บทความนี้เป็นส่วนหนึ่งของหัวข้อวิจัย “การปรับปรุงความต้านทานของพืชตระกูลถั่วต่อเชื้อโรคและศัตรูพืช” ดูบทความทั้งหมด 5 บทความ
เชื้อก่อโรคพืชที่เกิดจากเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ใช้กลยุทธ์หลายระดับในการเข้าทำลายพืชเจ้าบ้านต่างชนิดกัน งานวิจัยนี้เสนอการใช้ไดอะมีน แอล-ออร์นิทีน ซึ่งเป็นกรดอะมิโนที่ไม่ใช่โปรตีนและกระตุ้นการสังเคราะห์กรดอะมิโนจำเป็นอื่นๆ เป็นกลยุทธ์การจัดการทางเลือกเพื่อเพิ่มการตอบสนองระดับโมเลกุล สรีรวิทยา และชีวเคมีของถั่วฝักยาว (Phaseolus vulgaris L.) ต่อโรคราขาวที่เกิดจากเชื้อ Pseudomonas sclerotiorum การทดลองในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่า แอล-ออร์นิทีนยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใยของ S. pyrenoidosa อย่างมีนัยสำคัญในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ นอกจากนี้ยังสามารถลดความรุนแรงของโรคราขาวได้อย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาพเรือนกระจก ยิ่งไปกว่านั้น แอล-ออร์นิทีนยังกระตุ้นการเจริญเติบโตของพืชที่ได้รับการรักษา แสดงให้เห็นว่าความเข้มข้นของแอล-ออร์นิทีนที่ทดสอบนั้นไม่เป็นพิษต่อพืชที่ได้รับการรักษา นอกจากนี้ แอล-ออร์นิทีนยังช่วยเพิ่มการแสดงออกของสารต้านอนุมูลอิสระที่ไม่ใช่เอนไซม์ (ฟีนอลที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดและฟลาโวนอยด์) และสารต้านอนุมูลอิสระที่เป็นเอนไซม์ (คาตาเลส (CAT), เพอร์ออกซิเดส (POX) และโพลีฟีนอลออกซิเดส (PPO)) และเพิ่มการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระ 3 ยีน (PvCAT1, PvSOD และ PvGR) ยิ่งไปกว่านั้น การวิเคราะห์ทางคอมพิวเตอร์เผยให้เห็นการมีอยู่ของโปรตีนออกซาโลอะซิเตตอะเซทิลไฮโดรเลส (SsOAH) ที่คาดว่าจะมีอยู่ในจีโนมของ S. sclerotiorum ซึ่งมีความคล้ายคลึงอย่างมากกับโปรตีนออกซาโลอะซิเตตอะเซทิลไฮโดรเลส (SsOAH) ของ Aspergillus fijiensis (AfOAH) และ Penicillium sp. (PlOAH) ในแง่ของการวิเคราะห์การทำงาน โดเมนที่อนุรักษ์ไว้ และโครงสร้าง ที่น่าสนใจคือ การเติมแอล-ออร์นิทีนลงในอาหารเลี้ยงเชื้อมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB) ส่งผลให้การแสดงออกของยีน SsOAH ในเส้นใยของเชื้อรา S. sclerotiorum ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ในทำนองเดียวกัน การใช้แอล-ออร์นิทีนจากภายนอกก็ส่งผลให้การแสดงออกของยีน SsOAH ในเส้นใยของเชื้อราที่เก็บจากพืชที่ได้รับการรักษาลดลงอย่างมีนัยสำคัญเช่นกัน สุดท้าย การใช้แอล-ออร์นิทีนช่วยลดการหลั่งกรดออกซาลิกในทั้งอาหารเลี้ยงเชื้อ PDB และใบที่ติดเชื้อได้อย่างมีนัยสำคัญ สรุปได้ว่า แอล-ออร์นิทีนมีบทบาทสำคัญในการรักษาสถานะรีดอกซ์และเสริมสร้างการตอบสนองการป้องกันของพืชที่ติดเชื้อ ผลการศึกษาครั้งนี้อาจช่วยในการพัฒนาวิธีการใหม่ๆ ที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมในการควบคุมโรคราขาวและลดผลกระทบต่อการผลิตถั่วและพืชผลอื่นๆ
โรคราขาว ซึ่งเกิดจากเชื้อราก่อโรคเนื้อตาย Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary เป็นโรคที่ทำลายผลผลิตอย่างรุนแรงและเป็นภัยคุกคามร้ายแรงต่อการผลิตถั่ว (Phaseolus vulgaris L.) ทั่วโลก (Bolton et al., 2006) Sclerotinia sclerotiorum เป็นหนึ่งในเชื้อราก่อโรคพืชที่อาศัยอยู่ในดินที่ควบคุมได้ยากที่สุด มีพืชอาศัยหลากหลายชนิดกว่า 600 ชนิด และมีความสามารถในการทำลายเนื้อเยื่อของพืชอาศัยอย่างรวดเร็วโดยไม่จำเพาะเจาะจง (Liang and Rollins, 2018) ภายใต้สภาวะที่ไม่เอื้ออำนวย เชื้อราจะเข้าสู่ระยะวิกฤตของวงจรชีวิต โดยจะอยู่ในสภาวะพักตัวเป็นเวลานานในรูปของโครงสร้างสีดำ แข็ง คล้ายเมล็ดพืช เรียกว่า 'สเคลอโรเทีย' ในดิน หรือเป็นก้อนสีขาวฟูในเส้นใยหรือเนื้อเยื่อแกนกลางของลำต้นของพืชที่ติดเชื้อ (Schwartz et al., 2005) เชื้อรา S. sclerotiorum สามารถสร้างสเคลอโรเทีย ซึ่งช่วยให้มันอยู่รอดในแปลงที่ติดเชื้อได้เป็นเวลานานและคงอยู่ได้ในระหว่างการเกิดโรค (Schwartz et al., 2005) สเคลอโรเทียอุดมไปด้วยสารอาหาร สามารถคงอยู่ในดินได้เป็นเวลานาน และทำหน้าที่เป็นเชื้อก่อโรคหลักสำหรับการติดเชื้อในครั้งต่อไป (Schwartz et al., 2005) ภายใต้สภาวะที่เหมาะสม สเคลอโรเทียจะงอกและสร้างสปอร์ที่ลอยอยู่ในอากาศ ซึ่งสามารถแพร่เชื้อไปยังส่วนต่างๆ ของพืชที่อยู่เหนือพื้นดินได้ทั้งหมด รวมถึงแต่ไม่จำกัดเฉพาะดอก ลำต้น หรือฝัก (Schwartz et al., 2005)
เชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum ใช้กลยุทธ์หลายระดับในการเข้าทำลายพืชเจ้าบ้าน โดยเกี่ยวข้องกับกระบวนการที่ประสานกันหลายขั้นตอน ตั้งแต่การงอกของสเคลอโรเทียไปจนถึงการเกิดอาการ ในขั้นต้น S. sclerotiorum จะสร้างสปอร์ที่ลอยอยู่ในอากาศ (เรียกว่า แอสโคสปอร์) จากโครงสร้างคล้ายเห็ดที่เรียกว่า อะโพทีเซีย ซึ่งจะลอยอยู่ในอากาศและพัฒนาเป็นสเคลอโรเทียที่ไม่เคลื่อนที่บนเศษซากพืชที่ติดเชื้อ (Bolton et al., 2006) จากนั้นเชื้อราจะหลั่งกรดออกซาลิก ซึ่งเป็นปัจจัยก่อโรค เพื่อควบคุมค่า pH ของผนังเซลล์พืช ส่งเสริมการย่อยสลายด้วยเอนไซม์และการบุกรุกเนื้อเยื่อ (Hegedus and Rimmer, 2005) และยับยั้งการเกิดออกซิเดชันอย่างรวดเร็วของพืชเจ้าบ้าน กระบวนการทำให้เป็นกรดนี้จะทำให้ผนังเซลล์ของพืชอ่อนแอลง ซึ่งเป็นสภาพแวดล้อมที่เอื้อต่อการทำงานอย่างปกติและมีประสิทธิภาพของเอนไซม์ย่อยสลายผนังเซลล์ของเชื้อรา (CWDEs) ทำให้เชื้อก่อโรคสามารถเอาชนะอุปสรรคทางกายภาพและแทรกซึมเข้าไปในเนื้อเยื่อของพืชเจ้าบ้านได้ (Marciano et al., 1983) เมื่อแทรกซึมเข้าไปแล้ว S. sclerotiorum จะหลั่ง CWDEs หลายชนิด เช่น โพลีแกลแลคทูโรเนสและเซลลูเลส ซึ่งช่วยให้เชื้อแพร่กระจายในเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อและทำให้เกิดเนื้อเยื่อตาย การลุกลามของแผลและกลุ่มเส้นใยของเชื้อรานำไปสู่ลักษณะอาการของราขาว (Hegedus and Rimmer, 2005) ในขณะเดียวกัน พืชเจ้าบ้านจะจดจำรูปแบบโมเลกุลที่เกี่ยวข้องกับเชื้อก่อโรค (PAMPs) ผ่านตัวรับรู้รูปแบบ (PRRs) ซึ่งจะกระตุ้นให้เกิดเหตุการณ์ส่งสัญญาณหลายขั้นตอนที่ท้ายที่สุดแล้วจะกระตุ้นการตอบสนองการป้องกัน
แม้จะมีความพยายามควบคุมโรคมานานหลายทศวรรษ แต่ก็ยังคงขาดแคลนเชื้อพันธุ์ต้านทานโรคที่เพียงพอในถั่ว เช่นเดียวกับพืชเศรษฐกิจอื่นๆ เนื่องจากความต้านทาน การอยู่รอด และความสามารถในการปรับตัวของเชื้อโรค ดังนั้น การจัดการโรคจึงเป็นเรื่องที่ท้าทายอย่างยิ่งและต้องใช้กลยุทธ์แบบบูรณาการหลายด้าน ซึ่งรวมถึงการผสมผสานระหว่างการปฏิบัติทางการเกษตร การควบคุมทางชีวภาพ และสารฆ่าเชื้อราทางเคมี (O'Sullivan et al., 2021) การควบคุมโรคราขาวด้วยสารเคมีมีประสิทธิภาพมากที่สุด เพราะเมื่อใช้สารฆ่าเชื้อราอย่างถูกต้องและในเวลาที่เหมาะสม จะสามารถควบคุมการแพร่กระจายของโรค ลดความรุนแรงของการติดเชื้อ และลดการสูญเสียผลผลิตได้อย่างมีประสิทธิภาพ อย่างไรก็ตาม การใช้สารฆ่าเชื้อรามากเกินไปและการพึ่งพาสารฆ่าเชื้อรามากเกินไปอาจนำไปสู่การเกิดสายพันธุ์ต้านทานของ S. sclerotiorum และส่งผลเสียต่อสิ่งมีชีวิตที่ไม่ใช่เป้าหมาย สุขภาพของดิน และคุณภาพน้ำ (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024) ดังนั้น การค้นหาทางเลือกที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมจึงกลายเป็นสิ่งสำคัญอันดับต้นๆ
โพลีเอมีน (PAs) เช่น พิวเทรสซีน สเปอร์มิดีน สเปอร์มีน และคาดาเวอรีน สามารถใช้เป็นทางเลือกที่น่าสนใจในการต่อต้านเชื้อโรคพืชที่อาศัยอยู่ในดิน ซึ่งจะช่วยลดการใช้สารเคมีฆ่าเชื้อราที่เป็นอันตรายได้ทั้งหมดหรือบางส่วน (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024) ในพืชชั้นสูง โพลีเอมีนมีส่วนเกี่ยวข้องในกระบวนการทางสรีรวิทยาหลายอย่าง รวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง การแบ่งเซลล์ การเปลี่ยนแปลงรูปร่าง และการตอบสนองต่อความเครียดจากสิ่งแวดล้อมและสิ่งมีชีวิต (Killiny and Nehela, 2020) สารกลุ่ม PA สามารถทำหน้าที่เป็นสารต้านอนุมูลอิสระ ช่วยกำจัดอนุมูลอิสระออกซิเจน (ROS) รักษาภาวะสมดุลของปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดักชัน (Nehela และ Killiny, 2023) กระตุ้นยีนที่เกี่ยวข้องกับการป้องกัน (Romero et al., 2018) ควบคุมวิถีเมตาบอลิซึมต่างๆ (Nehela และ Killiny, 2023) ปรับเปลี่ยนฮอร์โมนพืชภายใน (Nehela และ Killiny, 2019) สร้างความต้านทานที่ได้มาอย่างเป็นระบบ (SAR) และควบคุมปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรค (Nehela และ Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022) เป็นที่น่าสังเกตว่ากลไกและบทบาทเฉพาะของ PA ในการป้องกันพืชจะแตกต่างกันไปตามชนิดของพืช เชื้อโรค และสภาพแวดล้อม PA ที่พบมากที่สุดในพืชนั้นถูกสังเคราะห์ทางชีวภาพจากโพลีอะมีนที่จำเป็นอย่าง L-ornithine (Killiny และ Nehela, 2020)
แอล-ออร์นิทีนมีบทบาทหลายอย่างในการเจริญเติบโตและพัฒนาการของพืช ตัวอย่างเช่น การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่าในข้าว (Oryza sativa) ออร์นิทีนอาจเกี่ยวข้องกับการหมุนเวียนไนโตรเจน (Liu et al., 2018) ผลผลิต คุณภาพ และกลิ่นหอมของข้าว (Lu et al., 2020) และการตอบสนองต่อความเครียดจากน้ำ (Yang et al., 2000) นอกจากนี้ การให้แอล-ออร์นิทีนจากภายนอกยังช่วยเพิ่มความทนทานต่อภัยแล้งในหัวบีท (Beta vulgaris) อย่างมีนัยสำคัญ (Hussein et al., 2019) และบรรเทาความเครียดจากเกลือในหัวหอม (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) และต้นมะม่วงหิมพานต์ (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012) บทบาทที่เป็นไปได้ของแอล-ออร์นิทีนในการป้องกันความเครียดจากปัจจัยทางชีวภาพอาจเกิดจากการมีส่วนร่วมในการสะสมโพรลีนในพืชที่ได้รับการบำบัด ตัวอย่างเช่น ยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญโพรลีน เช่น ยีนออร์นิทีนเดลต้าอะมิโนทรานสเฟอเรส (delta-OAT) และยีนโพรลีนดีไฮโดรจีเนส (ProDH1 และ ProDH2) เคยมีรายงานว่าเกี่ยวข้องกับการป้องกันของ Nicotiana benthamiana และ Arabidopsis thaliana ต่อเชื้อ Pseudomonas syringae ที่ไม่ใช่พืชอาศัย (Senthil-Kumar และ Mysore, 2012) ในทางกลับกัน ออร์นิทีนดีคาร์บอกซิเลส (ODC) ของเชื้อรามีความจำเป็นต่อการเจริญเติบโตของเชื้อก่อโรค (Singh et al., 2020) การกำหนดเป้าหมาย ODC ของ Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ผ่านการยับยั้งยีนที่เหนี่ยวนำโดยพืชอาศัย (HIGS) ช่วยเพิ่มความต้านทานของต้นมะเขือเทศต่อโรคเหี่ยวฟิวซาเรียมได้อย่างมีนัยสำคัญ (Singh et al., 2020) อย่างไรก็ตาม บทบาทที่เป็นไปได้ของการใช้สารออร์นิทีนจากภายนอกเพื่อต่อต้านความเครียดทางชีวภาพ เช่น เชื้อโรคพืช ยังไม่ได้รับการศึกษาอย่างละเอียด ที่สำคัญกว่านั้น ผลกระทบของออร์นิทีนต่อความต้านทานโรค และปรากฏการณ์ทางชีวเคมีและสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้อง ยังคงไม่ได้รับการสำรวจอย่างกว้างขวาง
การทำความเข้าใจความซับซ้อนของการติดเชื้อรา S. sclerotiorum ในพืชตระกูลถั่วมีความสำคัญต่อการพัฒนากลยุทธ์การควบคุมที่มีประสิทธิภาพ ในการศึกษาครั้งนี้ เรามีเป้าหมายที่จะระบุบทบาทที่เป็นไปได้ของไดอะมีน L-ornithine ในฐานะปัจจัยสำคัญในการเสริมสร้างกลไกการป้องกันและความต้านทานของพืชตระกูลถั่วต่อการติดเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum เราตั้งสมมติฐานว่า นอกเหนือจากการเสริมสร้างการตอบสนองการป้องกันของพืชที่ติดเชื้อแล้ว L-ornithine ยังมีบทบาทสำคัญในการรักษาสถานะรีดอกซ์ เราเสนอว่าผลกระทบที่เป็นไปได้ของ L-ornithine เกี่ยวข้องกับการควบคุมกลไกการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระทั้งแบบเอนไซม์และไม่ใช้เอนไซม์ และการรบกวนปัจจัยก่อโรค/ความรุนแรงของเชื้อราและโปรตีนที่เกี่ยวข้อง การทำงานสองด้านนี้ของ L-ornithine ทำให้มันเป็นตัวเลือกที่น่าสนใจสำหรับกลยุทธ์ที่ยั่งยืนในการบรรเทาผลกระทบของโรคราขาวและเพิ่มความต้านทานของพืชตระกูลถั่วทั่วไปต่อเชื้อราก่อโรคที่มีศักยภาพนี้ ผลการศึกษาในครั้งนี้อาจช่วยในการพัฒนาวิธีการควบคุมโรคราขาวที่เป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมและลดผลกระทบต่อการผลิตพืชตระกูลถั่วได้
ในการศึกษาครั้งนี้ ใช้ถั่วฝักยาวพันธุ์การค้าที่อ่อนแอต่อโรค คือ พันธุ์กิซา 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) เป็นวัสดุในการทดลอง เมล็ดพันธุ์ที่สมบูรณ์ได้รับความอนุเคราะห์จากแผนกวิจัยพืชตระกูลถั่ว สถาบันวิจัยพืชไร่ (FCRI) ศูนย์วิจัยการเกษตร (ARC) ประเทศอียิปต์ นำเมล็ด 5 เมล็ดไปเพาะในกระถางพลาสติก (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 35 ซม. ความลึก 50 ซม.) ที่บรรจุด้วยดินที่ติดเชื้อรา S. sclerotiorum ภายใต้สภาพเรือนกระจก (25 ± 2 °C ความชื้นสัมพัทธ์ 75 ± 1% แสง 8 ชั่วโมง/ความมืด 16 ชั่วโมง) เมื่อเพาะเมล็ดได้ 7-10 วัน ต้นกล้าจะถูกคัดให้เหลือเพียง 2 ต้นที่มีการเจริญเติบโตสม่ำเสมอและมีใบครบ 3 ใบในแต่ละกระถาง รดน้ำต้นไม้ทุกสองสัปดาห์และใส่ปุ๋ยเดือนละครั้งในอัตราที่แนะนำสำหรับพันธุ์นั้นๆ
ในการเตรียมสารละลาย L-ornithinediamine (หรือที่รู้จักกันในชื่อ (+)-(S)-2,5-diaminopentanoic acid; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ความเข้มข้น 500 มก./ลิตร ขั้นแรกให้ละลาย L-ornithinediamine 50 มก. ในน้ำกลั่นปราศจากเชื้อ 100 มิลลิลิตร จากนั้นจึงเจือจางสารละลายเข้มข้นนี้และนำไปใช้ในการทดลองต่อไป โดยสรุปคือ ได้ทำการทดสอบความเข้มข้นของ L-ornithine จำนวน 6 ชุด (12.5, 25, 50, 75, 100 และ 125 มก./ลิตร) ในหลอดทดลอง นอกจากนี้ ยังใช้น้ำกลั่นปราศจากเชื้อเป็นตัวควบคุมเชิงลบ (Mock) และใช้สารฆ่าเชื้อราทางการค้า “Rizolex-T” ชนิดผงละลายน้ำได้ 50% (โทโคลฟอส-เมทิล 20% + ไทแรม 30%; บริษัท KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals, Kafr El Zayat, จังหวัด Gharbia, อียิปต์) เป็นตัวควบคุมเชิงบวก สารฆ่าเชื้อราทางการค้า “Rizolex-T” ได้รับการทดสอบในหลอดทดลองที่ความเข้มข้นห้าระดับ (2, 4, 6, 8 และ 10 มก./ลิตร)
เก็บตัวอย่างลำต้นและฝักถั่วเหลืองที่มีอาการของโรคราขาว (อัตราการระบาด: 10–30%) จากฟาร์มเชิงพาณิชย์ แม้ว่าพืชที่ติดเชื้อส่วนใหญ่จะถูกระบุชนิด/พันธุ์แล้ว (พันธุ์เชิงพาณิชย์ที่อ่อนแอคือ Giza 3) แต่บางส่วน โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่ได้จากตลาดท้องถิ่น เป็นพืชที่ไม่ทราบชนิด นำวัสดุที่ติดเชื้อที่เก็บมาฆ่าเชื้อที่ผิวด้วยสารละลายโซเดียมไฮโปคลอไรต์ 0.5% เป็นเวลา 3 นาที จากนั้นล้างหลายครั้งด้วยน้ำกลั่นปราศจากเชื้อและเช็ดให้แห้งด้วยกระดาษกรองปราศจากเชื้อเพื่อขจัดน้ำส่วนเกิน จากนั้นตัดส่วนที่ติดเชื้อเป็นชิ้นเล็กๆ จากเนื้อเยื่อส่วนกลาง (ระหว่างเนื้อเยื่อที่แข็งแรงและเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ) นำไปเพาะเลี้ยงบนอาหารเลี้ยงเชื้อมันฝรั่งเดกซ์โทรสอะการ์ (PDA) และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C โดยมีวงจรแสง 12 ชั่วโมง/ความมืด 12 ชั่วโมง เป็นเวลา 5 วัน เพื่อกระตุ้นการสร้างสเคลอโรเทีย นอกจากนี้ยังใช้วิธีการแยกเชื้อราจากปลายเส้นใยเพื่อแยกเชื้อราจากวัฒนธรรมที่ผสมหรือปนเปื้อนด้วย เชื้อราที่แยกได้บริสุทธิ์นั้นได้รับการระบุครั้งแรกโดยอาศัยลักษณะทางสัณฐานวิทยาของการเพาะเลี้ยง จากนั้นจึงได้รับการยืนยันว่าเป็น S. sclerotiorum โดยอาศัยลักษณะทางกล้องจุลทรรศน์ สุดท้าย เชื้อราที่แยกได้บริสุทธิ์ทั้งหมดได้รับการทดสอบความสามารถในการก่อโรคในถั่วฝักยาวพันธุ์ Giza 3 ที่อ่อนแอต่อโรค เพื่อให้เป็นไปตามหลักการของ Koch
นอกจากนี้ เชื้อ S. sclerotiorum ที่รุกรานมากที่สุด (เชื้อหมายเลข 3) ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดยอาศัยลำดับเบสของ Internal Transcribed Spacer (ITS) ตามที่อธิบายไว้โดย White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 โดยสรุปคือ เชื้อแยกถูกเพาะเลี้ยงในน้ำซุปมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB) และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C เป็นเวลา 5–7 วัน จากนั้นจึงเก็บเส้นใยเชื้อรา กรองผ่านผ้าขาวบาง ล้างสองครั้งด้วยน้ำปราศจากเชื้อ และทำให้แห้งด้วยกระดาษกรองปราศจากเชื้อ แยกดีเอ็นเอจีโนมโดยใช้ชุด Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) จากนั้นจึงทำการเพิ่มปริมาณบริเวณ ITS rDNA โดยใช้คู่ไพรเมอร์เฉพาะ ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ขนาดที่คาดไว้: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017) ผลิตภัณฑ์ PCR ที่บริสุทธิ์แล้วถูกส่งไปทำการลำดับเบส (บริษัท Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.) ลำดับเบสของ ITS rDNA ถูกลำดับแบบสองทิศทางโดยใช้วิธีการลำดับเบสแบบ Sanger จากนั้นจึงนำลำดับเบสที่ได้จากการประกอบไปเปรียบเทียบกับข้อมูลล่าสุดใน GenBank และศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) โดยใช้ซอฟต์แวร์ BLASTn ลำดับการค้นหาถูกนำไปเปรียบเทียบกับสายพันธุ์/ไอโซเลตของ S. sclerotiorum อีก 20 สายพันธุ์ที่ดึงมาจากข้อมูลล่าสุดใน NCBI GenBank (ตารางเสริม S1) โดยใช้ ClustalW ในแพ็คเกจการวิเคราะห์พันธุศาสตร์วิวัฒนาการระดับโมเลกุล (MEGA-11; เวอร์ชัน 11) (Kumar et al., 2024) การวิเคราะห์วิวัฒนาการดำเนินการโดยใช้วิธีความน่าจะเป็นสูงสุดและแบบจำลองการแทนที่นิวคลีโอไทด์แบบย้อนกลับได้ทั่วไป (Nei และ Kumar, 2000) แสดงแผนภูมิที่มีค่า log-likelihood สูงสุด แผนภูมิเริ่มต้นสำหรับการค้นหาแบบฮิวริสติกถูกเลือกโดยการเลือกแผนภูมิที่มีค่า log-likelihood สูงกว่าระหว่างแผนภูมิแบบ Neighbor-Joining (NJ) (Kumar et al., 2024) และแผนภูมิแบบ Maximum Parsimony (MP) แผนภูมิ NJ ถูกสร้างขึ้นโดยใช้เมทริกซ์ระยะทางแบบคู่ที่คำนวณโดยใช้แบบจำลองแบบย้อนกลับได้ทั่วไป (Nei และ Kumar, 2000)
ได้ทำการทดสอบฤทธิ์ต้านแบคทีเรียของแอล-ออร์นิทีนและสารฆ่าเชื้อแบคทีเรีย “ริโซเล็กซ์-ที” ในหลอดทดลองโดยวิธีแพร่กระจายบนวุ้น วิธีการ: นำสารละลายเข้มข้นของแอล-ออร์นิทีน (500 มก./ลิตร) ในปริมาณที่เหมาะสมมาผสมให้เข้ากันกับอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA 10 มล. เพื่อเตรียมสารละลายที่มีความเข้มข้นสุดท้าย 12.5, 25, 50, 75, 100 และ 125 มก./ลิตร ตามลำดับ ใช้สารฆ่าเชื้อรา “ริโซเล็กซ์-ที” 5 ความเข้มข้น (2, 4, 6, 8 และ 10 มก./ลิตร) และน้ำกลั่นปราศจากเชื้อเป็นตัวควบคุม หลังจากอาหารเลี้ยงเชื้อแข็งตัวแล้ว นำชิ้นส่วนไมซีเลียมที่เตรียมสดใหม่ของเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum ขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 4 มม. ไปวางไว้ตรงกลางจานเพาะเชื้อ และเลี้ยงที่อุณหภูมิ 25±2°C จนกระทั่งไมซีเลียมปกคลุมจานเพาะเชื้อควบคุมทั้งหมด จากนั้นจึงบันทึกการเจริญเติบโตของเชื้อรา คำนวณเปอร์เซ็นต์การยับยั้งการเจริญเติบโตในแนวรัศมีของ S. sclerotiorum โดยใช้สมการที่ 1:
การทดลองนี้ทำซ้ำสองครั้ง โดยมีตัวอย่างทางชีวภาพ 6 ชุดสำหรับแต่ละกลุ่มควบคุม/กลุ่มทดลอง และกระถาง 5 ใบ (กระถางละ 2 ต้น) สำหรับแต่ละตัวอย่างทางชีวภาพ ตัวอย่างทางชีวภาพแต่ละชุดได้รับการวิเคราะห์สองครั้ง (ตัวอย่างทางเทคนิค 2 ชุด) เพื่อให้แน่ใจในความถูกต้อง ความน่าเชื่อถือ และความสามารถในการทำซ้ำของผลการทดลอง นอกจากนี้ ยังใช้การวิเคราะห์การถดถอยแบบโพรบิตเพื่อคำนวณความเข้มข้นที่ยับยั้งได้ครึ่งหนึ่ง (IC50) และ IC99 (Prentice, 1976)
เพื่อประเมินศักยภาพของแอล-ออร์นิทีนภายใต้สภาพเรือนกระจก จึงได้ทำการทดลองในกระถางสองครั้งติดต่อกัน โดยสรุปคือ กระถางถูกเติมด้วยดินเหนียวผสมทรายที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (3:1) และใส่เชื้อ S. sclerotiorum ที่เตรียมสดใหม่ลงไป ขั้นแรก เชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ที่แพร่กระจายได้ดีที่สุด (สายพันธุ์ที่ 3) ถูกเพาะเลี้ยงโดยการตัดสเคลอโรเทียมครึ่งหนึ่ง วางคว่ำหน้าลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA และบ่มที่อุณหภูมิ 25°C ในที่มืดสนิท (24 ชั่วโมง) เป็นเวลา 4 วัน เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเส้นใย จากนั้นจึงนำชิ้นส่วนวุ้นขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 5 มม. จำนวน 4 ชิ้นจากขอบด้านหน้ามาเพาะเชื้อด้วยส่วนผสมของรำข้าวสาลีและรำข้าวที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว 100 กรัม (1:1, v/v) และบ่มขวดทดลองทั้งหมดที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C ภายใต้รอบแสง 12 ชั่วโมง/ความมืด 12 ชั่วโมง เป็นเวลา 5 วัน เพื่อกระตุ้นการสร้างสเคลอโรเทียม นำส่วนผสมในขวดทดลองทั้งหมดมาผสมให้เข้ากันอย่างทั่วถึงก่อนเติมดิน จากนั้นใส่ส่วนผสมรำข้าวที่มีเชื้อจุลินทรีย์ 100 กรัมลงในแต่ละกระถางเพื่อให้ความเข้มข้นของเชื้อจุลินทรีย์คงที่ รดน้ำกระถางที่ใส่เชื้อแล้วเพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเชื้อรา และนำไปวางไว้ในเรือนกระจกเป็นเวลา 7 วัน
จากนั้นจึงนำเมล็ดพันธุ์ถั่วพันธุ์ Giza 3 จำนวน 5 เมล็ดไปปลูกในกระถางแต่ละใบ สำหรับกระถางที่ได้รับการบำบัดด้วย L-ornithine และสารฆ่าเชื้อรา Rizolex-T เมล็ดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วจะถูกแช่ในสารละลายของสารประกอบทั้งสองชนิดเป็นเวลา 2 ชั่วโมง โดยมีความเข้มข้น IC99 สุดท้ายประมาณ 250 มก./ลิตร และ 50 มก./ลิตร ตามลำดับ แล้วจึงผึ่งลมให้แห้งเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนนำไปปลูก ในทางกลับกัน เมล็ดจะถูกแช่ในน้ำกลั่นที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วเพื่อใช้เป็นกลุ่มควบคุมเชิงลบ หลังจาก 10 วัน ก่อนการรดน้ำครั้งแรก ต้นกล้าจะถูกคัดออก เหลือเพียงต้นกล้าที่สมบูรณ์ 2 ต้นในแต่ละกระถาง นอกจากนี้ เพื่อให้แน่ใจว่ามีการติดเชื้อ S. sclerotiorum ลำต้นของต้นถั่วที่อยู่ในระยะการเจริญเติบโตเดียวกัน (10 วัน) จะถูกตัดในสองตำแหน่งที่แตกต่างกันโดยใช้มีดผ่าตัดที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว และใส่ส่วนผสมรำข้าวที่มีเชื้อประมาณ 0.5 กรัมลงในแต่ละแผล จากนั้นจึงให้ความชื้นสูงเพื่อกระตุ้นการติดเชื้อและการพัฒนาของโรคในพืชที่ได้รับการปลูกเชื้อทั้งหมด ต้นพืชกลุ่มควบคุมถูกทำให้เกิดบาดแผลในลักษณะเดียวกัน และใส่ส่วนผสมรำข้าวปลอดเชื้อที่ปราศจากเชื้อราในปริมาณเท่ากัน (0.5 กรัม) ลงในบาดแผล จากนั้นจึงรักษาสภาพที่มีความชื้นสูงเพื่อจำลองสภาพแวดล้อมที่เอื้อต่อการเกิดโรคและเพื่อให้เกิดความสม่ำเสมอระหว่างกลุ่มทดลอง
วิธีการรักษา: ต้นกล้าถั่วได้รับการรดน้ำด้วยสารละลายแอล-ออร์นิทีน (250 มก./ลิตร) หรือสารฆ่าเชื้อราไรโซเล็กซ์-ที (50 มก./ลิตร) ปริมาณ 500 มล. โดยการรดดิน จากนั้นทำการรักษาซ้ำ 3 ครั้ง โดยเว้นระยะห่าง 10 วัน ต้นกล้ากลุ่มควบคุมได้รับการรดน้ำด้วยน้ำกลั่นปราศจากเชื้อปริมาณ 500 มล. การรักษาทั้งหมดดำเนินการภายใต้สภาพเรือนกระจก (25 ± 2°C, ความชื้นสัมพัทธ์ 75 ± 1% และช่วงเวลาแสง 8 ชั่วโมง/ความมืด 16 ชั่วโมง) กระถางทั้งหมดได้รับการรดน้ำทุกสองสัปดาห์ และได้รับการฉีดพ่นปุ๋ย NPK ที่สมดุล (20-20-20 มีกำมะถัน 3.6% และธาตุอาหารรอง TE; Zain Seeds, อียิปต์) เดือนละครั้ง ในความเข้มข้น 3–4 กรัม/ลิตร ตามคำแนะนำสำหรับพันธุ์เฉพาะและคำแนะนำของผู้ผลิต เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ใบที่เจริญเติบโตเต็มที่ (ใบที่ 2 และ 3 จากด้านบน) จากตัวอย่างชีวภาพแต่ละชุดจะถูกเก็บรวบรวมที่ 72 ชั่วโมงหลังการบำบัด (hpt) นำมาบดให้เป็นเนื้อเดียวกัน รวมกัน และเก็บรักษาไว้ที่ -80 °C เพื่อทำการวิเคราะห์เพิ่มเติม ซึ่งรวมถึงแต่ไม่จำกัดเพียง การระบุตำแหน่งทางเคมีของตัวบ่งชี้ความเครียดจากออกซิเดชัน การเกิดออกซิเดชันของไขมัน สารต้านอนุมูลอิสระทั้งแบบเอนไซม์และไม่ใช่เอนไซม์ และการแสดงออกของยีน
ความรุนแรงของการติดเชื้อราขาวได้รับการประเมินทุกสัปดาห์เป็นเวลา 21 วันหลังการฉีดเชื้อ (dpi) โดยใช้มาตราส่วน 1–9 (ตารางเสริม S2) ตามมาตราส่วนของ Petzoldt และ Dickson (1996) ที่ปรับปรุงโดย Teran et al. (2006) โดยสรุปคือ ตรวจสอบลำต้นและกิ่งของต้นถั่วโดยเริ่มจากจุดที่ฉีดเชื้อเพื่อติดตามการลุกลามของแผลตามปล้องและข้อต่อ จากนั้นวัดระยะห่างของแผลจากจุดที่ฉีดเชื้อไปยังจุดที่ไกลที่สุดตามลำต้นหรือกิ่ง และกำหนดคะแนน 1–9 ตามตำแหน่งของแผล โดย (1) หมายถึงไม่มีการติดเชื้อที่มองเห็นได้ใกล้จุดที่ฉีดเชื้อ และ (2–9) หมายถึงขนาดของแผลเพิ่มขึ้นอย่างค่อยเป็นค่อยไปและการลุกลามตามข้อต่อ/ปล้อง (ตารางเสริม S2) จากนั้นแปลงความรุนแรงของการติดเชื้อราขาวเป็นเปอร์เซ็นต์โดยใช้สูตร 2:
นอกจากนี้ พื้นที่ใต้เส้นโค้งการลุกลามของโรค (AUDPC) คำนวณโดยใช้สูตร (Shaner และ Finney, 1977) ซึ่งได้รับการปรับปรุงใหม่สำหรับโรคเน่าขาวของถั่วเหลือง (Chauhan et al., 2020) โดยใช้สมการที่ 3:
โดยที่ Yi = ความรุนแรงของโรค ณ เวลา ti, Yi+1 = ความรุนแรงของโรค ณ เวลา ti+1 ครั้งถัดไป, ti = เวลาของการวัดครั้งแรก (เป็นวัน), ti+1 = เวลาของการวัดครั้งถัดไป (เป็นวัน), n = จำนวนจุดเวลาหรือจุดสังเกตทั้งหมด พารามิเตอร์การเจริญเติบโตของต้นถั่ว ได้แก่ ความสูงของต้น (ซม.), จำนวนกิ่งต่อต้น และจำนวนใบต่อต้น ถูกบันทึกทุกสัปดาห์เป็นเวลา 21 วัน ในตัวอย่างทดลองทั้งหมด
ในแต่ละชุดการทดลองซ้ำทางชีวภาพ จะเก็บตัวอย่างใบ (ใบที่สองและสามที่เจริญเติบโตเต็มที่จากด้านบน) ในวันที่ 45 หลังการทดลอง (15 วันหลังจากการทดลองครั้งสุดท้าย) แต่ละชุดการทดลองซ้ำทางชีวภาพประกอบด้วยกระถางห้าใบ (กระถางละสองต้น) ใช้เนื้อเยื่อที่บดแล้วประมาณ 500 มิลลิกรัมสำหรับการสกัดรงควัตถุสังเคราะห์แสง (คลอโรฟิลล์เอ คลอโรฟิลล์บี และแคโรทีนอยด์) โดยใช้แอซิโตน 80% ที่อุณหภูมิ 4 °C ในที่มืด หลังจาก 24 ชั่วโมง นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยง และเก็บส่วนของเหลวใสเพื่อหาปริมาณคลอโรฟิลล์เอ คลอโรฟิลล์บี และแคโรทีนอยด์ด้วยวิธีวัดสีโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (บริษัท Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น) ตามวิธีการของ (Lichtenthaler, 1987) โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นสามค่าที่แตกต่างกัน (A470, A646 และ A663 นาโนเมตร) สุดท้ายนี้ ปริมาณของรงควัตถุสังเคราะห์แสงถูกคำนวณโดยใช้สูตรต่อไปนี้ 4–6 ซึ่งอธิบายโดย Lichtenthaler (1987)
หลังการรักษา 72 ชั่วโมง (hpt) เก็บใบ (ใบที่สองและสามที่เจริญเติบโตเต็มที่นับจากด้านบน) จากตัวอย่างชีวภาพแต่ละชุดเพื่อตรวจหาไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2) และซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน (O2•−) ด้วยวิธีฮิสโตเคมีแบบ in situ ตัวอย่างชีวภาพแต่ละชุดประกอบด้วยกระถางห้าใบ (กระถางละสองต้น) วิเคราะห์ตัวอย่างชีวภาพแต่ละชุดซ้ำสองครั้ง (ตัวอย่างทางเทคนิคสองชุด) เพื่อให้แน่ใจในความถูกต้อง ความน่าเชื่อถือ และความสามารถในการทำซ้ำของวิธีการ ตรวจวัด H2O2 และ O2•− โดยใช้ 0.1% 3,3′-ไดอะมิโนเบนซิดีน (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) หรือไนโตรบลูเตตราโซเลียม (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ตามลำดับ โดยใช้วิธีการที่อธิบายโดย Romero-Puertas et al. (2004) และ Adam et al. (1989) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย สำหรับการระบุตำแหน่งทางเคมีของ H2O2 ในสภาพแวดล้อมจริง ใบลิ้นหัวใจถูกทำให้ซึมผ่านด้วยสุญญากาศโดยใช้สารละลาย DAB 0.1% ในบัฟเฟอร์ Tris 10 mM (pH 7.8) จากนั้นบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่ที่มีแสงเป็นเวลา 60 นาที ใบลิ้นหัวใจถูกฟอกสีด้วย TCA 0.15% (v/v) ในเอทานอล:คลอโรฟอร์ม 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) แล้วนำไปฉายแสงจนกระทั่งสีเข้มขึ้น ในทำนองเดียวกัน วาล์วถูกทำให้ซึมผ่านด้วยสุญญากาศโดยใช้บัฟเฟอร์โพแทสเซียมฟอสเฟต 10 mM (pH 7.8) ที่มี HBT 0.1% (w/v) สำหรับการระบุตำแหน่งทางเคมีของ O2•− ในสภาพแวดล้อมจริง ใบลิ้นหัวใจถูกบ่มในที่ที่มีแสงที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 20 นาที จากนั้นฟอกสีเช่นเดียวกับข้างต้น แล้วฉายแสงจนกระทั่งปรากฏจุดสีน้ำเงินเข้ม/ม่วง ความเข้มของสีน้ำตาลที่เกิดขึ้น (โดยใช้ H2O2 เป็นตัวบ่งชี้) หรือสีม่วงน้ำเงิน (โดยใช้ O2•− เป็นตัวบ่งชี้) ถูกประเมินโดยใช้โปรแกรมประมวลผลภาพ ImageJ เวอร์ชัน Fiji (http://fiji.sc; เข้าถึงเมื่อวันที่ 7 มีนาคม 2024)
ปริมาณมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA; ใช้เป็นตัวบ่งชี้การเกิดออกซิเดชันของไขมัน) ถูกกำหนดตามวิธีการของ Du และ Bramlage (1992) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย ใบจากตัวอย่างทางชีวภาพแต่ละชุด (ใบที่สองและสามที่เจริญเติบโตเต็มที่จากด้านบน) ถูกเก็บหลังจาก 72 ชั่วโมงหลังการบำบัด (hpt) ตัวอย่างทางชีวภาพแต่ละชุดประกอบด้วยกระถางห้าใบ (กระถางละสองต้น) ตัวอย่างทางชีวภาพแต่ละชุดถูกวิเคราะห์ซ้ำสองครั้ง (ตัวอย่างทางเทคนิคสองชุด) เพื่อให้แน่ใจในความถูกต้อง ความน่าเชื่อถือ และความสามารถในการทำซ้ำของวิธีการ โดยสรุป เนื้อเยื่อใบที่บดแล้ว 0.5 กรัมถูกนำมาใช้สำหรับการสกัด MDA ด้วยกรดไตรคลอโรอะซิติก (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) 20% ที่มีบิวทิเลตไฮดรอกซีโทลูอีน (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 0.01% จากนั้นจึงทำการหาปริมาณ MDA ในสารละลายส่วนบนโดยวิธีวัดสี โดยวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 532 และ 600 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (บริษัท Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น) แล้วแสดงผลเป็นหน่วย nmol g−1 FW
สำหรับการประเมินสารต้านอนุมูลอิสระทั้งแบบไม่ใช้เอนไซม์และแบบใช้เอนไซม์ เก็บใบ (ใบที่สองและสามที่เจริญเติบโตเต็มที่นับจากยอด) จากแต่ละตัวอย่างซ้ำทางชีวภาพที่ 72 ชั่วโมงหลังการบำบัด (hpt) แต่ละตัวอย่างซ้ำทางชีวภาพประกอบด้วยกระถางห้าใบ (กระถางละสองต้น) แต่ละตัวอย่างทางชีวภาพได้รับการวิเคราะห์ซ้ำสองครั้ง (ตัวอย่างทางเทคนิคสองตัวอย่าง) นำใบสองใบมาบดด้วยไนโตรเจนเหลวและนำไปใช้โดยตรงสำหรับการหาปริมาณสารต้านอนุมูลอิสระทั้งแบบไม่ใช้เอนไซม์และแบบไม่ใช้เอนไซม์ กรดอะมิโนทั้งหมด ปริมาณโพรลีน การแสดงออกของยีน และการหาปริมาณออกซาเลต
ปริมาณฟีนอลที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดถูกกำหนดโดยใช้รีเอเจนต์ Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยจากวิธีการที่อธิบายโดย Kahkonen et al. (1999) โดยสรุปคือ เนื้อเยื่อใบที่บดละเอียดประมาณ 0.1 กรัม ถูกสกัดด้วยเมทานอล 80% ปริมาตร 20 มล. ในที่มืดเป็นเวลา 24 ชั่วโมง และเก็บส่วนของเหลวใสหลังจากปั่นเหวี่ยง นำสารสกัดตัวอย่าง 0.1 มล. มาผสมกับรีเอเจนต์ Folin-Ciocalteu (10%) ปริมาตร 0.5 มล. เขย่าเป็นเวลา 30 วินาที และทิ้งไว้ในที่มืดเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมคาร์บอเนต 20% (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egypt) ปริมาตร 0.5 มล. ลงในแต่ละหลอด ผสมให้เข้ากัน และบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากบ่มแล้ว วัดค่าการดูดกลืนแสงของส่วนผสมปฏิกิริยาที่ 765 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (บริษัท Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น) ความเข้มข้นของฟีนอลที่ละลายได้ทั้งหมดในสารสกัดตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้กราฟสอบเทียบกรดแกลลิก (Fisher Scientific, Hampton, NH, สหรัฐอเมริกา) และแสดงผลเป็นมิลลิกรัมของกรดแกลลิกเทียบเท่าต่อกรัมของน้ำหนักสด (mg GAE g-1 น้ำหนักสด)
ปริมาณฟลาโวนอยด์ที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดถูกกำหนดตามวิธีการของ Djeridane et al. (2006) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย กล่าวคือ นำสารสกัดเมทานอลข้างต้น 0.3 มล. มาผสมกับสารละลายอะลูมิเนียมคลอไรด์ 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) 0.3 มล. คนให้เข้ากันอย่างแรง แล้วบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 5 นาที จากนั้นเติมสารละลายโพแทสเซียมอะซิเตต 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 0.3 มล. ผสมให้เข้ากันอย่างทั่วถึง แล้วบ่มที่อุณหภูมิห้องในที่มืดเป็นเวลา 30 นาที หลังจากบ่มแล้ว วัดค่าการดูดกลืนแสงของสารละลายที่ความยาวคลื่น 430 นาโนเมตร โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) ปริมาณฟลาโวนอยด์ที่ละลายน้ำได้ทั้งหมดในสารสกัดตัวอย่างถูกกำหนดโดยใช้กราฟสอบเทียบรูติน (TCI America, Portland, OR, USA) จากนั้นแสดงผลเป็นมิลลิกรัมเทียบเท่ารูตินต่อกรัมของน้ำหนักสด (mg RE g-1 น้ำหนักสด)
ปริมาณกรดอะมิโนอิสระทั้งหมดในใบถั่วถูกกำหนดโดยใช้รีเอเจนต์นินไฮดรินที่ดัดแปลง (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) โดยอิงตามวิธีการที่เสนอโดย Yokoyama และ Hiramatsu (2003) และดัดแปลงโดย Sun et al. (2006) โดยสรุปคือ เนื้อเยื่อที่บดแล้ว 0.1 กรัมถูกสกัดด้วยบัฟเฟอร์ pH 5.4 และสารละลายส่วนบน 200 ไมโครลิตรทำปฏิกิริยากับนินไฮดริน (2%) 200 ไมโครลิตรและไพริดีน (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, USA) 200 ไมโครลิตร บ่มในอ่างน้ำเดือดเป็นเวลา 30 นาที จากนั้นทำให้เย็นลงและวัดที่ 580 นาโนเมตรโดยใช้สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (Shimadzu Corporation, Japan) ในทางกลับกัน โพรลีนถูกกำหนดโดยวิธีของเบตส์ (Bates et al., 1973) สกัดโพรลีนด้วยกรดซัลโฟซาลิไซลิก 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) และหลังจากปั่นเหวี่ยงแล้ว นำสารละลายส่วนบน 0.5 มล. มาผสมกับกรดอะซิติกเข้มข้น 1 มล. (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) และสารละลายไนน์ไฮดริน บ่มที่อุณหภูมิ 90°C เป็นเวลา 45 นาที จากนั้นทำให้เย็นลงและวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 520 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์เครื่องเดียวกันกับข้างต้น ปริมาณกรดอะมิโนอิสระทั้งหมดและโพรลีนในสารสกัดจากใบถูกกำหนดโดยใช้กราฟสอบเทียบไกลซีนและโพรลีน (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) ตามลำดับ และแสดงผลเป็นมิลลิกรัมต่อกรัมของน้ำหนักสด
เพื่อตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์ต้านอนุมูลอิสระ เนื้อเยื่อที่บดละเอียดประมาณ 500 มิลลิกรัมถูกสกัดด้วยบัฟเฟอร์ Tris 50 mM (pH 7.8) ปริมาตร 3 มิลลิลิตร ซึ่งประกอบด้วย EDTA-Na2 1 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) และโพลีไวนิลไพโรลิโดน (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 7.5% จากนั้นนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 10,000 × g เป็นเวลา 20 นาทีภายใต้การแช่เย็น (4 °C) และเก็บส่วนของเหลวใส (สารสกัดเอนไซม์ดิบ) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) จากนั้น นำเอนไซม์คาตาเลส (CAT) มาทำปฏิกิริยากับบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 0.1 M ปริมาตร 2 มล. (pH 6.5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) และสารละลาย H2O2 269 mM ปริมาตร 100 μl เพื่อหาค่ากิจกรรมของเอนไซม์ตามวิธีการของ Aebi (1984) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) ส่วนกิจกรรมของเอนไซม์เปอร์ออกซิเดสที่ขึ้นอยู่กับกัวยาคอล (POX) นั้น หาค่าโดยใช้วิธีการของ Harrach et al. (2009) (2008) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) และกำหนดกิจกรรมเอนไซม์ของโพลีฟีนอลออกซิเดส (PPO) หลังจากทำปฏิกิริยากับบัฟเฟอร์โซเดียมฟอสเฟต 100 mM ปริมาตร 2.2 มล. (pH 6.0), กัวยาคอล 100 μl (TCI chemicals, Portland, OR, USA) และ H2O2 12 mM ปริมาตร 100 μl วิธีการนี้ได้รับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อยจาก (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) การทดสอบดำเนินการหลังจากทำปฏิกิริยากับสารละลายคาเทคอล 3 มล. (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0.01 M) ที่เตรียมใหม่ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M (pH 6.0) กิจกรรมของ CAT ถูกวัดโดยการตรวจสอบการสลายตัวของ H2O2 ที่ 240 นาโนเมตร (A240) กิจกรรมของ POX ถูกวัดโดยการตรวจสอบการเพิ่มขึ้นของค่าการดูดกลืนแสงที่ 436 นาโนเมตร (A436) และกิจกรรมของ PPO ถูกวัดโดยการบันทึกความผันผวนของค่าการดูดกลืนแสงที่ 495 นาโนเมตร (A495) ทุกๆ 30 วินาที เป็นเวลา 3 นาที โดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160A (Shimadzu, ประเทศญี่ปุ่น)
ใช้เทคนิค Real-time RT-PCR ในการตรวจวัดระดับการถอดรหัสของยีนที่เกี่ยวข้องกับสารต้านอนุมูลอิสระ 3 ชนิด ได้แก่ เพอร์ออกซิโซมอลคาตาเลส (PvCAT1; หมายเลขการเข้าถึง GenBank KF033307.1), ซูเปอร์ออกไซด์ดิสมิวเทส (PvSOD; หมายเลขการเข้าถึง GenBank XM_068639556.1) และกลูตาไธโอนรีดักเทส (PvGR; หมายเลขการเข้าถึง GenBank KY195009.1) ในใบถั่ว (ใบที่สองและสามที่เจริญเติบโตเต็มที่นับจากยอด) 72 ชั่วโมงหลังจากการบำบัดครั้งสุดท้าย โดยสรุปคือ แยก RNA โดยใช้ชุดสกัด RNA ทั้งหมด Simply P (หมายเลขแคตตาล็อก BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, ประเทศจีน) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต จากนั้นสังเคราะห์ cDNA โดยใช้ชุดสังเคราะห์ cDNA TOP script™ ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ลำดับไพรเมอร์ของยีนทั้งสามข้างต้นแสดงอยู่ในตารางเสริม S3 ยีน PvActin-3 (หมายเลขการเข้าถึง GenBank: XM_068616709.1) ถูกใช้เป็นยีนควบคุมภายในเซลล์ และการแสดงออกของยีนสัมพัทธ์ถูกคำนวณโดยใช้วิธี 2-ΔΔCT (Livak และ Schmittgen, 2001) ความเสถียรของแอคตินภายใต้ความเครียดทางชีวภาพ (ปฏิสัมพันธ์ที่ไม่เข้ากันระหว่างพืชตระกูลถั่วทั่วไปกับเชื้อราแอนแทรคโนส Colletotrichum lindemuthianum) และความเครียดทางกายภาพ (ภัยแล้ง ความเค็ม อุณหภูมิต่ำ) ได้รับการพิสูจน์แล้ว (Borges et al., 2012)
ในขั้นต้น เราได้ทำการวิเคราะห์จีโนมทั่วทั้งระบบโดยใช้คอมพิวเตอร์ (in silico) ของโปรตีนออกซาโลอะซิเตตอะเซทิลไฮโดรเลส (OAH) ใน S. sclerotiorum โดยใช้เครื่องมือ BLAST สำหรับการจับคู่โปรตีน (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) โดยสรุป เราใช้ OAH จาก Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; หมายเลขการเข้าถึง GenBank XP_040799428.1; 342 กรดอะมิโน) และ Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; หมายเลขการเข้าถึง GenBank XP_056833920.1; 316 กรดอะมิโน) เป็นลำดับสอบถามเพื่อจับคู่โปรตีนที่คล้ายคลึงกันใน S. sclerotiorum (taxide: 5180) ทำการค้นหาข้อมูลจีโนมของ S. sclerotiorum ที่มีอยู่บน GenBank บนเว็บไซต์ของศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) โดยใช้ BLASTp ที่ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/
นอกจากนี้ ยีน OAH ที่คาดการณ์จาก S. sclerotiorum (SsOAH) และการวิเคราะห์วิวัฒนาการและแผนภูมิวิวัฒนาการของ AfOAH จาก A. fijiensis CBS 313.89 และ PlOAH จาก P. lagena ได้รับการอนุมานโดยใช้วิธีความน่าจะเป็นสูงสุดใน MEGA11 (Tamura et al., 2021) และแบบจำลองเมทริกซ์ JTT (Jones et al., 1992) แผนภูมิวิวัฒนาการนี้ถูกรวมเข้ากับการวิเคราะห์การจัดเรียงลำดับโปรตีนหลายลำดับของยีน OAH ที่คาดการณ์ทั้งหมด (SsOAH) จาก S. sclerotiorum และลำดับแบบสอบถามโดยใช้เครื่องมือจัดเรียงลำดับตามข้อจำกัด (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007) นอกจากนี้ ลำดับกรดอะมิโนที่ตรงกันมากที่สุดของ SsOAH จาก S. sclerotiorum ถูกนำมาจัดเรียงกับลำดับแบบสอบถาม (AfOAH และ PlOAH) (Larkin et al., 2007) โดยใช้ ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) และบริเวณที่อนุรักษ์ไว้ในการจัดเรียงลำดับถูกแสดงผลด้วยเครื่องมือ ESPript (เวอร์ชัน 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php)
นอกจากนี้ โดเมนตัวแทนการทำงานที่คาดการณ์ไว้และไซต์อนุรักษ์ของ S. sclerotiorum SsOAH ยังได้รับการจำแนกแบบโต้ตอบไปยังตระกูลต่างๆ โดยใช้เครื่องมือ InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021) สุดท้าย การสร้างแบบจำลองโครงสร้างสามมิติ (3D) ของ S. sclerotiorum SsOAH ที่คาดการณ์ไว้ ได้ดำเนินการโดยใช้ Protein Homology/Analogy Recognition Engine (เซิร์ฟเวอร์ Phyre2 เวอร์ชัน 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) และตรวจสอบความถูกต้องโดยใช้เซิร์ฟเวอร์ SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014) โครงสร้างสามมิติที่คาดการณ์ไว้ (รูปแบบ PDB) ได้รับการแสดงผลแบบโต้ตอบโดยใช้แพ็กเกจ UCSF-Chimera (เวอร์ชัน 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004)
ใช้วิธี Quantitative real-time fluorescence PCR ในการหาปริมาณการถอดรหัสของยีน oxaloacetate acetylhydrolase (SsOAH; หมายเลขการเข้าถึง GenBank: XM_001590428.1) ในเส้นใยของเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum โดยสรุปคือ นำเชื้อ S. sclerotiorum ใส่ลงในขวดทดลองที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ PDB แล้วนำไปวางในตู้อบแบบเขย่า (รุ่น: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาที และในที่มืดสนิท (24 ชั่วโมง) เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเส้นใย จากนั้น นำเซลล์ไปบำบัดด้วย L-ornithine และสารฆ่าเชื้อรา Rizolex-T ที่ความเข้มข้น IC50 สุดท้าย (ประมาณ 40 และ 3.2 มก./ลิตร ตามลำดับ) แล้วเพาะเลี้ยงต่ออีก 24 ชั่วโมงภายใต้สภาวะเดียวกัน หลังจากบ่มเพาะแล้ว นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 2500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที และเก็บส่วนของเหลวใส (เส้นใยเชื้อรา) เพื่อวิเคราะห์การแสดงออกของยีน ในทำนองเดียวกัน เก็บเส้นใยเชื้อราจากพืชที่ติดเชื้อที่เวลา 0, 24, 48, 72, 96 และ 120 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ โดยพืชจะเกิดราขาวและเส้นใยคล้ายสำลีบนผิวเนื้อเยื่อที่ติดเชื้อ จากนั้นสกัด RNA จากเส้นใยเชื้อราและสังเคราะห์ cDNA ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ลำดับไพรเมอร์สำหรับ SsOAH แสดงอยู่ในตารางเสริม S3 SsActin (หมายเลขการเข้าถึง GenBank: XM_001589919.1) ถูกใช้เป็นยีนควบคุม และคำนวณการแสดงออกของยีนสัมพัทธ์โดยใช้วิธี 2-ΔΔCT (Livak และ Schmittgen, 2001)
ทำการตรวจวัดกรดออกซาลิกในน้ำซุปมันฝรั่งเดกซ์โทรส (PDB) และตัวอย่างพืชที่มีเชื้อราก่อโรค Sclerotinia sclerotiorum ตามวิธีการของ Xu และ Zhang (2000) โดยมีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย กล่าวคือ นำเชื้อ S. sclerotiorum มาเพาะเลี้ยงในขวดทดลองที่มี PDB จากนั้นนำไปเพาะเลี้ยงในตู้อบแบบเขย่า (รุ่น I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) ที่ความเร็ว 150 รอบต่อนาที ที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C เป็นเวลา 3–5 วัน ในที่มืดสนิท (24 ชั่วโมง) เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเส้นใย หลังจากบ่มเพาะแล้ว นำวัฒนธรรมเชื้อราไปกรองผ่านกระดาษกรอง Whatman #1 จากนั้นนำไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 2500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที เพื่อกำจัดเส้นใยที่เหลือ เก็บส่วนของเหลวใสไว้ที่อุณหภูมิ 4°C เพื่อนำไปวิเคราะห์หาปริมาณออกซาเลตต่อไป สำหรับการเตรียมตัวอย่างพืช นำชิ้นส่วนเนื้อเยื่อพืชประมาณ 0.1 กรัม มาสกัดด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง (ครั้งละ 2 มิลลิลิตร) จากนั้นนำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ความเร็ว 2500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 5 นาที กรองส่วนที่เป็นของเหลวใสผ่านกระดาษกรอง Whatman เบอร์ 1 และเก็บไว้เพื่อนำไปวิเคราะห์ต่อไป
สำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณของกรดออกซาลิก เตรียมส่วนผสมของปฏิกิริยาในหลอดแก้วที่มีจุกปิดตามลำดับดังนี้: ตัวอย่าง 0.2 มล. (หรือสารกรองจากวัฒนธรรม PDB หรือสารละลายมาตรฐานกรดออกซาลิก), โบรโมฟีนอลบลู (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, USA) 0.11 มล., กรดซัลฟิวริก (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) 1 M 0.198 มล. และโพแทสเซียมไดโครเมต (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA) 100 mM 0.176 มล. จากนั้นเจือจางสารละลายด้วยน้ำกลั่นจนได้ปริมาตร 4.8 มล. ผสมให้เข้ากันอย่างแรง และนำไปแช่ในอ่างน้ำอุ่น 60 °C ทันที หลังจาก 10 นาที หยุดปฏิกิริยาโดยการเติมสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ (NaOH; 0.75 M) 0.5 มล. ค่าการดูดกลืนแสง (A600) ของส่วนผสมปฏิกิริยาถูกวัดที่ 600 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ UV-160 (บริษัท Shimadzu ประเทศญี่ปุ่น) PDB และน้ำกลั่นถูกใช้เป็นตัวควบคุมสำหรับการหาปริมาณสารกรองจากวัฒนธรรมและตัวอย่างพืชตามลำดับ ความเข้มข้นของกรดออกซาลิกในสารกรองจากวัฒนธรรม ซึ่งแสดงเป็นไมโครกรัมของกรดออกซาลิกต่อมิลลิลิตรของอาหารเลี้ยงเชื้อ PDB (μg.mL−1) และในสารสกัดจากใบ ซึ่งแสดงเป็นไมโครกรัมของกรดออกซาลิกต่อกรัมของน้ำหนักสด (μg.g−1 FW) ถูกกำหนดโดยใช้กราฟสอบเทียบกรดออกซาลิก (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA)
ตลอดการศึกษา การทดลองทั้งหมดถูกออกแบบโดยใช้แผนการทดลองแบบสุ่มสมบูรณ์ (CRD) โดยมีตัวอย่างทางชีวภาพ 6 ตัวอย่างต่อการรักษา และกระถาง 5 ใบต่อตัวอย่างทางชีวภาพ (2 ต้นต่อกระถาง) เว้นแต่จะระบุไว้เป็นอย่างอื่น ตัวอย่างทางชีวภาพได้รับการวิเคราะห์ซ้ำสองครั้ง (ตัวอย่างทางเทคนิค 2 ตัวอย่าง) ตัวอย่างทางเทคนิคใช้เพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำของการทดลองเดียวกัน แต่ไม่ได้ใช้ในการวิเคราะห์ทางสถิติเพื่อหลีกเลี่ยงตัวอย่างปลอม ข้อมูลได้รับการวิเคราะห์ทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญอย่างแท้จริงของ Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0.05) สำหรับการทดลองในหลอดทดลอง ค่า IC50 และ IC99 คำนวณโดยใช้แบบจำลอง probit และคำนวณช่วงความเชื่อมั่น 95%
มีการเก็บตัวอย่างเชื้อราทั้งหมด 4 สายพันธุ์จากแปลงถั่วเหลืองที่แตกต่างกันในจังหวัดเอล กาบียา ประเทศอียิปต์ บนอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA เชื้อราทุกสายพันธุ์สร้างเส้นใยสีขาวครีมซึ่งเปลี่ยนเป็นสีขาวคล้ายสำลีอย่างรวดเร็ว (ภาพที่ 1A) และจากนั้นเป็นสีเบจหรือสีน้ำตาลในระยะสเคลอโรเทียม สเคลอโรเทียมมักมีความหนาแน่น สีดำ ทรงกลมหรือรูปร่างไม่สม่ำเสมอ ยาว 5.2 ถึง 7.7 มม. และมีเส้นผ่านศูนย์กลาง 3.4 ถึง 5.3 มม. (ภาพที่ 1B) แม้ว่าเชื้อราทั้ง 4 สายพันธุ์จะพัฒนาสเคลอโรเทียมเป็นรูปแบบขอบที่ขอบของอาหารเลี้ยงเชื้อหลังจากบ่ม 10-12 วันที่อุณหภูมิ 25 ± 2 °C (ภาพที่ 1A) แต่จำนวนสเคลอโรเทียมต่อจานมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างสายพันธุ์ต่างๆ (P < 0.001) โดยสายพันธุ์ที่ 3 มีจำนวนสเคลอโรเทียมสูงสุด (32.33 ± 1.53 สเคลอโรเทียมต่อจาน; ภาพที่ 1C) ในทำนองเดียวกัน เชื้อแยกหมายเลข 3 ผลิตกรดออกซาลิกใน PDB ได้มากกว่าเชื้อแยกอื่นๆ (3.33 ± 0.49 μg.mL−1; รูปที่ 1D) เชื้อแยกหมายเลข 3 แสดงลักษณะทางสัณฐานวิทยาและลักษณะทางจุลภาคทั่วไปของเชื้อราก่อโรคพืช Sclerotinia sclerotiorum ตัวอย่างเช่น บน PDA โคโลนีของเชื้อแยกหมายเลข 3 เจริญเติบโตอย่างรวดเร็ว มีสีขาวครีม (รูปที่ 1A) ด้านหลังเป็นสีเบจหรือสีเหลืองน้ำตาลอมส้มอ่อน และต้องใช้เวลา 6-7 วันที่อุณหภูมิ 25 ± 2°C จึงจะปกคลุมพื้นผิวของจานขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 9 ซม. ได้อย่างสมบูรณ์ จากลักษณะทางสัณฐานวิทยาและลักษณะทางจุลภาคข้างต้น เชื้อแยกหมายเลข 3 จึงถูกระบุว่าเป็น Sclerotinia sclerotiorum
รูปที่ 1. ลักษณะและคุณสมบัติก่อโรคของเชื้อรา S. sclerotiorum ที่แยกได้จากพืชตระกูลถั่วทั่วไป (A) การเจริญเติบโตของเส้นใยเชื้อรา S. sclerotiorum จำนวน 4 สายพันธุ์บนอาหารเลี้ยงเชื้อ PDA (B) สเคลอโรเทียของเชื้อรา S. sclerotiorum จำนวน 4 สายพันธุ์ (C) จำนวนสเคลอโรเทีย (ต่อจาน) (D) การหลั่งกรดออกซาลิกบนอาหารเลี้ยงเชื้อ PDB (μg.mL−1) และ (E) ความรุนแรงของโรค (%) ของเชื้อรา S. sclerotiorum จำนวน 4 สายพันธุ์บนพืชตระกูลถั่วพันธุ์ Giza 3 ที่อ่อนแอต่อโรค ภายใต้สภาพเรือนกระจก ค่าที่แสดงคือค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของตัวอย่างทดลอง 5 ตัวอย่าง (n = 5) ตัวอักษรที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มทดลอง (p < 0.05) (F–H) อาการราขาวปรากฏบนลำต้นเหนือดินและฝักตามลำดับ 10 วันหลังการปลูกเชื้อด้วยสายพันธุ์ที่ 3 (dpi) (I) การวิเคราะห์เชิงวิวัฒนาการของบริเวณตัวเว้นวรรคที่ถอดรหัสภายใน (ITS) ของเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ที่ 3 ดำเนินการโดยใช้วิธีความน่าจะเป็นสูงสุด และเปรียบเทียบกับสายพันธุ์อ้างอิง 20 สายพันธุ์ที่ได้จากฐานข้อมูลศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) ตัวเลขเหนือเส้นการจัดกลุ่มแสดงถึงความครอบคลุมของบริเวณ (%) และตัวเลขใต้เส้นการจัดกลุ่มแสดงถึงความยาวของกิ่ง
นอกจากนี้ เพื่อยืนยันความสามารถในการก่อโรค ได้นำเชื้อรา S. sclerotiorum จำนวน 4 สายพันธุ์มาเพาะเชื้อในถั่วฝักยาวพันธุ์ Giza 3 ที่อ่อนแอต่อโรค ภายใต้สภาพเรือนกระจก ซึ่งสอดคล้องกับหลักการของ Koch (รูปที่ 1E) แม้ว่าเชื้อราทุกสายพันธุ์จะก่อโรคได้และสามารถติดเชื้อในถั่วฝักยาว (พันธุ์ Giza 3) ทำให้เกิดอาการราขาวทั่วไปบนส่วนเหนือดินทั้งหมด (รูปที่ 1F) โดยเฉพาะอย่างยิ่งบนลำต้น (รูปที่ 1G) และฝัก (รูปที่ 1H) ในวันที่ 10 หลังการเพาะเชื้อ (dpi) แต่สายพันธุ์ที่ 3 เป็นสายพันธุ์ที่มีความรุนแรงที่สุดในการทดลองอิสระสองครั้ง สายพันธุ์ที่ 3 มีความรุนแรงของโรคสูงสุด (%) ในต้นถั่ว (24.0 ± 4.0, 58.0 ± 2.0 และ 76.7 ± 3.1 ในวันที่ 7, 14 และ 21 หลังการติดเชื้อ ตามลำดับ; รูปที่ 1F)
การระบุเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ที่รุกรานมากที่สุด (สายพันธุ์ #3) ได้รับการยืนยันเพิ่มเติมโดยอาศัยลำดับเบสของ Internal Transcribed Spacer (ITS) (รูปที่ 1I) การวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการระหว่างสายพันธุ์ #3 และสายพันธุ์อ้างอิง 20 สายพันธุ์ แสดงให้เห็นถึงความคล้ายคลึงกันสูง (>99%) เป็นที่น่าสังเกตว่าเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ #3 (533 bp) มีความคล้ายคลึงสูงกับเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ LPM36 จากอเมริกาที่แยกได้จากเมล็ดถั่วแห้ง (หมายเลขการเข้าถึง GenBank MK896659.1; 540 bp) และเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ YKY211 จากจีน (หมายเลขการเข้าถึง GenBank OR206374.1; 548 bp) ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคเน่าลำต้นของต้นไวโอเล็ต (Matthiola incana) โดยทั้งหมดนี้ถูกจัดกลุ่มแยกกันไว้ที่ด้านบนสุดของแผนภูมิวิวัฒนาการ (รูปที่ 1I) ลำดับพันธุกรรมใหม่นี้ได้รับการบันทึกไว้ในฐานข้อมูล NCBI และตั้งชื่อว่า “Sclerotinia sclerotiorum – isolate YN-25” (หมายเลขการเข้าถึง GenBank PV202792) จะเห็นได้ว่าไอโซเลตที่ 3 เป็นไอโซเลตที่มีความรุนแรงที่สุด ดังนั้นจึงเลือกไอโซเลตนี้มาศึกษาในทุกการทดลองต่อไป
ได้ทำการศึกษาฤทธิ์ต้านแบคทีเรียของไดอะมีน แอล-ออร์นิทีน (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany) ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (12.5, 25, 50, 75, 100 และ 125 มก./ลิตร) ต่อเชื้อ S. sclerotiorum สายพันธุ์ที่ 3 ในหลอดทดลอง พบว่า แอล-ออร์นิทีนมีฤทธิ์ต้านแบคทีเรียและยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใย S. sclerotiorum อย่างค่อยเป็นค่อยไปตามปริมาณที่ใช้ (ภาพที่ 2A, B) ที่ความเข้มข้นสูงสุดที่ทดสอบ (125 มก./ลิตร) แอล-ออร์นิทีนแสดงอัตราการยับยั้งการเจริญเติบโตของเส้นใยสูงสุด (99.62 ± 0.27%; ภาพที่ 2B) ซึ่งเทียบเท่ากับสารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T (อัตราการยับยั้ง 99.45 ± 0.39%; ภาพที่ 2C) ที่ความเข้มข้นสูงสุดที่ทดสอบ (10 มก./ลิตร) แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพที่ใกล้เคียงกัน
รูปที่ 2. กิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียในหลอดทดลองของแอล-ออร์นิทีนต่อเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum (A) การเปรียบเทียบกิจกรรมต้านเชื้อแบคทีเรียของแอล-ออร์นิทีนที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ต่อเชื้อ S. sclerotiorum กับสารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T (10 มก./ลิตร) (B, C) อัตราการยับยั้ง (%) การเจริญเติบโตของเส้นใยเชื้อรา S. sclerotiorum หลังการรักษาด้วยแอล-ออร์นิทีนที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (12.5, 25, 50, 75, 100 และ 125 มก./ลิตร) หรือ Rizolex-T (2, 4, 6, 8 และ 10 มก./ลิตร) ตามลำดับ ค่าที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของตัวอย่างทางชีววิทยา 5 ตัวอย่าง (n = 5) ตัวอักษรที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างทางสถิติระหว่างการรักษา (p < 0.05) (D, E) การวิเคราะห์การถดถอยแบบจำลองโพรบิตของแอล-ออร์นิทีนและสารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T ตามลำดับ เส้นถดถอยของแบบจำลองโพรบิตแสดงด้วยเส้นสีน้ำเงินทึบ และช่วงความเชื่อมั่น (95%) แสดงด้วยเส้นสีแดงประ
นอกจากนี้ ยังได้ทำการวิเคราะห์การถดถอยแบบโพรบิต และแสดงผลลัพธ์ในตารางที่ 1 และรูปที่ 2D,E โดยสรุป ค่าความชันที่ยอมรับได้ (y = 2.92x − 4.67) และสถิติที่มีนัยสำคัญที่เกี่ยวข้อง (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 และ p < 0.0001; รูปที่ 2D) ของ L-ornithine บ่งชี้ถึงฤทธิ์ต้านเชื้อราที่เพิ่มขึ้นต่อ S. sclerotiorum เมื่อเทียบกับสารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 และ p < 0.0001) (ตารางที่ 1)
ตารางที่ 1. ค่าความเข้มข้นยับยั้งครึ่งหนึ่งสูงสุด (IC50) และ IC99 (มก./ลิตร) ของแอล-ออร์นิทีนและสารฆ่าเชื้อราทางการค้า “Rizolex-T” ต่อเชื้อ S. sclerotiorum
โดยรวมแล้ว แอล-ออร์นิทีน (250 มก./ลิตร) ช่วยลดการเจริญเติบโตและความรุนแรงของโรคราขาวในต้นถั่วเหลืองที่ได้รับการรักษาได้อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับต้นถั่วเหลืองที่ติดเชื้อ S. sclerotiorum ที่ไม่ได้รับการรักษา (กลุ่มควบคุม; รูปที่ 3A) กล่าวโดยสรุป แม้ว่าความรุนแรงของโรคในต้นถั่วเหลืองที่ติดเชื้อแต่ไม่ได้รับการรักษาจะเพิ่มขึ้นอย่างค่อยเป็นค่อยไป (52.67 ± 1.53, 83.21 ± 2.61 และ 92.33 ± 3.06%) แต่แอล-ออร์นิทีนช่วยลดความรุนแรงของโรค (%) ได้อย่างมีนัยสำคัญตลอดการทดลอง (8.97 ± 0.15, 18.00 ± 1.00 และ 26.36 ± 3.07) ที่ 7, 14 และ 21 วันหลังการรักษา ตามลำดับ (รูปที่ 3A) ในทำนองเดียวกัน เมื่อต้นถั่วที่ติดเชื้อ S. sclerotiorum ได้รับการรักษาด้วย L-ornithine ความเข้มข้น 250 มก./ลิตร พื้นที่ใต้กราฟแสดงการลุกลามของโรค (AUDPC) ลดลงจาก 1274.33 ± 33.13 ในกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา ไปเป็น 281.03 ± 7.95 ซึ่งต่ำกว่าเล็กน้อยเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงบวกที่ใช้สารฆ่าเชื้อรา Rizolex-T ความเข้มข้น 50 มก./ลิตร (183.61 ± 7.71; รูปที่ 3B) สังเกตเห็นแนวโน้มเดียวกันนี้ในการทดลองครั้งที่สอง
รูปที่ 3 ผลของการใช้แอล-ออร์นิทีนจากภายนอกต่อการพัฒนาของโรคเน่าขาวในถั่วฝักยาวที่เกิดจากเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum ภายใต้สภาพเรือนกระจก (A) กราฟแสดงความคืบหน้าของโรคเน่าขาวในถั่วฝักยาวหลังการรักษาด้วยแอล-ออร์นิทีน 250 มก./ลิตร (B) พื้นที่ใต้กราฟแสดงความคืบหน้าของโรคเน่าขาว (AUDPC) ในถั่วฝักยาวหลังการรักษาด้วยแอล-ออร์นิทีน ค่าที่แสดงคือค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของตัวอย่างทางชีววิทยา 5 ตัวอย่าง (n = 5) ตัวอักษรที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการรักษา (p < 0.05)
การให้สาร L-ornithine จากภายนอกในปริมาณ 250 มก./ลิตร ค่อยๆ เพิ่มความสูงของต้น (รูปที่ 4A) จำนวนกิ่งต่อต้น (รูปที่ 4B) และจำนวนใบต่อต้น (รูปที่ 4C) หลังจาก 42 วัน ในขณะที่สารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T (50 มก./ลิตร) มีผลมากที่สุดต่อพารามิเตอร์ทางโภชนาการทั้งหมดที่ศึกษา การให้สาร L-ornithine จากภายนอกในปริมาณ 250 มก./ลิตร มีผลมากเป็นอันดับสองเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับการรักษา (รูปที่ 4A–C) ในทางกลับกัน การรักษาด้วยแอล-ออร์นิทีนไม่มีผลอย่างมีนัยสำคัญต่อปริมาณของรงควัตถุสังเคราะห์แสงคลอโรฟิลล์เอ (รูปที่ 4D) และคลอโรฟิลล์บี (รูปที่ 4E) แต่เพิ่มปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งหมดเล็กน้อย (0.56 ± 0.03 มก./กรัม น้ำหนักสด) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมเชิงลบ (0.44 ± 0.02 มก./กรัม น้ำหนักสด) และกลุ่มควบคุมเชิงบวก (0.46 ± 0.02 มก./กรัม น้ำหนักสด; รูปที่ 4F) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าแอล-ออร์นิทีนไม่เป็นพิษต่อพืชตระกูลถั่วที่ได้รับการรักษา และอาจกระตุ้นการเจริญเติบโตของพืชได้ด้วยซ้ำ
รูปที่ 4 ผลของการใช้แอล-ออร์นิทีนจากภายนอกต่อลักษณะการเจริญเติบโตและรงควัตถุสังเคราะห์แสงของใบถั่วที่ติดเชื้อรา Sclerotinia sclerotiorum ภายใต้สภาพเรือนกระจก (A) ความสูงของต้น (ซม.) (B) จำนวนกิ่งต่อต้น (C) จำนวนใบต่อต้น (D) ปริมาณคลอโรฟิลล์เอ (มก./กรัม น้ำหนักสด) (E) ปริมาณคลอโรฟิลล์บี (มก./กรัม น้ำหนักสด) (F) ปริมาณแคโรทีนอยด์ทั้งหมด (มก./กรัม น้ำหนักสด) ค่าที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานของตัวอย่างซ้ำทางชีววิทยา 5 ตัวอย่าง (n = 5) ตัวอักษรที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลอง (p < 0.05)
การระบุตำแหน่งทางเคมีของสารออกซิเจนที่ว่องไว (ROS; แสดงในรูปของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ [H2O2]) และอนุมูลอิสระ (แสดงในรูปของซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน [O2•−]) ในเนื้อเยื่อพืช พบว่าการใช้ L-ornithine จากภายนอก (250 มก./ลิตร) ช่วยลดการสะสมของ H2O2 (96.05 ± 5.33 นาโนโมล/กรัม น้ำหนักสด; รูปที่ 5A) และ O2•− (32.69 ± 8.56 นาโนโมล/กรัม น้ำหนักสด; รูปที่ 5B) อย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเทียบกับการสะสมของพืชที่ติดเชื้อที่ไม่ได้รับการรักษา (173.31 ± 12.06 และ 149.35 ± 7.94 นาโนโมล/กรัม น้ำหนักสด ตามลำดับ) และพืชที่ได้รับการรักษาด้วยสารฆ่าเชื้อราทางการค้า Rizolex-T 50 มก./ลิตร (170.12 ± 9.50 และ 157.00 ± 7.81 นาโนโมล/กรัม น้ำหนักสด ตามลำดับ) nmol.g−1 น้ำหนักสด ตามลำดับ) ที่ 72 ชั่วโมง พบว่ามีการสะสมของ H2O2 และ O2•− ในระดับสูงภายใต้สภาวะ hpt (รูปที่ 5A, B) ในทำนองเดียวกัน การทดสอบมาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA) โดยใช้ TCA แสดงให้เห็นว่าต้นถั่วที่ติดเชื้อ S. sclerotiorum สะสม MDA ในใบในระดับที่สูงกว่า (113.48 ± 10.02 nmol.g น้ำหนักสด) (รูปที่ 5C) อย่างไรก็ตาม การใช้ L-ornithine จากภายนอกช่วยลดการเกิดออกซิเดชันของไขมันได้อย่างมีนัยสำคัญ ดังที่เห็นได้จากการลดลงของปริมาณ MDA ในพืชที่ได้รับการรักษา (33.08 ± 4.00 nmol.g น้ำหนักสด)
รูปที่ 5. ผลของการใช้แอล-ออร์นิทีนจากภายนอกต่อตัวบ่งชี้หลักของภาวะเครียดออกซิเดชันและกลไกการป้องกันสารต้านอนุมูลอิสระแบบไม่ใช้เอนไซม์ในใบถั่วที่ติดเชื้อ S. sclerotiorum ที่ 72 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ ภายใต้สภาพเรือนกระจก (A) ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ (H2O2; nmol g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, (B) ซูเปอร์ออกไซด์แอนไอออน (O2•−; nmol g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, (C) มาลอนไดอัลดีไฮด์ (MDA; nmol g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, (D) ฟีนอลที่ละลายน้ำได้ทั้งหมด (mg GAE g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, (E) ฟลาโวนอยด์ที่ละลายน้ำได้ทั้งหมด (mg RE g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, (F) กรดอะมิโนอิสระทั้งหมด (mg g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง, และ (G) ปริมาณโพรลีน (mg g−1 FW) ที่ 72 ชั่วโมงหลังการเพาะเลี้ยง ค่าที่แสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ค่าเฉลี่ย ± SD) จากตัวอย่างทางชีววิทยา 5 ตัวอย่าง (n = 5) ตัวอักษรที่แตกต่างกันแสดงถึงความแตกต่างทางสถิติอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มทดลอง (p < 0.05)