชีวิต ผู้ป่วยจำนวนมากที่ได้รับการวินิจฉัยว่าเป็นโรคเบาหวานประเภทที่ 2 ในระยะเริ่มต้นก็จำเป็นต้องฉีดอินซูลินในระยะยาวเช่นกัน การฉีดอินซูลินทุกวันเป็นสาเหตุสำคัญของความเจ็บปวดและความไม่สบายในชีวิตประจำวันสำหรับบุคคลเหล่านี้ และส่งผลเสียต่อสุขภาพจิต ด้วยเหตุนี้ รูปแบบการบริหารอินซูลินอื่นๆ ที่ก่อให้เกิดความไม่สบายตัวน้อยกว่า เช่น การบริหารอินซูลินทางปาก จึงได้รับการศึกษาอย่างกว้างขวาง5 เนื่องจากมีศักยภาพในการฟื้นฟูคุณภาพชีวิตของผู้ป่วยโรคเบาหวานประมาณ 5 พันล้านคนทั่วโลก
เทคโนโลยีอนุภาคนาโนได้สร้างความก้าวหน้าอย่างมากในการพยายามนำอินซูลินชนิดรับประทานมาใช้4,6,7 ซึ่งสามารถห่อหุ้มและปกป้องอินซูลินจากการเสื่อมสภาพได้อย่างมีประสิทธิภาพ เพื่อการส่งยาไปยังบริเวณต่างๆ ของร่างกายอย่างเฉพาะเจาะจง อย่างไรก็ตาม การใช้สูตรอนุภาคนาโนมีข้อจำกัดหลายประการ โดยส่วนใหญ่เกิดจากปัญหาความเสถียรของสารแขวนลอยของอนุภาค อาจเกิดการรวมตัวกันระหว่างการเก็บรักษา ซึ่งลดการดูดซึมของอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน8 นอกจากนี้ ความเสถียรทางเคมีของเมทริกซ์พอลิเมอร์ของอนุภาคนาโนและอินซูลินก็ต้องได้รับการพิจารณาด้วย เพื่อให้มั่นใจถึงความเสถียรของอนุภาคนาโนอินซูลิน (NPs) ปัจจุบัน เทคโนโลยีการอบแห้งแบบแช่แข็งถือเป็นมาตรฐานทองคำสำหรับการสร้าง NPs ที่เสถียร พร้อมทั้งป้องกันการเปลี่ยนแปลงที่ไม่พึงประสงค์ระหว่างการเก็บรักษา9
อย่างไรก็ตาม การทำแห้งแบบแช่แข็งจำเป็นต้องเติมสารป้องกันการแข็งตัวเพื่อป้องกันไม่ให้โครงสร้างทรงกลมของอนุภาคนาโนได้รับผลกระทบจากความเครียดทางกลของผลึกน้ำแข็ง ซึ่งจะลดปริมาณการบรรจุอนุภาคนาโนอินซูลินหลังจากการทำแห้งแบบแช่แข็งลงอย่างมาก เนื่องจากสารป้องกันการแข็งตัวมีสัดส่วนน้ำหนักมากที่สุด ดังนั้น อนุภาคนาโนอินซูลินที่ผลิตได้จึงมักไม่เหมาะสมสำหรับการผลิตสูตรผงแห้ง เช่น ยาเม็ดและแผ่นฟิล์มสำหรับรับประทาน เนื่องจากจำเป็นต้องใช้อนุภาคนาโนแห้งในปริมาณมากเพื่อให้ได้ช่วงการรักษาของอินซูลิน
การอบแห้งแบบสเปรย์เป็นกระบวนการที่รู้จักกันดีและราคาไม่แพงในระดับอุตสาหกรรมสำหรับการผลิตผงแห้งจากเฟสของเหลวในอุตสาหกรรมยา10,11 การควบคุมกระบวนการสร้างอนุภาคช่วยให้สามารถห่อหุ้มสารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพหลายชนิดได้อย่างเหมาะสม12,13 นอกจากนี้ยังกลายเป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพสำหรับการเตรียมโปรตีนที่ห่อหุ้มสำหรับการบริหารทางปาก ในระหว่างการอบแห้งแบบสเปรย์ น้ำจะระเหยอย่างรวดเร็ว ซึ่งช่วยรักษาอุณหภูมิของแกนกลางอนุภาคให้ต่ำ11,14 ทำให้สามารถนำไปใช้ในการห่อหุ้มส่วนประกอบที่ไวต่อความร้อนได้ ก่อนการอบแห้งแบบสเปรย์ วัสดุเคลือบควรได้รับการผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันอย่างทั่วถึงกับสารละลายที่มีส่วนผสมที่ห่อหุ้มอยู่11,14 แตกต่างจากการอบแห้งแบบแช่แข็ง การผสมให้เป็นเนื้อเดียวกันก่อนการห่อหุ้มในการอบแห้งแบบสเปรย์ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการห่อหุ้มในระหว่างการทำให้แห้ง เนื่องจากกระบวนการห่อหุ้มด้วยการอบแห้งแบบสเปรย์ไม่จำเป็นต้องใช้สารป้องกันการแข็งตัว การอบแห้งแบบสเปรย์จึงสามารถใช้ในการผลิต NPs แห้งที่มีปริมาณการบรรจุสูงได้
งานวิจัยนี้รายงานการผลิตอนุภาคนาโนบรรจุอินซูลินโดยการเชื่อมโยงไคโตซานและโซเดียมไตรโพลีฟอสเฟตโดยใช้วิธีไอออนเจล การสร้างไอออนเจลเป็นวิธีการเตรียมที่ช่วยให้สามารถผลิตอนุภาคนาโนผ่านปฏิกิริยาทางไฟฟ้าสถิตระหว่างไอออนสองชนิดขึ้นไปภายใต้เงื่อนไขที่กำหนด ทั้งเทคนิคการอบแห้งแบบแช่แข็งและการอบแห้งแบบพ่นถูกนำมาใช้ในการทำให้แห้งอนุภาคนาโนไคโตซาน/โซเดียมไตรโพลีฟอสเฟต/อินซูลินที่เชื่อมโยงกันอย่างเหมาะสม หลังจากทำให้แห้งแล้ว ได้ทำการวิเคราะห์รูปร่างของอนุภาคโดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) ความสามารถในการรวมตัวกันใหม่ได้รับการประเมินโดยการวัดการกระจายขนาด ประจุบนพื้นผิว ค่า PDI ประสิทธิภาพการห่อหุ้ม และปริมาณการบรรจุ คุณภาพของอนุภาคนาโนที่ละลายได้ซึ่งผลิตโดยวิธีการทำให้แห้งที่แตกต่างกันได้รับการประเมินโดยการเปรียบเทียบการปกป้องอินซูลิน พฤติกรรมการปลดปล่อย และประสิทธิภาพการดูดซึมเข้าสู่เซลล์
ค่า pH ของสารละลายผสมและอัตราส่วนของไคโตซานและอินซูลินเป็นปัจจัยสำคัญสองประการที่ส่งผลต่อขนาดอนุภาคและประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (EE) ของอนุภาคนาโนขั้นสุดท้าย เนื่องจากส่งผลโดยตรงต่อกระบวนการเจลไอออนิก ค่า pH ของสารละลายผสมแสดงให้เห็นว่ามีความสัมพันธ์อย่างมากกับขนาดอนุภาคและประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (รูปที่ 1a) ดังแสดงในรูปที่ 1a เมื่อค่า pH เพิ่มขึ้นจาก 4.0 เป็น 6.0 ขนาดอนุภาคเฉลี่ย (nm) ลดลงและ EE เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่เมื่อค่า pH เพิ่มขึ้นเป็น 6.5 ขนาดอนุภาคเฉลี่ยเริ่มเพิ่มขึ้นและ EE ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง เมื่ออัตราส่วนของไคโตซานต่ออินซูลินเพิ่มขึ้น ขนาดอนุภาคเฉลี่ยก็เพิ่มขึ้นเช่นกัน นอกจากนี้ ไม่พบการเปลี่ยนแปลงใน EE เมื่อเตรียมอนุภาคนาโนที่อัตราส่วนมวลของไคโตซาน/อินซูลินสูงกว่า 2.5:1 (w/w) (รูปที่ 1b) ดังนั้น สภาวะการเตรียมที่เหมาะสมที่สุดในงานวิจัยนี้ (pH 6.0, ในการศึกษาเพิ่มเติม ได้ใช้ไคโตซาน/อินซูลินในอัตราส่วนมวล 2.5:1 ในการเตรียมอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน ภายใต้สภาวะการเตรียมนี้ ขนาดอนุภาคเฉลี่ยของอนุภาคนาโนอินซูลินได้รับการปรับให้เหมาะสมเป็น 318 นาโนเมตร (รูปที่ 1c) ค่า PDI เท่ากับ 0.18 ประสิทธิภาพการฝังตัวเท่ากับ 99.4% ศักย์ซีตาเท่ากับ 9.8 มิลลิโวลต์ และปริมาณอินซูลินที่บรรจุเท่ากับ 25.01% (ม/ม) จากผลการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) พบว่าอนุภาคนาโนที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมนั้นมีรูปร่างเป็นทรงกลมและแยกจากกัน โดยมีขนาดค่อนข้างสม่ำเสมอ (รูปที่ 1d)
การปรับพารามิเตอร์ของอนุภาคนาโนอินซูลินให้เหมาะสม: (a) ผลของค่า pH ต่อเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยและประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (EE) ของอนุภาคนาโนอินซูลิน (เตรียมที่อัตราส่วนมวลไคโตซานและอินซูลิน 5:1); (b) อิทธิพลของอัตราส่วนมวลไคโตซานและอินซูลินต่อเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ยและประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (EE) ของอนุภาคนาโนอินซูลิน (เตรียมที่ pH 6); (c) การกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม; (d) ภาพถ่าย TEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม
เป็นที่ทราบกันดีว่าไคโตซานเป็นพอลิอิเล็กโทรไลต์อ่อนที่มีค่า pKa เท่ากับ 6.5 มีประจุบวกในสภาวะกรดเนื่องจากหมู่เอมีนหลักถูกโปรตอนโดยไอออนไฮโดรเจน15 ดังนั้นจึงมักใช้เป็นตัวพาเพื่อห่อหุ้มโมเลกุลขนาดใหญ่ที่มีประจุลบ ในการศึกษานี้ ไคโตซานถูกนำมาใช้เพื่อห่อหุ้มอินซูลินที่มีจุดไอโซอิเล็กทริกเท่ากับ 5.3 เนื่องจากไคโตซานถูกใช้เป็นวัสดุเคลือบ เมื่อสัดส่วนของไคโตซานเพิ่มขึ้น ความหนาของชั้นนอกของอนุภาคนาโนก็จะเพิ่มขึ้นตามไปด้วย ส่งผลให้ขนาดอนุภาคเฉลี่ยใหญ่ขึ้น นอกจากนี้ ระดับไคโตซานที่สูงขึ้นยังสามารถห่อหุ้มอินซูลินได้มากขึ้น ในกรณีของเรา ประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (EE) สูงที่สุดเมื่ออัตราส่วนของไคโตซานและอินซูลินอยู่ที่ 2.5:1 และไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญใน EE เมื่ออัตราส่วนเพิ่มขึ้นต่อไป
นอกจากอัตราส่วนของไคโตซานและอินซูลินแล้ว ค่า pH ยังมีบทบาทสำคัญในการเตรียมนาโนอนุภาคด้วย Gan et al. 17 ศึกษาผลของ pH ต่อขนาดอนุภาคของนาโนอนุภาคไคโตซาน พวกเขาพบว่าขนาดอนุภาคลดลงอย่างต่อเนื่องจนกระทั่ง pH ถึง 6.0 และพบว่าขนาดอนุภาคเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญที่ pH > 6.0 ซึ่งสอดคล้องกับการสังเกตของเรา ปรากฏการณ์นี้เกิดจากข้อเท็จจริงที่ว่าเมื่อ pH เพิ่มขึ้น โมเลกุลของอินซูลินจะได้รับประจุลบที่พื้นผิว จึงส่งเสริมปฏิกิริยาทางไฟฟ้าสถิตกับสารประกอบไคโตซาน/โซเดียมไตรโพลีฟอสเฟต (TPP) ส่งผลให้ขนาดอนุภาคเล็กและ EE สูง อย่างไรก็ตาม เมื่อปรับ pH เป็น 6.5 หมู่เอมีนบนไคโตซานจะถูกดีโปรโตเนชัน ส่งผลให้ไคโตซานพับงอ ดังนั้น pH สูงจึงทำให้ไอออนเอมีนสัมผัสกับ TPP และอินซูลินน้อยลง ส่งผลให้การเชื่อมโยงข้ามต่ำลง ขนาดอนุภาคเฉลี่ยสุดท้ายใหญ่ขึ้น และ EE ต่ำลง
การวิเคราะห์คุณสมบัติทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคนาโนที่ผ่านการอบแห้งแบบแช่แข็งและการอบแห้งแบบพ่น สามารถเป็นแนวทางในการเลือกเทคนิคการทำให้แห้งและการขึ้นรูปผงที่ดีกว่า วิธีการที่เหมาะสมควรให้ความเสถียรของยา รูปทรงอนุภาคที่สม่ำเสมอ การบรรจุยาในปริมาณสูง และการละลายที่ดีในสารละลายดั้งเดิม ในการศึกษาครั้งนี้ เพื่อเปรียบเทียบเทคนิคทั้งสองให้ดียิ่งขึ้น จึงใช้อนุภาคนาโนอินซูลินที่มีหรือไม่มีแมนนิทอล 1% ในระหว่างการทำให้แห้ง แมนนิทอลใช้เป็นสารเพิ่มปริมาณหรือสารป้องกันการแข็งตัวในสูตรผงแห้งต่างๆ สำหรับการอบแห้งแบบแช่แข็งและการอบแห้งแบบพ่น สำหรับอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการอบแห้งแบบแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอล ดังแสดงในรูปที่ 2a พบโครงสร้างผงที่มีรูพรุนสูง มีพื้นผิวขนาดใหญ่ ไม่สม่ำเสมอ และขรุขระ ภายใต้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) ตรวจพบอนุภาคแยกเดี่ยวเพียงเล็กน้อยในผงหลังจากการทำให้แห้ง (รูปที่ 2e) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าอนุภาคนาโนส่วนใหญ่สลายตัวไปในระหว่างการอบแห้งแบบแช่แข็งโดยไม่มีสารป้องกันการแข็งตัว สำหรับอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการอบแห้งแบบแช่แข็งและการอบแห้งแบบพ่นที่มีแมนนิทอล 1% พบอนุภาคนาโนทรงกลมที่มีพื้นผิวเรียบ (รูปที่ 2b,d,f,h) อนุภาคนาโนอินซูลินที่อบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่ใช้แมนนิทอลยังคงมีรูปทรงกลมแต่มีรอยย่นบนพื้นผิว (รูปที่ 2c) ลักษณะพื้นผิวทรงกลมและรอยย่นจะกล่าวถึงเพิ่มเติมในการทดสอบพฤติกรรมการปลดปล่อยและการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ด้านล่าง จากลักษณะที่มองเห็นได้ของอนุภาคนาโนที่แห้งแล้ว ทั้งอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่ใช้แมนนิทอล และอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบแช่แข็งและอบแห้งแบบสเปรย์โดยใช้แมนนิทอล ให้ผลลัพธ์เป็นผงอนุภาคนาโนละเอียด (รูปที่ 2f,g,h) ยิ่งพื้นที่ผิวระหว่างพื้นผิวอนุภาคมีมากเท่าใด ความสามารถในการละลายก็จะยิ่งสูงขึ้น และดังนั้นอัตราการปลดปล่อยก็จะยิ่งสูงขึ้น
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยวิธีต่างๆ: (a) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอล; (b) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอล; (c) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบสเปรย์โดยไม่มีแมนนิทอล; (d) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบสเปรย์โดยมีแมนนิทอล; (e) ภาพของผงอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอล; (f) ภาพของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอล; (g) ภาพของผงอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบสเปรย์โดยไม่มีแมนนิทอล; (h) ภาพของผงอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งแบบสเปรย์โดยมีแมนนิทอล
ในระหว่างการอบแห้งแบบแช่แข็ง แมนนิทอลทำหน้าที่เป็นสารป้องกันการแข็งตัว ช่วยรักษาอนุภาคนาโนให้อยู่ในรูปทรงอสัณฐานและป้องกันความเสียหายจากผลึกน้ำแข็ง19 ในทางตรงกันข้าม ไม่มีการแช่แข็งในระหว่างการอบแห้งแบบสเปรย์ ดังนั้นจึงไม่จำเป็นต้องใช้แมนนิทอลในวิธีนี้ อันที่จริง อนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่มีแมนนิทอลให้ผลลัพธ์เป็นอนุภาคนาโนที่ละเอียดกว่าดังที่ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ อย่างไรก็ตาม แมนนิทอลยังคงสามารถทำหน้าที่เป็นสารเติมเต็มในกระบวนการอบแห้งแบบสเปรย์เพื่อให้อนุภาคนาโนมีโครงสร้างทรงกลมมากขึ้น20 (รูปที่ 2d) ซึ่งช่วยให้ได้พฤติกรรมการปลดปล่อยที่สม่ำเสมอของอนุภาคนาโนที่ถูกห่อหุ้มดังกล่าว นอกจากนี้ ยังเห็นได้ชัดว่าสามารถตรวจพบอนุภาคขนาดใหญ่บางส่วนในอนุภาคนาโนอินซูลินที่อบแห้งแบบแช่แข็งและแบบสเปรย์ที่มีแมนนิทอล (รูปที่ 2b,d) ซึ่งอาจเกิดจากการสะสมของแมนนิทอลในแกนกลางของอนุภาคพร้อมกับอินซูลินที่ถูกห่อหุ้ม ชั้นไคโตซาน: เป็นที่น่าสังเกตว่าในการศึกษานี้ เพื่อให้แน่ใจว่าโครงสร้างทรงกลมยังคงอยู่ครบถ้วนหลังจากการกำจัดน้ำ อัตราส่วนของแมนนิทอลและไคโตซานจึงถูกกำหนดไว้ที่ 5:1 เพื่อให้สารตัวเติมในปริมาณมากสามารถขยายขนาดอนุภาคของ NPs ที่แห้งได้ด้วย
การวิเคราะห์ด้วยสเปกโทรสโกปีแบบ Fourier transform infrared attenuated total reflection (FTIR-ATR) ใช้ในการระบุลักษณะของส่วนผสมทางกายภาพของอินซูลินอิสระ ไคโตซาน ไคโตซาน TPP และอินซูลิน อนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้สเปกโทรสโกปี FTIR-ATR ที่น่าสังเกตคือ พบความเข้มของแถบที่ 1641, 1543 และ 1412 cm-1 ในอนุภาคนาโนที่ถูกห่อหุ้มซึ่งทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งโดยใช้แมนนิทอล และในอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการพ่นสเปรย์โดยมีและไม่มีแมนนิทอล (รูปที่ 3) ดังที่ได้รายงานไว้ก่อนหน้านี้ การเพิ่มขึ้นของความแข็งแรงเหล่านี้เกี่ยวข้องกับการเชื่อมโยงระหว่างไคโตซาน TPP และอินซูลิน การตรวจสอบปฏิสัมพันธ์ระหว่างไคโตซานและอินซูลินแสดงให้เห็นว่าในสเปกตรัม FTIR ของอนุภาคนาโนไคโตซานที่บรรจุอินซูลิน แถบของไคโตซานจะทับซ้อนกับแถบของอินซูลิน ทำให้ความเข้มของคาร์บอนิล (1641 cm-1) และแถบอะมีน (1543 cm-1) เพิ่มขึ้น กลุ่มไตรโพลีฟอสเฟตของ TPP ถูกเชื่อมโยง ต่อกลุ่มแอมโมเนียมในไคโตซาน ทำให้เกิดแถบที่ 1412 cm-1
สเปกตรัม FTIR-ATR ของอินซูลินอิสระ ไคโตซาน สารผสมทางกายภาพของไคโตซาน/TPP/อินซูลิน และอนุภาคนาโนที่ผ่านการกำจัดน้ำด้วยวิธีการต่างๆ
นอกจากนี้ ผลลัพธ์เหล่านี้ยังสอดคล้องกับผลลัพธ์ที่แสดงใน SEM ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอนุภาคนาโนที่ถูกห่อหุ้มยังคงสภาพสมบูรณ์ทั้งเมื่อฉีดพ่นและทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งโดยใช้แมนนิทอล แต่หากไม่มีแมนนิทอล มีเพียงการทำให้แห้งด้วยการฉีดพ่นเท่านั้นที่ทำให้เกิดอนุภาคที่ถูกห่อหุ้ม ในทางตรงกันข้าม ผลลัพธ์สเปกตรัม FTIR-ATR ของอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอลนั้นคล้ายคลึงกับส่วนผสมทางกายภาพของไคโตซาน TPP และอินซูลินมาก ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าพันธะเชื่อมโยงระหว่างไคโตซาน TPP และอินซูลินนั้นไม่มีอยู่ในอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอลอีกต่อไป โครงสร้างของอนุภาคนาโนถูกทำลายระหว่างการทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งโดยไม่มีสารป้องกันการแข็งตัว ซึ่งสามารถเห็นได้จากผลลัพธ์ SEM (รูปที่ 2a) จากลักษณะทางสัณฐานวิทยาและผลลัพธ์ FTIR ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่แห้งแล้ว จึงใช้เฉพาะอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการแช่แข็ง ฉีดพ่น และปราศจากแมนนิทอลสำหรับการทดลองการสร้างใหม่ และอนุภาคนาโนที่ปราศจากแมนนิทอลเนื่องจาก... การสลายตัวของอนุภาคนาโนที่ปราศจากแมนนิทอลระหว่างกระบวนการทำให้แห้ง อภิปราย
การทำให้แห้งใช้สำหรับการเก็บรักษาในระยะยาวและการแปรรูปเป็นสูตรอื่นๆ ความสามารถของอนุภาคนาโนแห้งในการคืนสภาพหลังจากเก็บรักษาเป็นสิ่งสำคัญสำหรับการใช้งานในสูตรต่างๆ เช่น ยาเม็ดและฟิล์ม เราพบว่าขนาดอนุภาคเฉลี่ยของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยการพ่นโดยไม่มีแมนนิทอลเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยหลังจากคืนสภาพ ในทางกลับกัน ขนาดอนุภาคของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยการพ่นและแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอลเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1) ค่า PDI และ EE ไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญ (p > 0.05) หลังจากการรวมตัวใหม่ของอนุภาคนาโนทั้งหมดในการศึกษานี้ (ตารางที่ 1) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าอนุภาคส่วนใหญ่ยังคงสภาพเดิมหลังจากละลายใหม่ อย่างไรก็ตาม การเติมแมนนิทอลส่งผลให้ปริมาณอินซูลินในอนุภาคนาโนแมนนิทอลที่ผ่านการทำให้แห้งแบบแช่แข็งและแบบพ่นลดลงอย่างมาก (ตารางที่ 1) ในทางตรงกันข้าม ปริมาณอินซูลินในอนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยการพ่นโดยไม่มีแมนนิทอลยังคงเท่าเดิม (ตารางที่ 1)
เป็นที่ทราบกันดีว่าการบรรจุอนุภาคนาโนมีความสำคัญอย่างยิ่งเมื่อใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการนำส่งยา สำหรับอนุภาคนาโนที่มีการบรรจุต่ำ จำเป็นต้องใช้วัสดุในปริมาณมากเพื่อให้ถึงระดับการรักษา อย่างไรก็ตาม ความหนืดสูงของอนุภาคนาโนที่มีความเข้มข้นสูงดังกล่าวทำให้เกิดความไม่สะดวกและยากลำบากในการบริหารยาทางปากและสูตรยาฉีดตามลำดับ 22 นอกจากนี้ อนุภาคนาโนอินซูลินยังสามารถใช้ในการทำยาเม็ดและไบโอฟิล์มที่มีความหนืด 23, 24 ซึ่งต้องใช้อนุภาคนาโนในปริมาณมากที่ระดับการบรรจุต่ำ ส่งผลให้ยาเม็ดมีขนาดใหญ่และไบโอฟิล์มหนาซึ่งไม่เหมาะสำหรับการใช้ทางปาก ดังนั้น อนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งที่มีการบรรจุอินซูลินสูงจึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก ผลลัพธ์ของเราชี้ให้เห็นว่าการบรรจุอินซูลินสูงของอนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งแบบสเปรย์โดยปราศจากแมนนิทอลสามารถให้ข้อดีที่น่าสนใจมากมายสำหรับวิธีการนำส่งทางเลือกเหล่านี้
อนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดถูกเก็บไว้ในตู้เย็นเป็นเวลาสามเดือน ผลการวิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (SEM) แสดงให้เห็นว่ารูปร่างของอนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในระหว่างการเก็บรักษาสามเดือน (รูปที่ 4) หลังจากละลายในน้ำแล้ว อนุภาคนาโนทั้งหมดแสดงให้เห็นว่าประสิทธิภาพในการกักเก็บ (EE) ลดลงเล็กน้อย และปล่อยอินซูลินออกมาประมาณเล็กน้อย (~5%) ในระหว่างการเก็บรักษาสามเดือน (ตารางที่ 2) อย่างไรก็ตาม ขนาดอนุภาคเฉลี่ยของอนุภาคนาโนทั้งหมดเพิ่มขึ้น ขนาดอนุภาคของอนุภาคนาโนที่ผ่านการอบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่มีแมนนิทอลเพิ่มขึ้นเป็น 525 นาโนเมตร ในขณะที่อนุภาคนาโนที่ผ่านการอบแห้งแบบสเปรย์และการอบแห้งแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอลเพิ่มขึ้นเป็น 872 และ 921 นาโนเมตร ตามลำดับ (ตารางที่ 2)
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยวิธีต่างๆ ซึ่งเก็บรักษาไว้เป็นเวลาสามเดือน: (a) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยวิธีแช่แข็งโดยใช้แมนนิทอล; (b) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยวิธีพ่นโดยไม่ใช้แมนนิทอล; (c) ภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งด้วยวิธีพ่นโดยไม่ใช้แมนนิทอล
นอกจากนี้ ยังพบตะกอนในอนุภาคนาโนอินซูลินที่เตรียมใหม่โดยการพ่นแห้งด้วยแมนนิทอลและแช่แข็งแห้ง (รูปที่ S2) ซึ่งอาจเกิดจากอนุภาคขนาดใหญ่ไม่กระจายตัวในน้ำอย่างเหมาะสม ผลลัพธ์ทั้งหมดข้างต้นแสดงให้เห็นว่าเทคนิคการพ่นแห้งสามารถปกป้องอนุภาคนาโนอินซูลินจากการขาดน้ำ และสามารถบรรจุอนุภาคนาโนอินซูลินได้ในปริมาณสูงโดยไม่ต้องใช้สารเติมแต่งหรือสารป้องกันการแข็งตัวใดๆ
การทดสอบการคงอยู่ของอินซูลินในตัวกลาง pH = 2.5 ร่วมกับเปปซิน ทริปซิน และอัลฟา-ไคโมทริปซิน แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการปกป้องของอนุภาคนาโนจากการย่อยสลายด้วยเอนไซม์หลังจากการทำให้แห้ง เปรียบเทียบการคงอยู่ของอินซูลินในอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งกับอนุภาคนาโนที่เตรียมใหม่ โดยใช้อินซูลินอิสระเป็นตัวควบคุมเชิงลบ ในการศึกษาครั้งนี้ อินซูลินอิสระแสดงให้เห็นการกำจัดอินซูลินอย่างรวดเร็วภายใน 4 ชั่วโมงในการบำบัดด้วยเอนไซม์ทั้งสามชนิด (รูปที่ 5a–c) ในทางตรงกันข้าม การทดสอบการกำจัดอินซูลินของอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการแช่แข็งร่วมกับแมนนิทอล และอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งด้วยการพ่นสเปรย์โดยมีหรือไม่มีแมนนิทอล แสดงให้เห็นถึงการปกป้องอนุภาคนาโนเหล่านี้จากการย่อยสลายด้วยเอนไซม์ที่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งคล้ายกับอนุภาคนาโนอินซูลินที่เตรียมใหม่ (รูปที่ 1a-c) ด้วยความช่วยเหลือของอนุภาคนาโนในเปปซิน ทริปซิน และอัลฟา-ไคโมทริปซิน สามารถปกป้องอินซูลินได้มากกว่า 50%, 60% และ 75% ตามลำดับ ภายใน 4 ชั่วโมง ตามลำดับ (รูปที่ 5a–c) ความสามารถในการปกป้องอินซูลินนี้อาจเพิ่มโอกาสในการดูดซึมอินซูลินเข้าสู่กระแสเลือดได้มากขึ้น25 ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการอบแห้งแบบสเปรย์โดยมีหรือไม่มีแมนนิทอล และการอบแห้งแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอล สามารถรักษาความสามารถในการปกป้องอินซูลินของ NPs หลังจากการขาดน้ำได้
พฤติกรรมการปกป้องและการปลดปล่อยของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ขาดน้ำ: (a) การปกป้องอินซูลินในสารละลายเปปซิน; (b) การปกป้องอินซูลินในสารละลายทริปซิน; (c) การปกป้องอินซูลินโดยสารละลายอัลฟา-ไคโมทริปซิน; (d) พฤติกรรมการปลดปล่อยของอนุภาคนาโนที่ขาดน้ำในสารละลาย pH = 2.5; (e) พฤติกรรมการปลดปล่อยของอนุภาคนาโนที่ขาดน้ำในสารละลาย pH = 6.6; (f) พฤติกรรมการปลดปล่อยของอนุภาคนาโนที่ขาดน้ำในสารละลาย pH = 7.0
อนุภาคนาโนอินซูลินแห้งที่เตรียมใหม่และละลายแล้วถูกนำไปบ่มในบัฟเฟอร์ต่างๆ (pH = 2.5, 6.6, 7.0) ที่อุณหภูมิ 37 °C ซึ่งจำลองสภาพแวดล้อม pH ของกระเพาะอาหาร ลำไส้เล็กส่วนต้น และลำไส้เล็กส่วนบน เพื่อตรวจสอบผลของอินซูลินต่อภาวะดื้อต่ออินซูลิน พฤติกรรมการปลดปล่อยในสภาพแวดล้อมที่แตกต่างกัน ส่วนหนึ่งของระบบทางเดินอาหาร ที่ pH = 2.5 อนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลินและอนุภาคนาโนอินซูลินแห้งที่ละลายใหม่แสดงการปลดปล่อยอย่างรวดเร็วในช่วงชั่วโมงแรก ตามด้วยการปลดปล่อยอย่างช้าๆ ในอีก 5 ชั่วโมงถัดไป (รูปที่ 5d) การปลดปล่อยอย่างรวดเร็วในช่วงเริ่มต้นนี้น่าจะเป็นผลมาจากการหลุดออกของโมเลกุลโปรตีนบนพื้นผิวอย่างรวดเร็ว ซึ่งไม่ได้ถูกตรึงไว้ในโครงสร้างภายในของอนุภาคอย่างสมบูรณ์ ที่ pH = 6.5 อนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลินและอนุภาคนาโนอินซูลินแห้งที่ละลายใหม่แสดงการปลดปล่อยอย่างราบรื่นและช้าๆ ตลอด 6 ชั่วโมง เนื่องจาก pH ของสารละลายทดสอบใกล้เคียงกับ pH ของสารละลายที่เตรียมอนุภาคนาโน (รูปที่ 5e) ที่ pH = 7 อนุภาคนาโนไม่เสถียรและสลายตัวเกือบหมดภายในสองชั่วโมงแรก (รูปที่ 5f) ทั้งนี้เนื่องจากการดีโปรโตเนชันของไคโตซานเกิดขึ้นที่ pH สูงขึ้น ซึ่งส่งผลให้โครงข่ายพอลิเมอร์มีความหนาแน่นน้อยลงและมีการปลดปล่อยอินซูลินที่บรรจุอยู่
นอกจากนี้ อนุภาคนาโนอินซูลินที่อบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่ใช้แมนนิทอลแสดงให้เห็นรูปแบบการปลดปล่อยที่เร็วกว่าอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบอื่น (รูปที่ 5d–f) ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ อนุภาคนาโนอินซูลินที่อบแห้งโดยไม่ใช้แมนนิทอลมีขนาดอนุภาคเล็กที่สุด อนุภาคขนาดเล็กให้พื้นที่ผิวที่ใหญ่กว่า ดังนั้นยาที่เกี่ยวข้องส่วนใหญ่จะอยู่ที่หรือใกล้กับพื้นผิวของอนุภาค ส่งผลให้มีการปลดปล่อยยาอย่างรวดเร็ว26
ได้ทำการตรวจสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ของอนุภาคนาโนโดยใช้การทดสอบ MTT ดังแสดงในรูปที่ S4 พบว่าอนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดไม่มีผลกระทบอย่างมีนัยสำคัญต่อความมีชีวิตของเซลล์ที่ความเข้มข้น 50–500 μg/ml ซึ่งแสดงให้เห็นว่าอนุภาคนาโนที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดสามารถใช้ได้อย่างปลอดภัยเพื่อให้ได้ช่วงความเข้มข้นที่เหมาะสมสำหรับการรักษา
ตับเป็นอวัยวะหลักที่อินซูลินทำหน้าที่ทางสรีรวิทยา เซลล์ HepG2 เป็นเซลล์มะเร็งตับของมนุษย์ที่นิยมใช้เป็นแบบจำลองการดูดซึมของเซลล์ตับในหลอดทดลอง ในที่นี้ เซลล์ HepG2 ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินการดูดซึมของอนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งโดยใช้วิธีการแช่แข็งแห้งและการพ่นแห้ง การดูดซึมของเซลล์ถูกตรวจสอบโดยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์แบบคอนโฟคอลโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรีและการมองเห็นหลังจากการบ่มเป็นเวลาหลายชั่วโมงด้วยอินซูลิน FITC อิสระที่ความเข้มข้น 25 μg/mL อนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน FITC ที่เตรียมสดใหม่ และอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน FITC ที่ทำให้แห้งที่ความเข้มข้นของอินซูลินเท่ากัน มีการสังเกตการณ์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แบบคอนโฟคอลเชิงปริมาณ (CLSM) อนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งโดยไม่มีแมนนิทอลถูกทำลายระหว่างการทำให้แห้งและไม่ได้นำมาประเมินในการทดสอบนี้ ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ภายในเซลล์ของอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลินที่เตรียมสดใหม่ อนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งโดยมีแมนนิทอล และอนุภาคนาโนที่พ่นแห้งโดยมีและไม่มีแมนนิทอล การดูดซึมของอินซูลินที่ถูกห่อหุ้มด้วยแมนนิทอล (รูปที่ 6a) สูงกว่าอินซูลินอิสระ 4.3, 2.6, 2.4 และ 4.1 เท่า ตามลำดับ เมื่อเทียบกับกลุ่มอินซูลินอิสระ (รูปที่ 6b) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอินซูลินที่ถูกห่อหุ้มมีประสิทธิภาพในการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ได้ดีกว่าอินซูลินอิสระ โดยส่วนใหญ่เป็นผลมาจากขนาดที่เล็กกว่าของอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลินซึ่งผลิตขึ้นในการศึกษาครั้งนี้
การดูดซึมของเซลล์ HepG2 หลังจากการบ่ม 4 ชั่วโมงด้วย NPs ที่เตรียมใหม่และ NPs ที่ผ่านการทำให้แห้ง: (a) การกระจายตัวของการดูดซึม FITC-อินซูลินโดยเซลล์ HepG2 (b) ค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์ที่วิเคราะห์โดยโฟลว์ไซโตเมตรี (n = 3) *P < 0.05 เมื่อเทียบกับอินซูลินอิสระ
ในทำนองเดียวกัน ภาพ CLSM แสดงให้เห็นว่าความเข้มของการเรืองแสง FITC ของอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน FITC ที่เตรียมสดใหม่ และอนุภาคนาโนที่บรรจุอินซูลิน FITC ที่ผ่านการอบแห้งแบบสเปรย์ (โดยไม่มีแมนนิทอล) นั้นแรงกว่าตัวอย่างอื่นๆ มาก (รูปที่ 6a) นอกจากนี้ การเติมแมนนิทอลทำให้ความหนืดของสารละลายเพิ่มขึ้น ซึ่งเพิ่มความต้านทานต่อการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ ส่งผลให้การแพร่กระจายของอินซูลินลดลง ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอนุภาคนาโนที่ผ่านการอบแห้งแบบสเปรย์โดยปราศจากแมนนิทอลมีประสิทธิภาพในการดูดซึมเข้าสู่เซลล์สูงสุด เนื่องจากขนาดอนุภาคเล็กกว่าอนุภาคนาโนที่ผ่านการอบแห้งแบบแช่แข็งหลังจากละลายใหม่
ไคโตซาน (น้ำหนักโมเลกุลเฉลี่ย 100 กิโลดาลตัน, ดีอะซิทิเลต 75–85%) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) โซเดียมไตรโพลีฟอสเฟต (TPP) ซื้อจาก VWR (Radnor, Pennsylvania, USA) อินซูลินมนุษย์รีคอมบิแนนท์ที่ใช้ในการศึกษานี้มาจาก Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) อินซูลินมนุษย์ที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสซีนไอโซไทโอไซยาเนต (FITC) และ 4′,6-ไดอะมิดิโน-2-ฟีนิลอินโดลไดไฮโดรคลอไรด์ (DAPI) ซื้อจาก Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Canada) เซลล์สายพันธุ์ HepG2 ได้จาก ATCC (Manassas, Virginia, USA) สารเคมีอื่นๆ ทั้งหมดเป็นเกรดวิเคราะห์หรือเกรดโครมาโทกราฟี
เตรียมสารละลาย CS ความเข้มข้น 1 มก./มล. โดยละลายในน้ำกลั่นบริสุทธิ์ (DD water) ที่มีกรดอะซิติก 0.1% เตรียมสารละลาย TPP และอินซูลิน ความเข้มข้น 1 มก./มล. โดยละลายในน้ำกลั่นบริสุทธิ์และกรดอะซิติก 0.1% ตามลำดับ เตรียมพรีอิมัลชันโดยใช้เครื่องโฮโมจีไนเซอร์ความเร็วสูง Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind. Westbury, NY, USA) ขั้นตอนการเตรียมมีดังนี้: ขั้นแรก เติมสารละลาย TPP 2 มล. ลงในสารละลายอินซูลิน 4 มล. แล้วคนให้เข้ากันเป็นเวลา 30 นาที จากนั้น ค่อยๆ หยดสารละลายผสมลงในสารละลาย CS โดยใช้ไซริงค์ พร้อมกับการคนด้วยความเร็วสูง (10,000 รอบต่อนาที) เก็บส่วนผสมไว้ในอ่างน้ำแข็งพร้อมกับการคนด้วยความเร็วสูง (15,000 รอบต่อนาที) เป็นเวลา 30 นาที และปรับค่า pH ให้ได้ระดับที่ต้องการเพื่อให้ได้อนุภาคนาโนอินซูลินแบบเชื่อมโยง เพื่อทำให้เป็นเนื้อเดียวกันและลดขนาดอนุภาคต่อไป เพื่อลดขนาดของอนุภาคนาโนอินซูลิน จึงนำอนุภาคเหล่านั้นไปผ่านกระบวนการอัลตราโซนิกเพิ่มเติมอีก 30 นาทีในอ่างน้ำแข็ง โดยใช้เครื่องอัลตราโซนิกแบบหัวโพรบ (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Germany)
ทำการทดสอบอนุภาคนาโนอินซูลิน (NPS) เพื่อหาค่าเส้นผ่านศูนย์กลางเฉลี่ย (Z-average diameter), ดัชนีการกระจายตัว (PDI) และศักย์ซีตา (zeta potential) โดยใช้การวัดการกระเจิงแสงแบบไดนามิก (DLS) ด้วยเครื่อง Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Austria) โดยเจือจางในน้ำกลั่นบริสุทธิ์ (DD water) ที่อุณหภูมิ 25°C ลักษณะทางสัณฐานวิทยาและการกระจายขนาดถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) รุ่น Hitachi H7600 (Hitachi, Tokyo, Japan) และวิเคราะห์ภาพโดยใช้ซอฟต์แวร์การสร้างภาพของ Hitachi (Hitachi, Tokyo, Japan) เพื่อประเมินประสิทธิภาพการห่อหุ้ม (EE) และความจุในการบรรจุ (LC) ของอนุภาคนาโนอินซูลิน นำอนุภาคนาโนใส่ลงในหลอดกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันที่มีขนาดโมเลกุลตัดที่ 100 kDa และปั่นเหวี่ยงที่ 500 xg เป็นเวลา 30 นาที ปริมาณอินซูลินที่ไม่ถูกห่อหุ้มในสารละลายที่กรองแล้วถูกวัดโดยใช้ระบบ HPLC รุ่น Agilent 1100 Series (Agilent, Santa Clara, California, USA) ซึ่งประกอบด้วย... ปั๊มควอเทอร์นารี, เครื่องป้อนตัวอย่างอัตโนมัติ, เครื่องทำความร้อนคอลัมน์ และเครื่องตรวจจับ DAD อินซูลินได้รับการวิเคราะห์โดยใช้คอลัมน์ C18 (Zorbax, 3.5 μm, 4.6 mm × 150 mm, Agilent, USA) และตรวจจับที่ 214 nm เฟสเคลื่อนที่คืออะซีโตไนไตรล์และน้ำที่มี TFA 0.1% อัตราส่วนการไล่ระดับจาก 10/90 ถึง 100/0 และดำเนินการเป็นเวลา 10 นาที เฟสเคลื่อนที่ถูกปั๊มด้วยอัตราการไหล 1.0 ml/min อุณหภูมิคอลัมน์ถูกตั้งไว้ที่ 20 °C คำนวณเปอร์เซ็นต์ของ EE และ LC โดยใช้สมการ (1) และสมการ (2)
มีการทดสอบอัตราส่วน CS/อินซูลินหลายค่าตั้งแต่ 2.0 ถึง 4.0 เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของอินซูลินนาโนอนุภาค โดยเติมสารละลาย CS ในปริมาณที่แตกต่างกันในระหว่างการเตรียม ในขณะที่ส่วนผสมของอินซูลิน/TPP คงที่ อินซูลินนาโนอนุภาคถูกเตรียมในช่วง pH 4.0 ถึง 6.5 โดยควบคุม pH ของส่วนผสมอย่างระมัดระวังหลังจากเติมสารละลายทั้งหมด (อินซูลิน, TPP และ CS) ประสิทธิภาพในการกักเก็บยา (EE) และขนาดอนุภาคของอินซูลินนาโนอนุภาคได้รับการประเมินที่ค่า pH ต่างๆ และอัตราส่วนมวล CS/อินซูลิน เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพการก่อตัวของอินซูลินนาโนอนุภาค
นำอนุภาคนาโนอินซูลินที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้ววางลงบนภาชนะอะลูมิเนียมและปิดด้วยกระดาษทิชชู่ที่รัดแน่นด้วยเทป จากนั้น นำภาชนะที่ปิดสนิทแล้วไปวางในเครื่องอบแห้งแบบแช่แข็ง Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, USA) ที่ติดตั้งถาดอบแห้ง ตั้งอุณหภูมิและความดันสุญญากาศไว้ที่ -10 °C, 0.350 Torr ใน 2 ชั่วโมงแรก และ 0 °C และ 0.120 Torr ในอีก 22 ชั่วโมงที่เหลือจากทั้งหมด 24 ชั่วโมง เพื่อให้ได้อนุภาคนาโนอินซูลินแห้ง
เครื่องอบแห้งแบบสเปรย์ขนาดเล็ก Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, สวิตเซอร์แลนด์) ถูกนำมาใช้ในการผลิตอินซูลินแบบแคปซูล โดยเลือกใช้พารามิเตอร์การอบแห้งดังนี้: อุณหภูมิ 100 °C, อัตราการไหลของสารป้อน 3 ลิตร/นาที และอัตราการไหลของก๊าซ 4 ลิตร/นาที
อนุภาคนาโนอินซูลินก่อนและหลังการทำให้แห้งได้รับการวิเคราะห์โดยใช้สเปกโทรสโกปี FTIR-ATR อนุภาคนาโนที่ทำให้แห้งแล้ว รวมถึงอินซูลินและไคโตซานอิสระ ได้รับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ FTIR รุ่น Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) ที่ติดตั้งอุปกรณ์เสริมการสุ่มตัวอย่าง ATR สากล (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA) ค่าเฉลี่ยของสัญญาณได้มาจากการสแกน 16 ครั้งที่ความละเอียด 4 cm² ในช่วงความถี่ 4000-600 cm²
ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคนาโนอินซูลินแห้งได้รับการประเมินโดยภาพ SEM ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการแช่แข็งและทำให้แห้งด้วยการพ่น ซึ่งถ่ายโดยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนด้วยลำแสงไอออนโฟกัส Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregon, USA) พารามิเตอร์หลักที่ใช้คือแรงดัน 5 keV และกระแส 30 mA
อนุภาคนาโนอินซูลินที่ผ่านการทำให้แห้งทั้งหมดถูกละลายใหม่ในน้ำกลั่นบริสุทธิ์ ขนาดอนุภาค ค่า PDI ค่า EE และค่า LC ถูกทดสอบอีกครั้งโดยใช้วิธีเดียวกันกับที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ เพื่อประเมินคุณภาพหลังจากการทำให้แห้ง ความเสถียรของอนุภาคนาโนแอนไฮโดรอินซูลินก็ถูกวัดโดยการทดสอบคุณสมบัติของอนุภาคนาโนหลังจากการเก็บรักษาเป็นเวลานาน ในการศึกษาครั้งนี้ อนุภาคนาโนทั้งหมดหลังจากการทำให้แห้งถูกเก็บไว้ในตู้เย็นเป็นเวลาสามเดือน หลังจากเก็บรักษาไว้สามเดือน อนุภาคนาโนถูกทดสอบขนาดอนุภาค ค่า PDI ค่า EE และค่า LC
ละลาย NPs ที่เตรียมใหม่ 5 มิลลิลิตร ในสารละลายจำลองของเหลวในกระเพาะอาหาร (pH 1.2, มีเปปซิน 1%), ของเหลวในลำไส้ (pH 6.8, มีไตรปซิน 1%) หรือสารละลายไคโมไตรปซิน (100 กรัม/มิลลิลิตร ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต, pH 7.8) ปริมาตร 45 มิลลิลิตร เพื่อประเมินประสิทธิภาพของอินซูลินในการปกป้อง NPs หลังจากการขาดน้ำ จากนั้นบ่มที่อุณหภูมิ 37°C ด้วยความเร็วในการกวน 100 รอบต่อนาที เก็บตัวอย่างสารละลาย 500 ไมโครลิตร ในช่วงเวลาต่างๆ และหาความเข้มข้นของอินซูลินด้วยวิธี HPLC
พฤติกรรมการปลดปล่อยอินซูลินในหลอดทดลองของอนุภาคนาโนอินซูลินที่เตรียมใหม่และที่ผ่านการทำให้แห้งนั้น ได้รับการทดสอบโดยวิธีถุงไดอะไลซิส (ขนาดโมเลกุลที่ผ่านได้ 100 kDa, Spectra Por Inc.) อนุภาคนาโนที่เตรียมใหม่และที่ผ่านการทำให้แห้งแล้วถูกนำไปไดอะไลซิสในของเหลวที่มี pH 2.5, 6.6 และ 7.0 (สารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M, PBS) เพื่อจำลองสภาพแวดล้อม pH ของกระเพาะอาหาร ลำไส้เล็กส่วนต้น และลำไส้เล็กส่วนบน ตามลำดับ ตัวอย่างทั้งหมดถูกบ่มที่ 37 °C พร้อมกับการเขย่าอย่างต่อเนื่องที่ 200 รอบต่อนาที ดูดของเหลวออกจากถุงไดอะไลซิสขนาด 5 มล. ในช่วงเวลาต่อไปนี้: 0.5, 1, 2, 3, 4 และ 6 ชั่วโมง และเติมของเหลวไดอะไลซิสใหม่เข้าไปทันที วิเคราะห์การปนเปื้อนของอินซูลินในของเหลวโดยวิธี HPLC และคำนวณอัตราการปลดปล่อยอินซูลินจากอนุภาคนาโนจากอัตราส่วนของอินซูลินอิสระที่ปลดปล่อยออกมาต่ออินซูลินทั้งหมด ห่อหุ้มอยู่ในอนุภาคนาโน (สมการที่ 3)
เซลล์มะเร็งตับชนิด HepG2 ของมนุษย์ถูกเพาะเลี้ยงในจานเพาะเลี้ยงขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 60 มม. โดยใช้ Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ที่มีส่วนผสมของซีรั่มจากลูกวัว 10%, เพนิซิลลิน 100 IU/มล. และสเตรปโตมัยซิน 100 ไมโครกรัม/มล.29 เซลล์ถูกเลี้ยงไว้ที่อุณหภูมิ 37°C ความชื้นสัมพัทธ์ 95% และ CO2 5% สำหรับการทดสอบการดูดซึม เซลล์ HepG2 ถูกเพาะเลี้ยงที่ความหนาแน่น 1 × 10⁵ เซลล์/มล. ลงในระบบสไลด์ห้อง Nunc Lab-Tek 8 หลุม (Thermo Fisher, NY, USA) สำหรับการทดสอบความเป็นพิษต่อเซลล์ เซลล์ถูกเพาะเลี้ยงลงในจาน 96 หลุม (Corning, NY, USA) ที่ความหนาแน่น 5 × 10⁴ เซลล์/มล.
การทดสอบ MTT ถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์ของอนุภาคนาโนอินซูลินที่เตรียมใหม่และที่ผ่านการทำให้แห้ง30 เซลล์ HepG2 ถูกเพาะเลี้ยงในจาน 96 หลุมที่ความหนาแน่น 5 × 10⁴ เซลล์/มล. และเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 7 วันก่อนทำการทดสอบ อนุภาคนาโนอินซูลินถูกเจือจางให้มีความเข้มข้นต่างๆ (50 ถึง 500 ไมโครกรัม/มล.) ในอาหารเลี้ยงเซลล์แล้วจึงให้แก่เซลล์ หลังจากบ่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์จะถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS และบ่มด้วยอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มี MTT 0.5 มก./มล. เป็นเวลาอีก 4 ชั่วโมง ประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์โดยการวัดการลดลงของเอนไซม์ของ MTT สีเหลืองเป็นฟอร์มาซานสีม่วงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านจานสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ Tecan infinite M200 pro (Tecan, Männedorf, สวิตเซอร์แลนด์)
ประสิทธิภาพการดูดซึมของอนุภาคนาโนเข้าสู่เซลล์ได้รับการทดสอบโดยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่งแบบคอนโฟคอลและการวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรี แต่ละหลุมในระบบสไลด์ห้องทดลอง Nunc Lab-Tek ได้รับการบำบัดด้วย FITC-อินซูลินอิสระ, อนุภาคนาโนที่บรรจุ FITC-อินซูลิน และอนุภาคนาโน FITC-อินซูลินที่แห้งแล้วที่ความเข้มข้น 25 μg/mL ในความเข้มข้นเดียวกัน และบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง เซลล์ถูกล้าง 3 ครั้งด้วย PBS และตรึงด้วยพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% นิวเคลียสถูกย้อมด้วย 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) การระบุตำแหน่งของอินซูลินถูกสังเกตโดยใช้กล้องจุลทรรศน์เลเซอร์สแกนนิ่ง/คอนโฟคอลแบบสองโฟตอน Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tokyo, Japan) สำหรับการวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรี ใช้ความเข้มข้นเดียวกันของ FITC-อินซูลินอิสระ 10 μg/mL, อนุภาคนาโนที่บรรจุ FITC-อินซูลิน และอนุภาคนาโน FITC-อินซูลินที่แห้งแล้วที่ละลายใหม่ นำ FITC-insulin NPs ใส่ลงในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุมที่เพาะเซลล์ HepG2 ไว้ แล้วบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง หลังจากบ่มครบ 4 ชั่วโมงแล้ว นำเซลล์ออกและล้าง 3 ครั้งด้วย FBS จากนั้นนำเซลล์จำนวน 5 × 10⁴ เซลล์ต่อตัวอย่างไปวิเคราะห์ด้วยเครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์ BD LSR II (BD, Franklin Lakes, New Jersey, สหรัฐอเมริกา)
ค่าทั้งหมดแสดงในรูปของค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน การเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มทั้งหมดประเมินโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) หรือการทดสอบ t โดยใช้โปรแกรม IBM SPSS Statistics 26 สำหรับ Mac (IBM, Endicott, New York, USA) และถือว่าค่า p < 0.05 มีนัยสำคัญทางสถิติ
งานวิจัยนี้แสดงให้เห็นถึงความยืดหยุ่นและความสามารถของการอบแห้งแบบสเปรย์ในการกำจัดน้ำออกจากอนุภาคนาโนไคโตซาน/TPP/อินซูลินที่เชื่อมโยงกัน โดยมีการคืนสภาพที่ดีกว่าเมื่อเทียบกับวิธีการอบแห้งแบบแช่แข็งมาตรฐานที่ใช้สารเพิ่มปริมาณหรือสารป้องกันการแข็งตัว และมีความสามารถในการบรรจุที่สูงกว่า อนุภาคนาโนอินซูลินที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมมีขนาดอนุภาคเฉลี่ย 318 นาโนเมตร และประสิทธิภาพการห่อหุ้ม 99.4% ผลการวิเคราะห์ SEM และ FTIR หลังจากการกำจัดน้ำแสดงให้เห็นว่าโครงสร้างทรงกลมยังคงอยู่เฉพาะในอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบสเปรย์ทั้งที่มีและไม่มีแมนนิทอล และอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบแช่แข็งโดยมีแมนนิทอล แต่ในอนุภาคนาโนที่อบแห้งแบบแช่แข็งโดยไม่มีแมนนิทอลจะสลายตัวระหว่างการกำจัดน้ำ ในการทดสอบความสามารถในการคืนสภาพ อนุภาคนาโนอินซูลินที่อบแห้งแบบสเปรย์โดยไม่มีแมนนิทอลแสดงให้เห็นขนาดอนุภาคเฉลี่ยที่เล็กที่สุดและการบรรจุสูงสุดเมื่อคืนสภาพ พฤติกรรมการปลดปล่อยของอนุภาคนาโนที่กำจัดน้ำทั้งหมดเหล่านี้แสดงให้เห็นว่ามีการปลดปล่อยอย่างรวดเร็วในสารละลายที่มี pH = 2.5 และ pH = 7 และมีความเสถียรมากในสารละลายที่มี pH = 6.5 เมื่อเปรียบเทียบกับอนุภาคนาโนที่ละลายน้ำแล้วชนิดอื่นๆ อนุภาคนาโนที่อบแห้งด้วยสเปรย์โดยไม่ใช้แมนนิทอลแสดงการปลดปล่อยที่เร็วที่สุด ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับที่สังเกตได้ในการทดสอบการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ เนื่องจากอนุภาคนาโนที่อบแห้งด้วยสเปรย์โดยปราศจากแมนนิทอลยังคงรักษาประสิทธิภาพการดูดซึมเข้าสู่เซลล์ได้เกือบสมบูรณ์เมื่อเทียบกับอนุภาคนาโนที่เตรียมใหม่ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอนุภาคนาโนอินซูลินแห้งที่เตรียมโดยการอบแห้งด้วยสเปรย์โดยปราศจากแมนนิทอลนั้นเหมาะสมที่สุดสำหรับการแปรรูปต่อไปเป็นรูปแบบยาปราศจากน้ำอื่นๆ เช่น ยาเม็ดรับประทานหรือฟิล์มยึดเกาะทางชีวภาพ
เนื่องจากปัญหาด้านทรัพย์สินทางปัญญา ชุดข้อมูลที่สร้างและ/หรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษาครั้งนี้จึงไม่สามารถเปิดเผยต่อสาธารณะได้ แต่สามารถขอรับได้จากผู้เขียนแต่ละท่านเมื่อมีการร้องขออย่างสมเหตุสมผล
Kagan, A. โรคเบาหวานประเภทที่ 2: ที่มาทางสังคมและวิทยาศาสตร์ ภาวะแทรกซ้อนทางการแพทย์ และผลกระทบต่อผู้ป่วยและผู้อื่น (McFarlane, 2009)
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. และ Jiang, P. การพัฒนาการห่อหุ้มอินซูลิน: การบริหารยาทางปากเป็นไปได้แล้วหรือไม่? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019)
Wong, CY, Al-Salami, H. & Dass, CR ความก้าวหน้าล่าสุดในระบบนำส่งไลโปโซมบรรจุอินซูลินชนิดรับประทานสำหรับการรักษาโรคเบาหวาน การตีความ J. Pharmacy.549, 201–217 (2018)