ทฤษฎีการป้องกันพืชที่แตกต่างกันให้แนวทางทฤษฎีที่สำคัญในการอธิบายรูปแบบของการเผาผลาญเฉพาะของพืช แต่การคาดการณ์ที่สำคัญของทฤษฎีเหล่านั้นยังคงต้องได้รับการทดสอบ ในที่นี้ เราใช้การวิเคราะห์แมสสเปกโทรเมตรีแบบคู่ (MS/MS) ที่ไม่ลำเอียงเพื่อสำรวจเมตาโบโลมของสายพันธุ์ยาสูบที่อ่อนแออย่างเป็นระบบ ตั้งแต่พืชแต่ละต้นไปจนถึงประชากรและสายพันธุ์ที่ใกล้เคียงกัน และประมวลผลทฤษฎีคุณลักษณะแมสสเปกโทรเมตรีจำนวนมากโดยอิงจากสเปกตรัมของสารประกอบในกรอบข้อมูล เพื่อทดสอบการคาดการณ์ที่สำคัญของทฤษฎีการป้องกันที่เหมาะสมที่สุด (OD) และทฤษฎีเป้าหมายเคลื่อนที่ (MT) องค์ประกอบข้อมูลของเมตาโบโลมิกส์ของพืชสอดคล้องกับทฤษฎี OD แต่ขัดแย้งกับการคาดการณ์หลักของทฤษฎี MT เกี่ยวกับพลวัตของเมตาโบโลมิกส์ที่เกิดจากสัตว์กินพืช จากระดับวิวัฒนาการจุลภาคถึงมหภาค สัญญาณจัสมอเนตถูกระบุว่าเป็นตัวกำหนดหลักของ OD ในขณะที่สัญญาณเอทิลีนให้การปรับแต่งอย่างละเอียดของการตอบสนองเฉพาะต่อสัตว์กินพืชที่ระบุโดยเครือข่ายโมเลกุล MS/MS
สารเมตาโบไลต์พิเศษที่มีโครงสร้างหลากหลายเป็นส่วนสำคัญในการปรับตัวของพืชให้เข้ากับสภาพแวดล้อม โดยเฉพาะอย่างยิ่งในการป้องกันศัตรู (1) ความหลากหลายอันน่าทึ่งของกระบวนการเมตาโบลิซึมพิเศษที่พบในพืชได้กระตุ้นให้เกิดการวิจัยเชิงลึกเกี่ยวกับหน้าที่ทางนิเวศวิทยาในหลายแง่มุมมานานหลายทศวรรษ และได้ก่อให้เกิดทฤษฎีการป้องกันพืชมากมาย ซึ่งเป็นการพัฒนาเชิงวิวัฒนาการและนิเวศวิทยาของปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและแมลง การวิจัยเชิงประจักษ์ให้คำแนะนำที่สำคัญ (2) อย่างไรก็ตาม ทฤษฎีการป้องกันพืชเหล่านี้ไม่ได้ปฏิบัติตามแนวทางปกติของการให้เหตุผลเชิงอนุมานแบบสมมติฐาน ซึ่งการคาดการณ์ที่สำคัญอยู่ในระดับการวิเคราะห์เดียวกัน (3) และได้รับการทดสอบเชิงทดลองเพื่อก้าวไปสู่รอบต่อไปของการพัฒนาทฤษฎี (4) ข้อจำกัดทางเทคนิคจำกัดการเก็บรวบรวมข้อมูลเฉพาะหมวดหมู่เมตาโบลิซึมและไม่รวมการวิเคราะห์อย่างครอบคลุมของสารเมตาโบไลต์เฉพาะทาง จึงทำให้ไม่สามารถเปรียบเทียบระหว่างหมวดหมู่ซึ่งจำเป็นต่อการพัฒนาทฤษฎีได้ (5) การขาดข้อมูลเมตาโบโลมิกส์ที่ครอบคลุมและมาตรฐานทั่วไปในการเปรียบเทียบขั้นตอนการทำงานของพื้นที่เมตาโบลิซึมระหว่างกลุ่มพืชต่างๆ ขัดขวางความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ของสาขานี้
การพัฒนาล่าสุดในสาขาเมตาโบโลมิกส์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรีแบบคู่ (MS/MS) สามารถระบุลักษณะการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมภายในและระหว่างสายพันธุ์ของกลุ่มระบบที่กำหนดได้อย่างครอบคลุม และสามารถรวมเข้ากับวิธีการคำนวณเพื่อคำนวณความคล้ายคลึงทางโครงสร้างระหว่างส่วนผสมที่ซับซ้อนเหล่านี้ ความรู้พื้นฐานทางเคมี (5) การผสมผสานเทคโนโลยีขั้นสูงในการวิเคราะห์และการคำนวณทำให้เกิดกรอบการทำงานที่จำเป็นสำหรับการทดสอบระยะยาวของการคาดการณ์มากมายที่ทำโดยทฤษฎีทางนิเวศวิทยาและวิวัฒนาการของความหลากหลายทางเมตาบอลิซึม แชนนอน (6) ได้แนะนำทฤษฎีสารสนเทศเป็นครั้งแรกในบทความสำคัญของเขาในปี 1948 ซึ่งวางรากฐานสำหรับการวิเคราะห์ทางคณิตศาสตร์ของสารสนเทศ ซึ่งถูกนำไปใช้ในหลายสาขาอื่นนอกเหนือจากการใช้งานดั้งเดิม ในด้านจีโนมิกส์ ทฤษฎีสารสนเทศได้รับการประยุกต์ใช้สำเร็จในการหาปริมาณข้อมูลการอนุรักษ์ลำดับ (7) ในงานวิจัยทรานสคริปโตมิกส์ ทฤษฎีสารสนเทศวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงโดยรวมในทรานสคริปโตม (8) ในงานวิจัยก่อนหน้านี้ เราได้ประยุกต์ใช้กรอบทางสถิติของทฤษฎีสารสนเทศกับเมตาโบโลมิกส์เพื่ออธิบายความเชี่ยวชาญทางเมตาบอลิซึมในระดับเนื้อเยื่อในพืช (9) ในงานวิจัยนี้ เราได้ผสานเวิร์กโฟลว์แบบ MS/MS เข้ากับกรอบทางสถิติของทฤษฎีสารสนเทศ ซึ่งมีลักษณะเฉพาะคือความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมในหน่วยวัดทั่วไป เพื่อเปรียบเทียบการคาดการณ์ที่สำคัญของทฤษฎีการป้องกันพืชเกี่ยวกับเมตาโบโลมที่ถูกกระตุ้นโดยสัตว์กินพืช
กรอบทฤษฎีการป้องกันของพืชมักจะครอบคลุมซึ่งกันและกันและสามารถแบ่งออกเป็นสองประเภท: ประเภทที่พยายามอธิบายการกระจายตัวของเมตาโบไลต์เฉพาะของพืชโดยอิงจากหน้าที่การป้องกัน เช่น การป้องกันที่เหมาะสมที่สุด (OD) (10) เป้าหมายเคลื่อนที่ (MT) (11) และทฤษฎีการปรากฏตัว (12) ในขณะที่ประเภทอื่น ๆ พยายามหาคำอธิบายเชิงกลไกว่าการเปลี่ยนแปลงความพร้อมของทรัพยากรส่งผลต่อการเจริญเติบโตของพืชและการสะสมของเมตาโบไลต์เฉพาะอย่างไร เช่น สมมติฐานสมดุลคาร์บอนต่อสารอาหาร (13) สมมติฐานอัตราการเจริญเติบโต (14) และสมมติฐานสมดุลการเจริญเติบโตและการแยกความแตกต่าง (15) ทฤษฎีทั้งสองชุดนี้อยู่ในระดับการวิเคราะห์ที่แตกต่างกัน (4) อย่างไรก็ตาม ทฤษฎีสองทฤษฎีที่เกี่ยวข้องกับหน้าที่การป้องกันในระดับการทำงานนั้นครอบงำการสนทนาเกี่ยวกับการป้องกันแบบคงที่และแบบเหนี่ยวนำของพืช ได้แก่ ทฤษฎี OD ซึ่งสันนิษฐานว่าพืชลงทุนในการป้องกันทางเคมีที่มีราคาแพงเฉพาะเมื่อจำเป็นเท่านั้น เช่น เมื่อถูกสัตว์กินพืชกินเข้าไป ดังนั้น เมื่อสัตว์กินหญ้าโจมตี ตามความเป็นไปได้ของการโจมตีในอนาคต สารประกอบที่มีหน้าที่การป้องกันจะถูกกำหนด (10) และสมมติฐาน MT เสนอว่าไม่มีแกนของการเปลี่ยนแปลงเมตาโบไลต์แบบมีทิศทาง แต่เมตาโบไลต์จะเปลี่ยนแปลงแบบสุ่ม ทำให้เกิดความเป็นไปได้ในการขัดขวาง “เป้าหมายการเคลื่อนไหว” ทางเมตาโบลิซึมของสัตว์กินพืชที่โจมตี กล่าวอีกนัยหนึ่ง ทฤษฎีทั้งสองนี้ทำนายตรงกันข้ามเกี่ยวกับการปรับเปลี่ยนเมตาโบลิซึมที่เกิดขึ้นหลังจากการโจมตีของสัตว์กินพืช นั่นคือ ความสัมพันธ์ระหว่างการสะสมเมตาโบไลต์แบบทิศทางเดียวที่มีหน้าที่การป้องกัน (OD) และการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิซึมแบบไม่มีทิศทาง (MT) (11)
สมมติฐาน OD และ MT ไม่เพียงเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงที่เกิดขึ้นในเมตาโบโลมเท่านั้น แต่ยังรวมถึงผลที่ตามมาทางนิเวศวิทยาและวิวัฒนาการของการสะสมของเมตาโบไลต์เหล่านี้ เช่น ต้นทุนและผลประโยชน์ในการปรับตัวของการเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิกเหล่านี้ในสภาพแวดล้อมทางนิเวศวิทยาเฉพาะ (16) แม้ว่าทั้งสองสมมติฐานจะยอมรับหน้าที่ในการป้องกันของเมตาโบไลต์เฉพาะ ซึ่งอาจมีหรือไม่มีต้นทุนสูง แต่การคาดการณ์ที่สำคัญที่ทำให้สมมติฐาน OD และ MT แตกต่างกันนั้นอยู่ที่ทิศทางของการเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิกที่เกิดขึ้น การคาดการณ์ของทฤษฎี OD ได้รับความสนใจจากการทดลองมากที่สุดจนถึงปัจจุบัน การทดสอบเหล่านี้รวมถึงการศึกษาหน้าที่ในการป้องกันโดยตรงหรือโดยอ้อมของเนื้อเยื่อต่างๆ ของสารประกอบเฉพาะในเรือนกระจกและสภาพธรรมชาติ ตลอดจนการเปลี่ยนแปลงในระยะการพัฒนาของพืช (17-19) อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน เนื่องจากขาดขั้นตอนการทำงานและกรอบทางสถิติสำหรับการวิเคราะห์ความหลากหลายทางเมตาโบลิกอย่างครอบคลุมทั่วโลกของสิ่งมีชีวิตใดๆ การคาดการณ์ความแตกต่างหลักระหว่างสองทฤษฎี (นั่นคือ ทิศทางของการเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิก) ยังคงต้องได้รับการทดสอบต่อไป ในที่นี้ เราขอเสนอการวิเคราะห์ดังกล่าว
ลักษณะสำคัญประการหนึ่งของเมตาโบไลต์เฉพาะพืชคือความหลากหลายเชิงโครงสร้างอย่างมากในทุกระดับ ตั้งแต่พืชแต่ละต้น ประชากร ไปจนถึงสายพันธุ์ที่คล้ายคลึงกัน (20) สามารถสังเกตการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณมากมายในเมตาโบไลต์เฉพาะได้ในระดับประชากร ในขณะที่ความแตกต่างเชิงคุณภาพที่แข็งแกร่งมักจะคงอยู่ที่ระดับสายพันธุ์ (20) ดังนั้น ความหลากหลายทางเมตาโบลิซึมของพืชจึงเป็นแง่มุมหลักของความหลากหลายเชิงหน้าที่ ซึ่งสะท้อนถึงความสามารถในการปรับตัวให้เข้ากับนิเวศวิทยาที่แตกต่างกัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งนิเวศวิทยาที่มีความเป็นไปได้ในการรุกรานที่แตกต่างกันโดยแมลงชนิดพิเศษและสัตว์กินพืชทั่วไป (21) นับตั้งแต่บทความบุกเบิกของ Fraenkel (22) เกี่ยวกับเหตุผลของการมีอยู่ของเมตาโบไลต์เฉพาะพืช ปฏิสัมพันธ์กับแมลงต่างๆ ได้รับการพิจารณาว่าเป็นแรงกดดันในการคัดเลือกที่สำคัญ และเชื่อกันว่าปฏิสัมพันธ์เหล่านี้ได้กำหนดรูปร่างของพืชในระหว่างวิวัฒนาการ เส้นทางเมตาโบลิซึม (23) ความแตกต่างระหว่างสายพันธุ์ในความหลากหลายของเมตาโบไลต์เฉพาะทางอาจสะท้อนถึงความสมดุลทางสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันพืชแบบถาวรและแบบเหนี่ยวนำต่อกลยุทธ์การกินพืชของสัตว์กินพืช เนื่องจากทั้งสองสายพันธุ์มักมีความสัมพันธ์เชิงลบต่อกัน (24) แม้ว่าการรักษาการป้องกันที่ดีตลอดเวลาอาจเป็นประโยชน์ แต่การเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิซึมที่ทันท่วงทีที่เกี่ยวข้องกับการป้องกันจะให้ประโยชน์ที่ชัดเจนในการช่วยให้พืชสามารถจัดสรรทรัพยากรที่มีค่าให้กับการลงทุนทางสรีรวิทยาอื่นๆ (19, 24) และหลีกเลี่ยงความจำเป็นในการพึ่งพาอาศัยกัน ความเสียหายที่เกิดขึ้นโดยไม่ตั้งใจ (25) นอกจากนี้ การจัดระเบียบใหม่ของเมตาโบไลต์เฉพาะทางที่เกิดจากแมลงกินพืชอาจนำไปสู่การกระจายตัวที่ทำลายล้างในประชากร (26) และอาจสะท้อนถึงการอ่านค่าโดยตรงของการเปลี่ยนแปลงตามธรรมชาติที่สำคัญในสัญญาณกรดจัสมอนิก (JA) ซึ่งอาจคงอยู่ในประชากร สัญญาณ JA สูงและต่ำเป็นการแลกเปลี่ยนระหว่างการป้องกันสัตว์กินพืชและการแข่งขันกับสายพันธุ์เฉพาะ (27) นอกจากนี้ เส้นทางการสังเคราะห์สารเมตาบอไลต์เฉพาะทางจะประสบกับการสูญเสียและการเปลี่ยนแปลงอย่างรวดเร็วในระหว่างวิวัฒนาการ ส่งผลให้การกระจายตัวของเมตาบอลิซึมไม่สม่ำเสมอในหมู่สายพันธุ์ที่ใกล้เคียงกัน (28) ความหลากหลายทางพันธุกรรมเหล่านี้สามารถเกิดขึ้นได้อย่างรวดเร็วเพื่อตอบสนองต่อรูปแบบการกินพืชที่เปลี่ยนแปลงไป (29) ซึ่งหมายความว่าความผันผวนของชุมชนสัตว์กินพืชเป็นปัจจัยสำคัญที่ขับเคลื่อนความหลากหลายทางเมตาบอลิซึม
ในงานวิจัยนี้ เราได้แก้ปัญหาเฉพาะเจาะจงดังต่อไปนี้ (I) แมลงกินพืชปรับเปลี่ยนเมตาโบลิซึมของพืชได้อย่างไร (II) องค์ประกอบข้อมูลหลักของความยืดหยุ่นทางเมตาโบลิซึมที่สามารถวัดปริมาณได้เพื่อทดสอบการคาดการณ์ของทฤษฎีการป้องกันระยะยาวคืออะไร (III) ควรปรับเปลี่ยนเมตาโบลิซึมของพืชในลักษณะเฉพาะต่อผู้โจมตีหรือไม่ ถ้าใช่ ฮอร์โมนพืชมีบทบาทอย่างไรในการปรับแต่งการตอบสนองทางเมตาโบลิซึมที่เฉพาะเจาะจง และเมตาโบไลต์ใดที่ส่งผลต่อความเฉพาะเจาะจงของการป้องกันในแต่ละสายพันธุ์ (IV) เนื่องจากการคาดการณ์ที่ทำโดยทฤษฎีการป้องกันหลายทฤษฎีสามารถขยายไปสู่เนื้อเยื่อทางชีวภาพทุกระดับได้ เราจึงตั้งคำถามว่าการตอบสนองทางเมตาโบลิซึมที่เกิดขึ้นนั้นมีความสอดคล้องกันมากน้อยเพียงใดเมื่อเปรียบเทียบภายในกับการเปรียบเทียบระหว่างสายพันธุ์ ด้วยเหตุนี้ เราจึงได้ศึกษาเมตาโบโลมของใบยาสูบพันธุ์นิโคตินอย่างเป็นระบบ ซึ่งเป็นพืชต้นแบบทางนิเวศวิทยาที่มีกระบวนการเผาผลาญเฉพาะทางที่หลากหลาย และมีประสิทธิภาพในการกำจัดตัวอ่อนของแมลงกินพืชพื้นเมืองสองชนิด ได้แก่ หนอนผีเสื้อ Datura (Ms) (ดุร้ายมาก กินพืชวงศ์ Solanaceae เป็นหลัก) และหนอนผีเสื้อ Spodoptera littoralis (Sl) ซึ่งเป็นหนอนใบฝ้ายชนิดหนึ่ง โดยมีพืชอาศัยเป็นพืชวงศ์ Solanaceae และพืชอาศัยในสกุลและวงศ์อื่นๆ เราได้วิเคราะห์สเปกตรัมเมตาโบโลมิกส์ MS/MS และสกัดตัวบ่งชี้ทางสถิติจากทฤษฎีสารสนเทศเพื่อเปรียบเทียบทฤษฎี OD และ MT สร้างแผนที่ความจำเพาะเพื่อเปิดเผยเอกลักษณ์ของเมตาโบไลต์ที่สำคัญ การวิเคราะห์ได้ขยายไปยังประชากรพื้นเมืองของ N. nasi และสายพันธุ์ยาสูบที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด เพื่อวิเคราะห์ความแปรปรวนร่วมกันระหว่างการส่งสัญญาณฮอร์โมนพืชและการเหนี่ยวนำ OD ต่อไป
เพื่อให้ได้แผนที่โดยรวมเกี่ยวกับความยืดหยุ่นและโครงสร้างของเมตาโบโลมใบยาสูบกินพืช เราใช้เวิร์กโฟลว์การวิเคราะห์และการคำนวณที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้เพื่อรวบรวมและแยกสเปกตรัม MS/MS อิสระความละเอียดสูงจากสารสกัดจากพืชอย่างครอบคลุม (9) วิธีการที่ไม่แยกความแตกต่างนี้ (เรียกว่า MS/MS) สามารถสร้างสเปกตรัมของสารประกอบที่ไม่ซ้ำซ้อน ซึ่งสามารถนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ระดับสารประกอบทั้งหมดที่อธิบายไว้ในที่นี้ได้ เมตาโบไลต์ของพืชที่แยกออกมาเหล่านี้มีหลายประเภท ประกอบด้วยเมตาโบไลต์หลายร้อยถึงหลายพันชนิด (ประมาณ 500-1000 ชนิดต่อ MS/MS ในที่นี้) ในที่นี้ เราพิจารณาความยืดหยุ่นของเมตาโบลิซึมในกรอบของทฤษฎีสารสนเทศ และวัดปริมาณความหลากหลายและความเชี่ยวชาญของเมตาโบโลมโดยอิงจากเอนโทรปีของแชนนอนของการกระจายความถี่ของเมตาโบลิซึม โดยใช้สูตรที่นำมาใช้ก่อนหน้านี้ (8) เราคำนวณชุดตัวบ่งชี้ที่สามารถใช้ในการหาปริมาณความหลากหลายของเมตาโบโลม (ตัวบ่งชี้ Hj) ความเชี่ยวชาญของโปรไฟล์เมตาโบลิก (ตัวบ่งชี้ δj) และความเฉพาะเจาะจงของเมตาโบไลต์เดี่ยว (ตัวบ่งชี้ Si) นอกจากนี้ เรายังใช้ดัชนีความยืดหยุ่นระยะทางสัมพัทธ์ (RDPI) ในการหาปริมาณความสามารถในการเหนี่ยวนำเมตาโบโลมของสัตว์กินพืช (รูปที่ 1A) (30) ภายในกรอบทางสถิตินี้ เราถือว่าสเปกตรัม MS/MS เป็นหน่วยข้อมูลพื้นฐาน และประมวลผลความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของ MS/MS ลงในแผนที่การกระจายความถี่ จากนั้นใช้เอนโทรปีของแชนนอนเพื่อประมาณความหลากหลายของเมตาโบโลมจากนั้น ความเฉพาะเจาะจงของเมตาโบโลมวัดได้จากความเฉพาะเจาะจงเฉลี่ยของสเปกตรัม MS/MS เดี่ยว ดังนั้น การเพิ่มขึ้นของความอุดมสมบูรณ์ของคลาส MS/MS บางคลาสหลังจากการเหนี่ยวนำของสัตว์กินพืชจะถูกแปลงเป็นความสามารถในการเหนี่ยวนำสเปกตรัม RDPI และความเฉพาะเจาะจง นั่นคือ การเพิ่มขึ้นของดัชนี δj เนื่องจากมีการผลิตเมตาโบไลต์ที่เฉพาะเจาะจงมากขึ้นและดัชนี Si ที่สูงขึ้น การลดลงของดัชนีความหลากหลาย Hj สะท้อนให้เห็นว่าจำนวน MS/MS ที่สร้างขึ้นลดลง หรือการกระจายความถี่ของโปรไฟล์เปลี่ยนแปลงไปในทิศทางที่ไม่สม่ำเสมอมากขึ้น ในขณะที่ความไม่แน่นอนโดยรวมลดลง การคำนวณดัชนี Si ช่วยให้สามารถระบุได้ว่า MS/MS ใดถูกกระตุ้นโดยสัตว์กินพืชบางชนิด ในทางกลับกัน MS/MS ใดไม่ตอบสนองต่อการกระตุ้น ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้สำคัญในการแยกแยะการทำนาย MT และ OD
(A) ตัวบ่งชี้ทางสถิติที่ใช้สำหรับข้อมูล MS/MS ของสัตว์กินพืช (H1 ถึง Hx) ได้แก่ ความสามารถในการเหนี่ยวนำ (RDPI) ความหลากหลาย (ดัชนี Hj) ความเชี่ยวชาญ (ดัชนี δj) และความจำเพาะของเมตาโบไลต์ (ดัชนี Si) การเพิ่มขึ้นของระดับความเชี่ยวชาญ (δj) บ่งชี้ว่าโดยเฉลี่ยแล้วจะมีการผลิตเมตาโบไลต์ที่จำเพาะต่อสัตว์กินพืชมากขึ้น ในขณะที่การลดลงของความหลากหลาย (Hj) บ่งชี้ถึงการลดลงของการผลิตเมตาโบไลต์หรือการกระจายตัวที่ไม่สม่ำเสมอของเมตาโบไลต์ในแผนที่การกระจายตัว ค่า Si ประเมินว่าเมตาโบไลต์นั้นจำเพาะต่อสภาวะที่กำหนด (ในที่นี้คือสัตว์กินพืช) หรือในทางกลับกันคงอยู่ในระดับเดียวกัน (B) แผนภาพแนวคิดของการทำนายทฤษฎีการป้องกันโดยใช้แกนทฤษฎีสารสนเทศ ทฤษฎี OD ทำนายว่าการโจมตีของสัตว์กินพืชจะเพิ่มเมตาโบไลต์ป้องกัน ซึ่งจะทำให้ δj เพิ่มขึ้น ในขณะเดียวกัน Hj จะลดลงเนื่องจากโปรไฟล์ได้รับการจัดระเบียบใหม่ไปสู่ความไม่แน่นอนของข้อมูลเมตาโบไลต์ที่ลดลง ทฤษฎี MT ทำนายว่าการโจมตีของสัตว์กินพืชจะทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่ไม่เป็นทิศทางในเมตาโบโลม ส่งผลให้ Hj เพิ่มขึ้น ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ความไม่แน่นอนของข้อมูลเมตาโบลิกที่เพิ่มขึ้น และทำให้ Si กระจายตัวแบบสุ่ม นอกจากนี้ เรายังเสนอแบบจำลองผสม ซึ่งเป็น MT ที่ดีที่สุด โดยที่เมตาโบไลต์บางชนิดที่มีคุณค่าในการป้องกันสูงจะเพิ่มขึ้นเป็นพิเศษ (ค่า Si สูง) ในขณะที่เมตาโบไลต์อื่นๆ จะแสดงการตอบสนองแบบสุ่ม (ค่า Si ต่ำ)
โดยใช้ตัวบ่งชี้ทฤษฎีสารสนเทศ เราตีความทฤษฎี OD เพื่อทำนายว่าการเปลี่ยนแปลงของเมตาโบไลต์พิเศษที่เกิดจากการกินพืชในสภาวะคงที่ที่ไม่ได้ถูกกระตุ้น จะนำไปสู่ ​​(i) การเพิ่มขึ้นของความจำเพาะของเมตาโบลิซึม (ดัชนี Si) ซึ่งขับเคลื่อนความจำเพาะของเมตาโบโนมิก (ดัชนี δj) (การเพิ่มขึ้นของกลุ่มเมตาโบไลต์พิเศษบางกลุ่มที่มีค่าการป้องกันสูงกว่า) และ (ii) การลดลงของความหลากหลายของเมตาโบโลม (ดัชนี Hj) เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงของการกระจายความถี่ของเมตาโบลิซึมไปสู่การกระจายแบบเลปตินมากขึ้น ในระดับของเมตาโบไลต์เดี่ยว คาดว่าจะมีการกระจาย Si ที่เป็นระเบียบ โดยที่เมตาโบไลต์จะเพิ่มค่า Si ตามค่าการป้องกันของมัน (รูปที่ 1B) ในทำนองเดียวกัน เราอธิบายทฤษฎี MT เพื่อทำนายว่าการกระตุ้นจะนำไปสู่ ​​(i) การเปลี่ยนแปลงของเมตาโบไลต์ที่ไม่เป็นทิศทาง ส่งผลให้ดัชนี δj ลดลง และ (ii) การเพิ่มขึ้นของดัชนี Hj เนื่องจากการเพิ่มขึ้นของความไม่แน่นอนของเมตาโบลิซึม หรือความสุ่ม ซึ่งสามารถวัดปริมาณได้ด้วยเอนโทรปีของแชนนอนในรูปแบบของความหลากหลายทั่วไป สำหรับองค์ประกอบทางเมตาบอลิซึม ทฤษฎี MT จะทำนายการกระจายตัวแบบสุ่มของ Si โดยคำนึงถึงว่าเมตาบอไลต์บางชนิดอยู่ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ และเมตาบอไลต์อื่นๆ ไม่ได้อยู่ภายใต้เงื่อนไขเฉพาะ และคุณค่าในการป้องกันขึ้นอยู่กับสภาพแวดล้อม เราจึงเสนอแบบจำลองการป้องกันแบบผสม ซึ่ง δj และ Hj กระจายตัวเป็นสองส่วนตามการเพิ่มขึ้นของ Si ในทุกทิศทาง เฉพาะกลุ่มเมตาบอไลต์บางกลุ่มที่มีคุณค่าในการป้องกันสูงกว่าเท่านั้นที่จะทำให้ Si เพิ่มขึ้นเป็นพิเศษ ในขณะที่กลุ่มอื่นๆ จะมีการกระจายตัวแบบสุ่ม (รูปที่ 1B)
เพื่อทดสอบการทำนายทฤษฎีการป้องกันที่ปรับปรุงใหม่บนแกนของตัวบ่งชี้ทฤษฎีสารสนเทศ เราได้เลี้ยงตัวอ่อนของสัตว์กินพืชชนิดผู้เชี่ยวชาญ (Ms) หรือชนิดทั่วไป (Sl) บนใบของ Nepenthes pallens (รูปที่ 2A) โดยใช้การวิเคราะห์ MS/MS เราได้สเปกตรัม MS/MS ที่ไม่ซ้ำกัน 599 สเปกตรัม (ไฟล์ข้อมูล S1) จากสารสกัดเมทานอลของเนื้อเยื่อใบที่เก็บรวบรวมหลังจากตัวหนอนกินใบแล้ว การใช้ดัชนี RDPI, Hj และ δj เพื่อแสดงภาพการปรับโครงสร้างของเนื้อหาสารสนเทศในไฟล์การกำหนดค่า MS/MS เผยให้เห็นรูปแบบที่น่าสนใจ (รูปที่ 2B) แนวโน้มโดยรวมคือ ตามที่อธิบายโดยตัวบ่งชี้สารสนเทศ เมื่อตัวหนอนกินใบต่อไป ระดับของการจัดระเบียบเมตาบอลิซึมทั้งหมดจะเพิ่มขึ้นตามเวลา: 72 ชั่วโมงหลังจากที่สัตว์กินพืชกินใบแล้ว ค่า RDPI จะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับความเสียหาย ค่า Hj ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งเป็นผลมาจากระดับความเชี่ยวชาญของโปรไฟล์เมตาบอลิซึมที่เพิ่มขึ้น ซึ่งวัดได้จากดัชนี δj แนวโน้มที่เห็นได้ชัดนี้สอดคล้องกับการคาดการณ์ของทฤษฎี OD แต่ไม่สอดคล้องกับการคาดการณ์หลักของทฤษฎี MT ซึ่งเชื่อว่าการเปลี่ยนแปลงแบบสุ่ม (ไม่มีทิศทาง) ในระดับเมตาบอไลต์ถูกใช้เป็นกลอุบายป้องกันตัว (รูปที่ 1B) แม้ว่าปริมาณสารกระตุ้นการหลั่งในช่องปาก (OS) และพฤติกรรมการกินของสัตว์กินพืชทั้งสองชนิดนี้จะแตกต่างกัน แต่การกินโดยตรงของพวกมันส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่คล้ายคลึงกันในทิศทางของ Hj และ δj ในช่วงเวลาเก็บเกี่ยว 24 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมง ความแตกต่างเพียงอย่างเดียวเกิดขึ้นที่ 72 ชั่วโมงหลังการเก็บเกี่ยว เมื่อเปรียบเทียบกับที่เกิดจากการกิน Ms เมตาบอลิซึมโดยรวมที่เกิดจากการกิน Sl นั้นสูงกว่า
(A) การออกแบบการทดลอง: หมูธรรมดา (S1) หรือสัตว์กินพืชผู้เชี่ยวชาญ (Ms) ได้รับอาหารเป็นใบหม้อข้าวหม้อแกงลิงที่ผ่านการกำจัดเกลือแล้ว ในขณะที่สำหรับการจำลองการกินพืชโดยสัตว์กินพืช จะใช้ OS ของ Ms (W + OSMs) เพื่อทำให้เกิดบาดแผลจากการเจาะใบในตำแหน่งมาตรฐาน S1 (W + OSSl) ได้รับอาหารเป็นตัวอ่อนหรือน้ำ (W + W) กลุ่มควบคุม (C) คือใบที่ไม่ได้รับความเสียหาย (B) ดัชนีการเหนี่ยวนำ (RDPI เปรียบเทียบกับแผนภูมิควบคุม) ความหลากหลาย (ดัชนี Hj) และความเชี่ยวชาญ (ดัชนี δj) คำนวณจากแผนที่เมตาโบไลต์พิเศษ (599 MS/MS; ไฟล์ข้อมูล S1) เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการให้อาหารโดยตรงของสัตว์กินพืชและกลุ่มควบคุม (การทดสอบ t ของนักเรียนด้วยการทดสอบ t แบบจับคู่ *P<0.05 และ ***P<0.001) ns หมายถึงไม่มีนัยสำคัญ (C) ดัชนีความละเอียดเวลาของสเปกตรัมเมตาโบไลต์หลัก (กรอบสีน้ำเงิน กรดอะมิโน กรดอินทรีย์ และน้ำตาล; ไฟล์ข้อมูล S2) และสเปกตรัมเมตาโบไลต์พิเศษ (กรอบสีแดง 443 MS/MS; ไฟล์ข้อมูล S1) หลังจากการจำลองการกินพืช แถบสีหมายถึงช่วงความเชื่อมั่น 95% เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มทดลองและกลุ่มควบคุม [การวิเคราะห์ความแปรปรวนกำลังสอง (ANOVA) ตามด้วยความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของ Tukey (HSD) สำหรับการเปรียบเทียบหลายกลุ่มแบบ post hoc *P<0.05, **P<0.01 และ *** P <0.001] (D) การแบ่งย่อยของแผนภาพกระจายและโปรไฟล์เมตาโบไลต์พิเศษ (ตัวอย่างซ้ำที่มีการทดลองต่างกัน)
เพื่อสำรวจว่าการปรับโครงสร้างใหม่ในระดับเมตาโบโลมที่เกิดจากการกินพืชของสัตว์นั้นสะท้อนให้เห็นในการเปลี่ยนแปลงระดับของเมตาโบไลต์แต่ละชนิดหรือไม่ เราจึงมุ่งเน้นไปที่เมตาโบไลต์ที่เคยศึกษาในใบของ Nepenthes pallens ที่มีความต้านทานต่อการกินพืชของสัตว์ที่ได้รับการพิสูจน์แล้วก่อน ฟีนอลิกอะไมด์เป็นสารประกอบไฮดรอกซีซินนาไมด์-โพลีอะมีนที่สะสมในระหว่างกระบวนการกินพืชของแมลงและเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถลดประสิทธิภาพของแมลงได้ (32) เราค้นหาสารตั้งต้นของ MS/MS ที่เกี่ยวข้องและพล็อตเส้นโค้งจลนศาสตร์สะสม (รูปที่ S1) ไม่น่าแปลกใจที่อนุพันธ์ของฟีนอลที่ไม่เกี่ยวข้องโดยตรงกับการป้องกันการกินพืชของสัตว์ เช่น กรดคลอโรเจนิค (CGA) และรูติน จะถูกควบคุมให้ลดลงหลังจากการกินพืชของสัตว์ ในทางตรงกันข้าม สัตว์กินพืชสามารถทำให้ฟีนอลิกอะไมด์มีฤทธิ์สูงขึ้นได้ การให้อาหารอย่างต่อเนื่องของสัตว์กินพืชทั้งสองชนิดส่งผลให้สเปกตรัมการกระตุ้นของฟีนอลาไมด์เกือบจะเหมือนกัน และรูปแบบนี้ชัดเจนเป็นพิเศษสำหรับการสังเคราะห์ฟีนอลาไมด์แบบ de novo ปรากฏการณ์เดียวกันนี้จะถูกสังเกตเมื่อสำรวจเส้นทาง 17-ไฮดรอกซีเจอรานิลโนนาเนไดออลไดเทอร์พีนไกลโคไซด์ (17-HGL-DTGs) ซึ่งผลิตไดเทอร์พีนแบบอะไซคลิกจำนวนมากที่มีฟังก์ชันต่อต้านสัตว์กินพืชที่มีประสิทธิภาพ (33) ซึ่งการให้อาหาร Ms ด้วย Sl กระตุ้นให้เกิดโปรไฟล์การแสดงออกที่คล้ายกัน (รูปที่ S1)
ข้อเสียที่อาจเกิดขึ้นจากการทดลองการให้อาหารโดยตรงของสัตว์กินพืชคือ ความแตกต่างของอัตราการบริโภคใบและระยะเวลาการกินของสัตว์กินพืช ซึ่งทำให้ยากที่จะกำจัดผลกระทบเฉพาะของสัตว์กินพืชที่เกิดจากบาดแผลและสัตว์กินพืช เพื่อให้สามารถแก้ปัญหาความเฉพาะเจาะจงของชนิดสัตว์กินพืชต่อการตอบสนองทางเมตาบอลิซึมของใบที่เกิดขึ้นได้ดียิ่งขึ้น เราจึงจำลองการกินของตัวอ่อน Ms และ Sl โดยการใช้ OS ที่เก็บมาใหม่ (OSM และ OSS1) กับรอยเจาะมาตรฐาน W ที่ตำแหน่งใบที่สม่ำเสมอทันที ขั้นตอนนี้เรียกว่าการบำบัด W + OS และทำให้การเหนี่ยวนำเป็นมาตรฐานโดยการกำหนดเวลาเริ่มต้นของการตอบสนองที่เกิดจากสัตว์กินพืชอย่างแม่นยำโดยไม่ทำให้เกิดผลกระทบที่ทำให้เกิดความสับสนจากความแตกต่างในอัตราหรือปริมาณของการสูญเสียเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2A) (34) โดยใช้ขั้นตอนการวิเคราะห์และการคำนวณ MS/MS เราได้สเปกตรัม MS/MS จำนวน 443 รายการ (ไฟล์ข้อมูล S1) ซึ่งทับซ้อนกับสเปกตรัมที่รวบรวมไว้ก่อนหน้านี้จากการทดลองการให้อาหารโดยตรง การวิเคราะห์ทฤษฎีสารสนเทศของชุดข้อมูล MS/MS นี้แสดงให้เห็นว่า การปรับเปลี่ยนเมตาโบโลมที่เฉพาะเจาะจงกับใบไม้โดยการจำลองการกินของสัตว์กินพืช แสดงให้เห็นถึงการกระตุ้นที่เฉพาะเจาะจงกับ OS (รูปที่ 2C) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วย OSS1 แล้ว OSM ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของความเชี่ยวชาญด้านเมตาโบโลมที่ 4 ชั่วโมง เป็นที่น่าสังเกตว่า เมื่อเปรียบเทียบกับชุดข้อมูลการทดลองการกินของสัตว์กินพืชโดยตรง จลนพลศาสตร์ของการเผาผลาญที่แสดงในพื้นที่สองมิติโดยใช้ Hj และ δj เป็นพิกัด และทิศทางของความเชี่ยวชาญด้านเมตาโบโลมในการตอบสนองต่อการจำลองการกินของสัตว์กินพืชเมื่อเวลาผ่านไปนั้นเพิ่มขึ้นอย่างสม่ำเสมอ (รูปที่ 2D) ในขณะเดียวกัน เราได้วัดปริมาณของกรดอะมิโน กรดอินทรีย์ และน้ำตาล (ไฟล์ข้อมูล S2) เพื่อตรวจสอบว่าการเพิ่มขึ้นของความเชี่ยวชาญด้านเมตาโบโลมที่มุ่งเป้าหมายนี้เกิดจากการปรับโครงสร้างของการเผาผลาญคาร์บอนส่วนกลางเพื่อตอบสนองต่อการจำลองการกินของสัตว์กินพืชหรือไม่ (รูปที่ S2) เพื่ออธิบายรูปแบบนี้ให้ดียิ่งขึ้น เราจึงติดตามจลนศาสตร์การสะสมเมตาบอลิซึมของวิถีฟีนอลาไมด์และ 17-HGL-DTG ที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้เพิ่มเติม การเหนี่ยวนำเฉพาะ OS ของสัตว์กินพืชถูกเปลี่ยนไปเป็นรูปแบบการจัดเรียงใหม่ที่แตกต่างกันภายในเมตาบอลิซึมของฟีนอลาไมด์ (รูปที่ S3) ฟีนอลิกอะไมด์ที่มีหมู่คูมารินและคาเฟออยล์จะถูกเหนี่ยวนำโดย OSS1 เป็นพิเศษ ในขณะที่ OSM กระตุ้นการเหนี่ยวนำเฉพาะของสารประกอบเฟอรูลิล สำหรับวิถี 17-HGL-DTG ตรวจพบการเหนี่ยวนำ OS ที่แตกต่างกันโดยผลิตภัณฑ์มาโลนิเลชันและไดมาโลนิเลชันในขั้นตอนถัดไป (รูปที่ S3)
ต่อไป เราศึกษาความยืดหยุ่นของทรานสคริปโตมที่เกิดจาก OS โดยใช้ชุดข้อมูลไมโครอาร์เรย์แบบอนุกรมเวลา ซึ่งจำลองการใช้ OSM ในการรักษาใบของพืชโรเซ็ตในสัตว์กินพืช จลนพลศาสตร์การสุ่มตัวอย่างโดยพื้นฐานแล้วทับซ้อนกับจลนพลศาสตร์ที่ใช้ในการศึกษาเมตาโบโลมิกส์นี้ (35) เมื่อเปรียบเทียบกับการปรับโครงสร้างเมตาโบโลมซึ่งความยืดหยุ่นของเมตาโบลิกเพิ่มขึ้นเป็นพิเศษเมื่อเวลาผ่านไป เราสังเกตเห็นการระเบิดของการถอดรหัสชั่วคราวในใบที่เกิดจาก Ms ซึ่งความสามารถในการเหนี่ยวนำทรานสคริปโตม (RDPI) และความเชี่ยวชาญ (δj) อยู่ที่ 1 ชั่วโมง มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในความหลากหลาย (Hj) ณ จุดเวลานี้ การแสดงออกของ BMP1 ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ตามด้วยการผ่อนคลายความเชี่ยวชาญของทรานสคริปโตม (รูปที่ S4) กลุ่มยีนเมตาบอลิซึม (เช่น P450, ไกลโคซิลทรานสเฟอเรส และ BAHD อะซิลทรานสเฟอเรส) มีส่วนร่วมในกระบวนการประกอบเมตาบอไลต์พิเศษจากหน่วยโครงสร้างที่ได้มาจากเมตาบอลิซึมหลัก ตามแบบจำลองความเชี่ยวชาญสูงในระยะเริ่มต้นที่กล่าวถึงข้างต้น ในการศึกษาตัวอย่าง ได้วิเคราะห์วิถีเมตาบอลิซึมของฟีนิลอะลานีน การวิเคราะห์ยืนยันว่ายีนหลักในเมตาบอลิซึมของฟีนอลาไมด์ถูกกระตุ้นด้วย OS อย่างมากในพืชที่ถูกสัตว์กินพืชดึงดูด เมื่อเทียบกับพืชที่ไม่ถูกดึงดูด และมีรูปแบบการแสดงออกที่สอดคล้องกันอย่างใกล้ชิด ปัจจัยการถอดรหัส MYB8 และยีนโครงสร้าง PAL1, PAL2, C4H และ 4CL ในต้นน้ำของวิถีนี้แสดงให้เห็นการเริ่มต้นการถอดรหัสในระยะเริ่มต้น อะซิลทรานสเฟอเรสที่มีบทบาทในการประกอบฟีนอลาไมด์ขั้นสุดท้าย เช่น AT1, DH29 และ CV86 แสดงรูปแบบการควบคุมการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง (รูปที่ S4) ข้อสังเกตข้างต้นบ่งชี้ว่า การเริ่มต้นของการสร้างความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของทรานสคริปโตมในระยะแรก และการเสริมสร้างความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของเมตาโบโลมิกส์ในภายหลังนั้น เป็นรูปแบบที่เชื่อมโยงกัน ซึ่งอาจเป็นผลมาจากระบบควบคุมแบบซิงโครนัสที่เริ่มต้นการตอบสนองการป้องกันที่มีประสิทธิภาพ
การปรับโครงสร้างใหม่ของการส่งสัญญาณฮอร์โมนพืชทำหน้าที่เป็นชั้นควบคุมที่บูรณาการข้อมูลจากการกินพืชของสัตว์กินพืชเพื่อตั้งโปรแกรมสรีรวิทยาของพืชใหม่ หลังจากจำลองการกินพืชของสัตว์กินพืชแล้ว เราได้วัดพลวัตสะสมของหมวดหมู่ฮอร์โมนพืชที่สำคัญและแสดงภาพการแสดงออกร่วมกันตามเวลา [สัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เพียร์สัน (PCC) > 0.4] (รูปที่ 3A) ดังที่คาดไว้ ฮอร์โมนพืชที่เกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์ทางชีวภาพจะเชื่อมโยงกันภายในเครือข่ายการแสดงออกร่วมกันของฮอร์โมนพืช นอกจากนี้ ความจำเพาะของการเผาผลาญ (ดัชนี Si) ยังถูกแมปไปยังเครือข่ายนี้เพื่อเน้นฮอร์โมนพืชที่ถูกกระตุ้นโดยการรักษาที่แตกต่างกัน พื้นที่หลักสองแห่งของการตอบสนองที่เฉพาะเจาะจงต่อการกินพืชของสัตว์กินพืชถูกวาดขึ้น: แห่งหนึ่งอยู่ในกลุ่ม JA ซึ่ง JA (รูปแบบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพ JA-Ile) และอนุพันธ์ JA อื่น ๆ แสดงคะแนน Si สูงที่สุด อีกแห่งหนึ่งคือเอทิลีน (ET) จิบเบอเรลลินแสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นของความจำเพาะต่อสัตว์กินพืชในระดับปานกลางเท่านั้น ในขณะที่ฮอร์โมนพืชอื่นๆ เช่น ไซโตไคนิน ออกซิน และกรดแอบซิสิก มีความจำเพาะในการกระตุ้นต่อสัตว์กินพืชต่ำ เมื่อเปรียบเทียบกับการใช้ W + W เพียงอย่างเดียว การขยายค่าสูงสุดของอนุพันธ์ JA ผ่านการใช้ OS (W + OS) สามารถเปลี่ยนเป็นตัวบ่งชี้ความจำเพาะที่แข็งแกร่งของ JA ได้อย่างน่าประหลาดใจ OSM และ OSS1 ที่มีปริมาณสารกระตุ้นต่างกัน กลับทำให้เกิดการสะสมของ JA และ JA-Ile ในระดับที่คล้ายคลึงกัน ในทางตรงกันข้ามกับ OSS1 OSM ถูกกระตุ้นอย่างจำเพาะเจาะจงและรุนแรงโดย OSM ในขณะที่ OSS1 ไม่ได้ขยายการตอบสนองของบาดแผลที่โคนต้น (รูปที่ 3B)
(A) การวิเคราะห์เครือข่ายการแสดงออกร่วมกันโดยอิงจากการคำนวณ PCC ของการจำลองจลนศาสตร์การสะสมฮอร์โมนพืชที่เกิดจากการกินของสัตว์กินพืช โหนดแสดงถึงฮอร์โมนพืชแต่ละชนิด และขนาดของโหนดแสดงถึงดัชนี Si เฉพาะสำหรับฮอร์โมนพืชระหว่างการทดลอง (B) การสะสมของ JA, JA-Ile และ ET ในใบที่เกิดจากการทดลองที่แตกต่างกัน แสดงด้วยสีต่างๆ: สีแอปริคอต, W + OSM; สีน้ำเงิน, W + OSSl; สีดำ, W + W; สีเทา, C (กลุ่มควบคุม) เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลองและกลุ่มควบคุม (ANOVA สองทาง ตามด้วยการเปรียบเทียบหลายคู่แบบ Tukey HSD, *** P <0.001) การวิเคราะห์ทฤษฎีสารสนเทศของ (C)697 MS/MS (ไฟล์ข้อมูล S1) ในการสังเคราะห์ JA และสเปกตรัมการรับรู้ที่บกพร่อง (irAOC และ irCOI1) และ (D)585 MS/MS (ไฟล์ข้อมูล S1) ใน ETR1 ที่มีสัญญาณ ET บกพร่อง การทดลองจำลองการกินพืชสองครั้งทำให้เกิดสายพันธุ์พืชที่กระตุ้นและพืชควบคุมที่ไม่มีสารใดๆ (EV) เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการทดลอง W+OS และพืชควบคุมที่ไม่ได้รับความเสียหาย (ANOVA สองทาง ตามด้วยการเปรียบเทียบหลายคู่แบบ Tukey HSD post hoc, *P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001) (E) กราฟกระจายแสดงการต่อต้านที่กระจัดกระจายต่อการเชี่ยวชาญเฉพาะด้าน สีต่างๆ แทนสายพันธุ์ที่ได้รับการดัดแปลงพันธุกรรมที่แตกต่างกัน สัญลักษณ์แทนวิธีการรักษาที่แตกต่างกัน: สามเหลี่ยม, W + OSS1; สี่เหลี่ยมผืน, W + OSM; วงกลม C
ถัดไป เราใช้สายพันธุ์ Nepenthes ที่ได้รับการดัดแปลงทางพันธุกรรม (irCOI1 และ sETR1) ในขั้นตอนสำคัญของการสังเคราะห์ JA และ ET (irAOC และ irACO) และการรับรู้ (irCOI1 และ sETR1) เพื่อวิเคราะห์การเผาผลาญของฮอร์โมนพืชทั้งสองชนิดนี้ต่อสัตว์กินพืช การมีส่วนร่วมสัมพัทธ์ของการปรับเปลี่ยนโปรแกรม สอดคล้องกับการทดลองก่อนหน้านี้ เรายืนยันการเหนี่ยวนำของ OS ที่เกิดจากสัตว์กินพืชในพืชที่ไม่มีตัวพา (EV) (รูปที่ 3, C ถึง D) และการลดลงโดยรวมของดัชนี Hj ที่เกิดจาก OSM ในขณะที่ดัชนี δj เพิ่มขึ้น การตอบสนองนั้นเด่นชัดกว่าการตอบสนองที่เกิดจาก OSS1 กราฟสองเส้นโดยใช้ Hj และ δj เป็นพิกัดแสดงให้เห็นถึงการควบคุมที่ผิดปกติโดยเฉพาะ (รูปที่ 3E) แนวโน้มที่ชัดเจนที่สุดคือในสายพันธุ์ที่ขาดสัญญาณ JA ความหลากหลายของเมตาโบโลมและการเปลี่ยนแปลงความเชี่ยวชาญที่เกิดจากสัตว์กินพืชถูกกำจัดออกไปเกือบหมด (รูปที่ 3C) ในทางตรงกันข้าม การรับรู้ ET ที่เงียบในพืช sETR1 แม้ว่าผลโดยรวมต่อการเปลี่ยนแปลงในเมตาบอลิซึมของสัตว์กินพืชจะต่ำกว่าการส่งสัญญาณ JA มาก แต่ก็ลดความแตกต่างของดัชนี Hj และ δj ระหว่างการกระตุ้น OSM และ OSS1 (รูปที่ 3D และรูปที่ S5) สิ่งนี้บ่งชี้ว่า นอกเหนือจากหน้าที่หลักของการส่งสัญญาณ JA แล้ว การส่งสัญญาณ ET ยังทำหน้าที่เป็นการปรับแต่งอย่างละเอียดของปฏิกิริยาเมตาบอลิซึมเฉพาะสายพันธุ์ของสัตว์กินพืช สอดคล้องกับหน้าที่การปรับแต่งอย่างละเอียดนี้ ความสามารถในการเหนี่ยวนำเมตาโบโลมโดยรวมในพืช sETR1 จึงไม่มีการเปลี่ยนแปลง ในทางกลับกัน เมื่อเปรียบเทียบกับพืช sETR1 พืช irACO เหนี่ยวนำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเมตาบอลิซึมโดยรวมที่เกิดจากสัตว์กินพืชในระดับที่คล้ายคลึงกัน แต่แสดงให้เห็นคะแนน Hj และ δj ที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการกระตุ้น OSM และ OSS1 (รูปที่ S5)
เพื่อระบุเมตาโบไลต์เฉพาะที่มีส่วนสำคัญต่อการตอบสนองเฉพาะสายพันธุ์ของสัตว์กินพืช และปรับแต่งการผลิตผ่านสัญญาณ ET เราได้ใช้วิธี MS/MS เชิงโครงสร้างที่พัฒนาขึ้นก่อนหน้านี้ วิธีนี้อาศัยวิธีการจัดกลุ่มแบบสองมิติเพื่ออนุมานตระกูลเมตาโบลิกใหม่จากชิ้นส่วน MS/MS [ผลคูณดอทแบบนอร์มาไลซ์ (NDP)] และคะแนนความคล้ายคลึงกันโดยอิงจากการสูญเสียที่เป็นกลาง (NL) ชุดข้อมูล MS/MS ที่สร้างขึ้นจากการวิเคราะห์สายพันธุ์ทรานส์เจนิก ET สร้าง MS/MS จำนวน 585 รายการ (ไฟล์ข้อมูล S1) ซึ่งได้รับการแก้ไขโดยการจัดกลุ่มเป็นโมดูล MS/MS หลักเจ็ดโมดูล (M) (รูปที่ 4A) บางโมดูลเหล่านี้มีเมตาโบไลต์พิเศษที่ได้รับการระบุลักษณะไว้ก่อนหน้านี้อย่างหนาแน่น ตัวอย่างเช่น M1, M2, M3, M4 และ M7 อุดมไปด้วยอนุพันธ์ฟีนอลต่างๆ (M1), ฟลาโวนอยด์ไกลโคไซด์ (M2), อะซิลซูการ์ (M3 และ M4) และ 17-HGL-DTG (M7) นอกจากนี้ ยังมีการคำนวณข้อมูลเฉพาะด้านเมตาบอลิซึม (ดัชนี Si) ของเมตาบอไลต์เดี่ยวในแต่ละโมดูล และสามารถมองเห็นการกระจาย Si ได้อย่างง่ายดาย กล่าวโดยสรุป สเปกตรัม MS/MS ที่แสดงความจำเพาะต่อการกินพืชและพันธุกรรมสูง จะมีค่า Si สูง และสถิติความโค้งบ่งชี้ถึงการกระจายของขนที่มุมหางด้านขวา การกระจายคอลลอยด์แบบลีนดังกล่าวถูกตรวจพบใน M1 ซึ่งฟีนอลอะไมด์แสดงค่า Si สูงที่สุด (รูปที่ 4B) 17-HGL-DTG ที่เหนี่ยวนำโดยการกินพืชที่กล่าวถึงก่อนหน้านี้ใน M7 แสดงค่า Si ปานกลาง ซึ่งบ่งชี้ถึงระดับการควบคุมที่แตกต่างกันปานกลางระหว่าง OS สองประเภท ในทางตรงกันข้าม เมตาบอไลต์เฉพาะที่ผลิตขึ้นอย่างต่อเนื่องส่วนใหญ่ เช่น รูติน CGA และอะซิลซูการ์ มีค่า Si ต่ำที่สุด เพื่อให้สามารถสำรวจความซับซ้อนของโครงสร้างและการกระจาย Si ระหว่างเมตาบอไลต์เฉพาะได้ดียิ่งขึ้น จึงได้สร้างเครือข่ายโมเลกุลสำหรับแต่ละโมดูล (รูปที่ 4B) การคาดการณ์ที่สำคัญของทฤษฎี OD (สรุปไว้ในรูปที่ 1B) คือ การจัดระเบียบใหม่ของเมตาโบไลต์พิเศษหลังจากการถูกแมลงกินพืชกัดกิน ควรนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงแบบทางเดียวในเมตาโบไลต์ที่มีค่าการป้องกันสูง โดยเฉพาะอย่างยิ่งโดยการเพิ่มความเฉพาะเจาะจง (ตรงข้ามกับการกระจายแบบสุ่ม) เมตาโบไลต์ป้องกันที่ทำนายโดยทฤษฎี MT อนุพันธ์ของฟีนอลส่วนใหญ่ที่สะสมอยู่ใน M1 มีความสัมพันธ์เชิงฟังก์ชันกับการลดลงของประสิทธิภาพของแมลง (32) เมื่อเปรียบเทียบค่า Si ในเมตาโบไลต์ M1 ระหว่างใบที่ถูกกระตุ้นและใบที่เป็นส่วนประกอบของพืชควบคุม EV ที่ 24 ชั่วโมง เราสังเกตเห็นว่าความเฉพาะเจาะจงของเมตาโบไลต์หลายชนิดหลังจากการถูกแมลงกินพืชกัดกินมีแนวโน้มเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4C) ตรวจพบการเพิ่มขึ้นเฉพาะในค่า Si ในฟีนอลาไมด์ป้องกันเท่านั้น แต่ไม่พบการเพิ่มขึ้นของค่า Si ในฟีนอลอื่นๆ และเมตาโบไลต์ที่ไม่รู้จักที่อยู่ร่วมกันในโมดูลนี้ นี่คือแบบจำลองเฉพาะ ซึ่งเกี่ยวข้องกับทฤษฎี OD การคาดการณ์หลักเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากสัตว์กินพืชมีความสอดคล้องกัน เพื่อทดสอบว่าลักษณะเฉพาะของสเปกตรัมฟีนอลาไมด์นี้ถูกเหนี่ยวนำโดย ET ที่จำเพาะต่อ OS หรือไม่ เราจึงพล็อตดัชนี Si ของเมตาบอไลต์และทำให้ค่าการแสดงออกที่แตกต่างกันระหว่าง OSM และ OSS1 ในจีโนไทป์ EV และ sETR1 (รูปที่ 4D) ใน sETR1 ความแตกต่างระหว่าง OSM และ OSS1 ที่เกิดจากฟีนอลาไมด์ลดลงอย่างมาก วิธีการจัดกลุ่มแบบไบคลัสเตอร์ยังถูกนำมาใช้กับข้อมูล MS/MS ที่รวบรวมในสายพันธุ์ที่มี JA ไม่เพียงพอเพื่ออนุมานโมดูล MS/MS หลักที่เกี่ยวข้องกับความเชี่ยวชาญทางเมตาบอลิซึมที่ควบคุมโดย JA (รูปที่ S6)
(A) ผลการจัดกลุ่ม MS/MS จำนวน 585 ตัวอย่าง โดยพิจารณาจากชิ้นส่วนที่ใช้ร่วมกัน (ความคล้ายคลึง NDP) และการสูญเสียที่เป็นกลางที่ใช้ร่วมกัน (ความคล้ายคลึง NL) ส่งผลให้โมดูล (M) สอดคล้องกับตระกูลสารประกอบที่รู้จัก หรือโดยองค์ประกอบของเมตาโบไลต์ที่ไม่รู้จักหรือไม่ถูกเผาผลาญได้ดี ถัดจากแต่ละโมดูล จะแสดงการกระจายตัวเฉพาะของเมตาโบไลต์ (MS/MS) (Si) (B) เครือข่ายโมเลกุลแบบโมดูลาร์: โหนดแสดงถึง MS/MS และขอบแสดงถึงคะแนน MS/MS ของ NDP (สีแดง) และ NL (สีน้ำเงิน) (ค่าตัด > 0.6) ดัชนีความจำเพาะของเมตาโบไลต์ (Si) ที่แบ่งระดับสีตามโมดูล (ซ้าย) และแมปไปยังเครือข่ายโมเลกุล (ขวา) (C) โมดูล M1 ของพืช EV ในสภาวะปกติ (ควบคุม) และสภาวะเหนี่ยวนำ (จำลองโดยสัตว์กินพืช) ที่ 24 ชั่วโมง: แผนภาพเครือข่ายโมเลกุล (ค่า Si คือขนาดของโหนด ฟีนอลาไมด์ป้องกันถูกเน้นด้วยสีน้ำเงิน) (D) แผนภาพเครือข่ายโมเลกุล M1 ของเส้นสเปกตรัม sETR1 ที่มีการรับรู้ EV และ ET บกพร่อง: สารประกอบฟีนอลแสดงด้วยโหนดวงกลมสีเขียว และความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (ค่า P) ระหว่างการรักษา W + OSM และ W + OSS1 แสดงด้วยขนาดของโหนด CP, N-caffeoyl-tyrosine; CS, N-caffeoyl-spermidine; FP, N-ferulic acid ester-uric acid; FS, N-ferulyl-spermidine; CoP, N', N “-Coumarolyl-tyrosine; DCS, N', N”-dicaffeoyl-spermidine; CFS, N', N”-caffeoyl, feruloyl-spermidine; Lycium barbarum ในโกจิเบอร์รี่ Son; Nick. O-AS, O-acyl sugar.
เราได้ขยายการวิเคราะห์เพิ่มเติมจากจีโนไทป์ Nepenthes ที่อ่อนแอเพียงตัวเดียวไปยังประชากรธรรมชาติ ซึ่งมีการเปลี่ยนแปลงภายในสายพันธุ์ที่รุนแรงในระดับ JA ของสัตว์กินพืชและระดับเมตาโบไลต์เฉพาะที่ได้รับการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ในประชากรธรรมชาติ (26) ใช้ชุดข้อมูลนี้เพื่อครอบคลุมเชื้อพันธุ์ 43 เชื้อพันธุ์ เชื้อพันธุ์เหล่านี้ประกอบด้วยพืช 123 ชนิดจาก N. pallens พืชเหล่านี้ได้มาจากเมล็ดที่เก็บรวบรวมในถิ่นที่อยู่อาศัยตามธรรมชาติที่แตกต่างกันในยูทาห์ เนวาดา แอริโซนา และแคลิฟอร์เนีย (รูปที่ S7) เราคำนวณความหลากหลายของเมตาโบโลม (ในที่นี้เรียกว่าความหลากหลาย β ระดับประชากร) และความเชี่ยวชาญที่เกิดจาก OSM สอดคล้องกับการศึกษาครั้งก่อน เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงทางเมตาโบลิกที่หลากหลายตามแกน Hj และ δj ซึ่งบ่งชี้ว่าเชื้อพันธุ์มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความยืดหยุ่นของการตอบสนองทางเมตาโบลิกต่อสัตว์กินพืช (รูปที่ S7) องค์กรนี้ชวนให้นึกถึงการสังเกตการณ์ก่อนหน้านี้เกี่ยวกับช่วงไดนามิกของการเปลี่ยนแปลง JA ที่เกิดจากสัตว์กินพืช และรักษาระดับค่าที่สูงมากในประชากรเดียว (26, 36) โดยใช้ JA และ JA-Ile เพื่อทดสอบความสัมพันธ์ระดับโดยรวมระหว่าง Hj และ δj เราพบว่ามีความสัมพันธ์เชิงบวกอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง JA และดัชนีความหลากหลาย β ของเมตาโบโลมและความเชี่ยวชาญ (รูปที่ S7) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าความไม่สม่ำเสมอในการเหนี่ยวนำ JA ที่เกิดจากสัตว์กินพืชที่ตรวจพบในระดับประชากรอาจเกิดจากโพลีมอร์ฟิซึมเมตาโบลิกที่สำคัญซึ่งเกิดจากการคัดเลือกจากแมลงกินพืช
การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่ายาสูบแต่ละชนิดมีความแตกต่างกันอย่างมากในด้านประเภทและการพึ่งพาการป้องกันทางเมตาบอลิซึมที่ถูกเหนี่ยวนำและที่เกิดขึ้นเอง เชื่อกันว่าการเปลี่ยนแปลงในการส่งสัญญาณต่อต้านสัตว์กินพืชและความสามารถในการป้องกันเหล่านี้ถูกควบคุมโดยแรงกดดันจากประชากรแมลง วงจรชีวิตของพืช และต้นทุนการผลิตการป้องกันในแหล่งที่อยู่อาศัยที่สายพันธุ์นั้น ๆ เจริญเติบโต เราได้ศึกษาความสม่ำเสมอของการปรับเปลี่ยนเมตาโบโลมของใบที่ถูกเหนี่ยวนำโดยสัตว์กินพืชของยาสูบสกุล Nicotiana จำนวน 6 ชนิดที่เป็นพืชพื้นเมืองของอเมริกาเหนือและอเมริกาใต้ สายพันธุ์เหล่านี้มีความสัมพันธ์ใกล้ชิดกับ Nepenthes North America ได้แก่ Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linear tobacco, tobacco (Nicotiana spegazzinii) และ tobacco leaf tobacco (Nicotiana obtusifolia) (รูปที่ 5A) (37) หกชนิดเหล่านี้ รวมถึงชนิด N. please ที่ได้รับการระบุลักษณะอย่างดี เป็นพืชปีเดียวในกลุ่มเพทูเนีย และ N. obtusifolia เป็นพืชยืนต้นในกลุ่มพี่น้อง Trigonophyllae (38) ต่อมา ได้ทำการเหนี่ยวนำ W + W, W + OSM และ W + OSS1 ในเจ็ดชนิดนี้เพื่อศึกษาการจัดเรียงเมตาบอลิซึมระดับชนิดของการกินของแมลง
(A) แผนภูมิวิวัฒนาการแบบบูตสแตรปโดยอิงจากความน่าจะเป็นสูงสุด [สำหรับการสังเคราะห์กลูตามีนในนิวเคลียส (38)] และการกระจายทางภูมิศาสตร์ของสายพันธุ์ Nicotiana เจ็ดสายพันธุ์ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด (สีต่างกัน) (37) (B) แผนภาพกระจายของความหลากหลายเฉพาะทางสำหรับโปรไฟล์เมตาบอลิกของสายพันธุ์ Nicotiana เจ็ดสายพันธุ์ (939 MS/MS; ไฟล์ข้อมูล S1) ในระดับสายพันธุ์ ความหลากหลายของเมตาโบโลมมีความสัมพันธ์เชิงลบกับระดับความเชี่ยวชาญ การวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระดับสายพันธุ์ระหว่างความหลากหลายทางเมตาบอลิกและความเชี่ยวชาญและการสะสม JA แสดงในรูปที่ 2 S9 สีต่างๆ ประเภทต่างๆ สามเหลี่ยม W + OSS1 สี่เหลี่ยมผืน W + OSM (C) พลวัตของ Nicotiana JA และ JA-Ile ถูกจัดอันดับตามแอมพลิจูดการกระตุ้น OS (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทางและการเปรียบเทียบหลายกลุ่มแบบ Tukey HSD, * P <0.05, ** P <0.01 และ ** สำหรับการเปรียบเทียบ W + OS และ W + W, P <0.001) แผนภาพกล่องของ (D) ความหลากหลาย และ (E) ความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของแต่ละชนิดหลังจากจำลองการกินพืชและเมทิล JA (MeJA) เครื่องหมายดอกจันแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่าง W + OS และ W + W หรือลาโนลินบวก W (Lan + W) หรือ Lan บวก MeJA (Lan + MeJa) และ Lan ควบคุม (การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง ตามด้วยการเปรียบเทียบหลายกลุ่มแบบ Tukey HSD, *P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001)
ด้วยวิธีการจัดกลุ่มแบบคู่ เราได้ระบุโมดูล 9 โมดูลจาก 939 MS/MS (ไฟล์ข้อมูล S1) องค์ประกอบของ MS/MS ที่ถูกปรับเปลี่ยนโดยการบำบัดที่แตกต่างกันนั้นแตกต่างกันอย่างมากในแต่ละโมดูลระหว่างสายพันธุ์ (รูปที่ S8) การแสดงภาพ Hj (ในที่นี้เรียกว่าความหลากหลายแกมมาในระดับสายพันธุ์) และ δj เผยให้เห็นว่าสายพันธุ์ต่างๆ รวมกลุ่มกันเป็นกลุ่มที่แตกต่างกันมากในพื้นที่เมตาบอลิซึม ซึ่งการแบ่งแยกในระดับสายพันธุ์มักจะเด่นชัดกว่าการกระตุ้น ยกเว้น N. linear และ N. obliquus สายพันธุ์อื่นๆ แสดงช่วงไดนามิกที่กว้างของผลกระทบจากการเหนี่ยวนำ (รูปที่ 5B) ในทางตรงกันข้าม สายพันธุ์เช่น N. purpurea และ N. obtusifolia มีการตอบสนองทางเมตาบอลิซึมต่อการบำบัดที่ไม่ชัดเจนนัก แต่เมตาโบโลมมีความหลากหลายมากกว่า การกระจายตัวเฉพาะสายพันธุ์ของการตอบสนองทางเมตาบอลิซึมที่ถูกเหนี่ยวนำส่งผลให้เกิดความสัมพันธ์เชิงลบอย่างมีนัยสำคัญระหว่างความเชี่ยวชาญและความหลากหลายแกมมา (PCC = -0.46, P = 4.9×10-8) การเปลี่ยนแปลงระดับ JA ที่เกิดจาก OS มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับการเฉพาะทางเมตาโบโลม และมีความสัมพันธ์เชิงลบกับความหลากหลายแกมมาของเมตาโบลิกที่แสดงโดยแต่ละสายพันธุ์ (รูปที่ 5B และรูปที่ S9) เป็นที่น่าสังเกตว่าสายพันธุ์ที่เรียกกันทั่วไปว่า "สายพันธุ์ที่ตอบสนองต่อสัญญาณ" ในรูปที่ 5C เช่น Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute และ Nepenthes attenuated ทำให้เกิดสัญญาณที่สำคัญภายใน 30 นาที การระบาดของ JA และ JA-Ile ที่จำเพาะต่อ OS ในช่วงไม่นานมานี้ ในขณะที่แบคทีเรียอื่นๆ ที่เรียกว่า "ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ" เช่น Nepenthes mills, Nepenthes powdery และ N. obtusifolia แสดงเฉพาะการเหนี่ยวนำ JA-Ile Edge โดยไม่มีความจำเพาะต่อ OS (รูปที่ 5C) ในระดับเมตาโบลิก ดังที่กล่าวมาข้างต้น สำหรับ Nepenthes attenuated สารที่ตอบสนองต่อสัญญาณแสดงความจำเพาะต่อ OS และเพิ่ม δj อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ลด Hj ไม่พบผลการกระตุ้นเฉพาะ OS นี้ในสายพันธุ์ที่จัดอยู่ในกลุ่มสายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ (รูปที่ 5, D และ E) เมตาโบไลต์เฉพาะ OS มีการแบ่งปันกันบ่อยกว่าในสายพันธุ์ที่ตอบสนองต่อสัญญาณ และกลุ่มสัญญาณเหล่านี้จะรวมกลุ่มกับสายพันธุ์ที่มีการตอบสนองต่อสัญญาณที่อ่อนกว่า ในขณะที่สายพันธุ์ที่มีการตอบสนองต่อสัญญาณที่อ่อนกว่าจะแสดงความสัมพันธ์กันน้อยกว่า (รูปที่ S8) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่าการเหนี่ยวนำ JA เฉพาะ OS และการปรับโครงสร้างใหม่ของเมตาโบโลมปลายทางเฉพาะ OS นั้นเชื่อมโยงกันในระดับสายพันธุ์
ต่อไป เราใช้เพสต์ลาโนลินที่มีเมทิล JA (MeJA) ในการบำบัดพืชเพื่อตรวจสอบว่าโหมดการจับคู่เหล่านี้ถูกจำกัดโดยปริมาณของ JA ที่ได้รับจากภายนอก ซึ่งจะอยู่ในไซโตพลาสซึมของพืชหรือไม่ การสลายตัวอย่างรวดเร็วของ JA เกิดขึ้น เราพบแนวโน้มเดียวกันของการเปลี่ยนแปลงทีละน้อยจากสายพันธุ์ที่ตอบสนองต่อสัญญาณไปเป็นสายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ ซึ่งเกิดจากการได้รับ JA อย่างต่อเนื่อง (รูปที่ 5, D และ E) กล่าวโดยสรุป การบำบัดด้วย MeJA ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิซึมของไส้เดือนฝอยเชิงเส้น N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens และ N. mikimotoi อย่างมาก ส่งผลให้ δj เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญและ Hj ลดลง N. purpurea แสดงให้เห็นเพียงการเพิ่มขึ้นของ δj แต่ Hj ไม่เปลี่ยนแปลง N. obtusifolia ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าสะสม JA ในระดับต่ำมาก ก็ตอบสนองต่อการบำบัดด้วย MeJA ได้ไม่ดีในแง่ของการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิซึมเช่นกัน ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าการผลิต JA หรือการส่งสัญญาณถูกจำกัดทางสรีรวิทยาในสายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เราได้ศึกษาสายพันธุ์ทั้งสี่ (N. pallens, N. mills, N. pink และ N. microphylla) ที่ถูกกระตุ้นด้วย W + W, W + OSMs และ W + OSS1 Transcriptome (39) สอดคล้องกับรูปแบบของการปรับโครงสร้างเมตาโบโลม สายพันธุ์ต่างๆ แยกออกจากกันได้ดีในพื้นที่ทรานสคริปโตม โดยที่ N. attenuated แสดง RDPI ที่ถูกกระตุ้นด้วย OS สูงที่สุด ในขณะที่ N. gracilis มีค่าต่ำที่สุด (รูปที่ 6A) อย่างไรก็ตาม พบว่าความหลากหลายของทรานสคริปโตมที่ถูกกระตุ้นโดย N. oblonga ต่ำที่สุดในบรรดาสายพันธุ์ทั้งสี่ ซึ่งตรงกันข้ามกับความหลากหลายของเมตาโบโนมสูงสุดของ N. oblonga ที่เคยแสดงไว้ในเจ็ดสายพันธุ์ก่อนหน้านี้ การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าชุดของยีนที่เกี่ยวข้องกับสัญญาณป้องกันในระยะเริ่มต้น รวมถึงสัญญาณ JA อธิบายถึงความเฉพาะเจาะจงของการตอบสนองการป้องกันในระยะเริ่มต้นที่ถูกกระตุ้นโดยสารกระตุ้นที่เกี่ยวข้องกับสัตว์กินพืชในสายพันธุ์ Nicotiana (39) การเปรียบเทียบเส้นทางการส่งสัญญาณ JA ระหว่างสี่สายพันธุ์นี้เผยให้เห็นรูปแบบที่น่าสนใจ (รูปที่ 6B) ยีนส่วนใหญ่ในเส้นทางนี้ เช่น AOC, OPR3, ACX และ COI1 แสดงระดับการเหนี่ยวนำที่ค่อนข้างสูงในสี่สายพันธุ์นี้ อย่างไรก็ตาม ยีนสำคัญ JAR4 ซึ่งเปลี่ยน JA ให้เป็นรูปแบบที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพคือ JA-Ile ที่สะสมอยู่ในรูปของทรานสคริปต์ มีระดับการถอดรหัสต่ำมาก โดยเฉพาะใน N. mills, Nepenthes pieris และ N. microphylla นอกจากนี้ ยังไม่พบทรานสคริปต์ของยีน AOS ใน N. bifidum การเปลี่ยนแปลงในการแสดงออกของยีนเหล่านี้อาจเป็นสาเหตุของฟีโนไทป์สุดขั้วที่เกิดจากการผลิต JA ต่ำในสายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ และการเหนี่ยวนำของ N. gracilis
(A) การวิเคราะห์ทฤษฎีสารสนเทศของการปรับเปลี่ยนการตอบสนองการถอดรหัสในช่วงต้นของสายพันธุ์ยาสูบที่ใกล้เคียงกัน 4 สายพันธุ์ โดยเก็บตัวอย่าง 30 นาทีหลังจากการเหนี่ยวนำโดยสัตว์กินพืช ค่า RDPI คำนวณโดยการเปรียบเทียบใบที่ถูกเหนี่ยวนำโดย OS ของสัตว์กินพืชกับใบควบคุมที่ได้รับบาดแผล สีต่างๆ แสดงถึงสายพันธุ์ที่แตกต่างกัน และสัญลักษณ์แสดงถึงวิธีการรักษาที่แตกต่างกัน (B) การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนในเส้นทางการส่งสัญญาณ JA ใน 4 สายพันธุ์ เส้นทาง JA แบบง่ายแสดงอยู่ถัดจากแผนภาพกล่อง สีที่แตกต่างกันแสดงถึงวิธีการประมวลผลที่แตกต่างกัน เครื่องหมายดอกจันแสดงว่ามีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างการรักษา W + OS และการควบคุม W + W (สำหรับการทดสอบ t ของนักเรียนสำหรับความแตกต่างแบบจับคู่ *P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001) OPDA: กรด 12-oxophytodienoic; OPC-8: กรด 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenyl)-cyclopentane-1-octanoic
ในส่วนสุดท้าย เราได้ศึกษาว่าการปรับเปลี่ยนเมตาโบโลมของพืชชนิดต่างๆ ที่จำเพาะต่อชนิดของแมลงนั้นสามารถต้านทานต่อสัตว์กินพืชได้อย่างไร งานวิจัยก่อนหน้านี้เน้นที่สกุล Nicotiana ความต้านทานต่อ Ms และตัวอ่อนของพวกมันแตกต่างกันอย่างมาก (40) ในที่นี้ เราได้ศึกษาความเชื่อมโยงระหว่างแบบจำลองนี้กับความยืดหยุ่นของเมตาโบลิซึม โดยใช้ยาสูบสี่ชนิดข้างต้น และทดสอบความสัมพันธ์ระหว่างความหลากหลายและความเชี่ยวชาญของเมตาโบโลมที่เกิดจากสัตว์กินพืชและความต้านทานของพืชต่อ Ms และ Sl เราพบว่าความต้านทาน ความหลากหลาย และความเชี่ยวชาญต่อ Sl ที่เป็นสัตว์กินพืชทั่วไปนั้นมีความสัมพันธ์เชิงบวก ในขณะที่ความสัมพันธ์ระหว่างความต้านทานต่อตัวเมียที่เป็นสัตว์กินพืชเฉพาะทางและความเชี่ยวชาญนั้นอ่อนแอ และความสัมพันธ์กับความหลากหลายนั้นไม่มีนัยสำคัญ (รูปที่ S10) ในส่วนของความต้านทานต่อ S1 ทั้ง N. chinensis และ N. gracilis ที่อ่อนแอ ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่ามีทั้งระดับการส่งสัญญาณ JA และความยืดหยุ่นของเมตาโบโลม มีการตอบสนองต่อการเหนี่ยวนำของสัตว์กินพืชที่แตกต่างกันอย่างมาก และพวกมันยังแสดงความต้านทานสูงที่คล้ายคลึงกันอีกด้วย เพศ.
ในช่วงหกสิบปีที่ผ่านมา ทฤษฎีการป้องกันพืชได้ให้กรอบทฤษฎีซึ่งนักวิจัยได้คาดการณ์ถึงวิวัฒนาการและหน้าที่ของเมตาโบไลต์เฉพาะของพืชจำนวนมาก ทฤษฎีส่วนใหญ่เหล่านี้ไม่ได้ปฏิบัติตามขั้นตอนปกติของการอนุมานที่แข็งแกร่ง (41) พวกเขาเสนอการคาดการณ์ที่สำคัญ (3) ในระดับการวิเคราะห์เดียวกัน เมื่อการทดสอบการคาดการณ์ที่สำคัญทำให้สามารถวิเคราะห์ทฤษฎีเฉพาะได้ สิ่งนี้จะทำให้สาขานี้ก้าวหน้าไป ได้รับการสนับสนุน แต่ปฏิเสธทฤษฎีอื่น (42) ในทางกลับกัน ทฤษฎีใหม่ทำการคาดการณ์ในระดับการวิเคราะห์ที่แตกต่างกันและเพิ่มชั้นใหม่ของการพิจารณาเชิงพรรณนา (42) อย่างไรก็ตาม ทฤษฎีสองทฤษฎีที่เสนอในระดับการทำงาน MT และ OD สามารถอธิบายได้ง่ายว่าเป็นการคาดการณ์ที่สำคัญของการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิกเฉพาะที่เกิดจากสัตว์กินพืช: ทฤษฎี OD เชื่อว่าการเปลี่ยนแปลงใน “พื้นที่” เมตาโบลิกเฉพาะนั้นมีทิศทางสูง ทฤษฎี MT เชื่อว่าการเปลี่ยนแปลงเหล่านี้จะไม่มีทิศทางและตั้งอยู่แบบสุ่มในพื้นที่เมตาโบลิก และมีแนวโน้มที่จะมีเมตาโบไลต์ที่มีคุณค่าในการป้องกันสูง การตรวจสอบก่อนหน้านี้เกี่ยวกับการทำนาย OD และ MT ได้รับการทดสอบโดยใช้ชุดสารประกอบ “ป้องกัน” ที่กำหนดไว้ล่วงหน้าอย่างจำกัด การทดสอบที่เน้นเมตาโบไลต์เหล่านี้ขัดขวางความสามารถในการวิเคราะห์ขอบเขตและวิถีของการปรับโครงสร้างเมตาโบโลมใหม่ระหว่างการกินพืช และไม่อนุญาตให้ทดสอบภายในกรอบทางสถิติที่สอดคล้องกันเพื่อกำหนดการคาดการณ์ที่สำคัญที่สามารถพิจารณาได้โดยรวม การวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงในเมตาโบโลมของพืช ที่นี่ เราใช้เทคโนโลยีที่เป็นนวัตกรรมในเมตาโบโลมิกส์โดยอิงจาก MS เชิงคำนวณ และทำการวิเคราะห์ MS แบบดีคอนโวลูชันในสกุลเงินทั่วไปของตัวบ่งชี้ทฤษฎีสารสนเทศเพื่อทดสอบความแตกต่างระหว่างสองสิ่งที่เสนอในระดับเมตาโบโลมิกส์โดยรวม การคาดการณ์ที่สำคัญของทฤษฎีนี้ ทฤษฎีสารสนเทศถูกนำไปใช้ในหลายสาขา โดยเฉพาะอย่างยิ่งในบริบทของการวิจัยความหลากหลายทางชีวภาพและการไหลเวียนของสารอาหาร (43) อย่างไรก็ตาม เท่าที่เราทราบ นี่เป็นการประยุกต์ใช้ครั้งแรกที่ใช้เพื่ออธิบายพื้นที่ข้อมูลเมตาโบลิกของพืชและแก้ปัญหาทางนิเวศวิทยาที่เกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงเมตาโบลิกชั่วคราวเพื่อตอบสนองต่อสัญญาณสิ่งแวดล้อม โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ความสามารถของวิธีการนี้อยู่ที่ความสามารถในการเปรียบเทียบรูปแบบภายในและระหว่างสายพันธุ์พืช เพื่อตรวจสอบว่าสัตว์กินพืชมีการวิวัฒนาการอย่างไรจากสายพันธุ์ต่างๆ ไปจนถึงรูปแบบวิวัฒนาการระดับมหภาคระหว่างสายพันธุ์ในระดับวิวัฒนาการต่างๆ การเผาผลาญสารอาหาร
การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) แปลงชุดข้อมูลหลายตัวแปรให้เป็นพื้นที่ลดมิติเพื่อให้สามารถอธิบายแนวโน้มหลักของข้อมูลได้ ดังนั้นจึงมักใช้เป็นเทคนิคการสำรวจเพื่อวิเคราะห์ชุดข้อมูล เช่น การแยกเมตาโบไลต์ อย่างไรก็ตาม การลดมิติจะทำให้สูญเสียข้อมูลบางส่วนในชุดข้อมูล และ PCA ไม่สามารถให้ข้อมูลเชิงปริมาณเกี่ยวกับลักษณะที่เกี่ยวข้องกับทฤษฎีทางนิเวศวิทยาโดยเฉพาะ เช่น สัตว์กินพืชปรับเปลี่ยนความหลากหลายในด้านเฉพาะทาง (เช่น ความอุดมสมบูรณ์ การกระจายตัว และปริมาณ) ของเมตาโบไลต์ได้อย่างไร เมตาโบไลต์ใดเป็นตัวทำนายสถานะที่ถูกกระตุ้นของสัตว์กินพืชชนิดใดชนิดหนึ่ง จากมุมมองของความจำเพาะ ความหลากหลาย และความสามารถในการกระตุ้น ข้อมูลของโปรไฟล์เมตาโบไลต์เฉพาะใบจะถูกแยกส่วน และพบว่าการกินของสัตว์กินพืชสามารถกระตุ้นการเผาผลาญเฉพาะอย่างได้ โดยไม่คาดคิด เราพบว่า ตามที่อธิบายไว้ในตัวชี้วัดทฤษฎีสารสนเทศที่นำมาใช้ สถานการณ์การเผาผลาญที่เกิดขึ้นนั้นมีการทับซ้อนกันมากหลังจากการโจมตีของสัตว์กินพืชสองชนิด (Sl ที่หากินในเวลากลางคืนและกินพืชทั่วไป) และ Ms ที่เชี่ยวชาญด้านพืชวงศ์ Solanaceae แม้ว่าพฤติกรรมการกินและความเข้มข้นของพวกมันจะแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญก็ตาม ตัวเริ่มต้นของสารประกอบกรดไขมัน-กรดอะมิโน (FAC) ใน OS (31) โดยการใช้ OS ของสัตว์กินพืชในการรักษาบาดแผลเจาะมาตรฐาน การจำลองการรักษาสัตว์กินพืชยังแสดงแนวโน้มที่คล้ายกัน ขั้นตอนมาตรฐานนี้สำหรับการจำลองการตอบสนองของพืชต่อการโจมตีของสัตว์กินพืชช่วยขจัดปัจจัยรบกวนที่เกิดจากการเปลี่ยนแปลงในพฤติกรรมการกินของสัตว์กินพืช ซึ่งนำไปสู่ระดับความเสียหายที่แตกต่างกันในเวลาที่ต่างกัน (34) FAC ซึ่งเป็นที่ทราบกันว่าเป็นสาเหตุหลักของ OSM ลดการตอบสนองของ JAS และฮอร์โมนพืชอื่น ๆ ใน OSS1 ในขณะที่ OSS1 ลดลงหลายร้อยเท่า (31) อย่างไรก็ตาม OSS1 ทำให้เกิดการสะสมของ JA ในระดับที่คล้ายคลึงกันเมื่อเทียบกับ OSM ก่อนหน้านี้ได้มีการแสดงให้เห็นแล้วว่าการตอบสนองของ JA ใน Nepenthes ที่อ่อนแอนั้นมีความไวต่อ OSM มาก โดยที่ FAC สามารถคงกิจกรรมไว้ได้แม้ว่าจะเจือจางด้วยน้ำในอัตราส่วน 1:1000 ก็ตาม (44) ดังนั้น เมื่อเปรียบเทียบกับ OSM แม้ว่า FAC ใน OSS1 จะมีปริมาณต่ำมาก แต่ก็เพียงพอที่จะกระตุ้นให้เกิดการระบาดของ JA ได้อย่างเพียงพอ การศึกษาก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นว่าโปรตีนคล้ายพอริน (45) และโอลิโกแซ็กคาไรด์ (46) สามารถใช้เป็นเบาะแสระดับโมเลกุลเพื่อกระตุ้นการตอบสนองการป้องกันของพืชใน OSS1 อย่างไรก็ตาม ยังไม่ชัดเจนว่าสารกระตุ้นเหล่านี้ใน OSS1 เป็นสาเหตุของการสะสมของ JA ที่สังเกตได้ในการศึกษาปัจจุบันหรือไม่
แม้ว่าจะมีงานวิจัยเพียงไม่กี่ชิ้นที่อธิบายถึงลายนิ้วมือเมตาบอลิซึมที่แตกต่างกันซึ่งเกิดจากการใช้สัตว์กินพืชชนิดต่างๆ หรือ JA หรือ SA (กรดซาลิไซลิก) จากภายนอก (47) แต่ก็ไม่มีใครศึกษาถึงการเปลี่ยนแปลงเฉพาะชนิดของสัตว์กินพืชในเครือข่ายหญ้าและผลกระทบต่อข้อมูลส่วนบุคคลที่เฉพาะเจาะจง ผลกระทบโดยรวมของการเผาผลาญได้รับการศึกษาอย่างเป็นระบบ การวิเคราะห์นี้ยังยืนยันเพิ่มเติมว่าการเชื่อมต่อเครือข่ายฮอร์โมนภายในกับฮอร์โมนพืชอื่นๆ นอกเหนือจาก JA มีส่วนกำหนดความเฉพาะเจาะจงของการจัดระเบียบเมตาบอลิซึมใหม่ที่เกิดจากสัตว์กินพืช โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เราตรวจพบว่า ET ที่เกิดจาก OSM มีค่ามากกว่า ET ที่เกิดจาก OSS1 อย่างมีนัยสำคัญ รูปแบบนี้สอดคล้องกับปริมาณ FAC ที่มากกว่าใน OSM ซึ่งเป็นเงื่อนไขที่จำเป็นและเพียงพอสำหรับการกระตุ้นการระเบิดของ ET (48) ในบริบทของการปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและสัตว์กินพืช หน้าที่การส่งสัญญาณของ ET ต่อพลวัตของเมตาบอไลต์เฉพาะของพืชยังคงกระจัดกระจายและมุ่งเป้าไปที่กลุ่มสารประกอบเพียงกลุ่มเดียวเท่านั้น นอกจากนี้ การศึกษาส่วนใหญ่ใช้การประยุกต์ใช้ ET จากภายนอกหรือสารตั้งต้นหรือสารยับยั้งต่างๆ เพื่อศึกษาการควบคุม ET ซึ่งการประยุกต์ใช้ทางเคมีจากภายนอกเหล่านี้จะก่อให้เกิดผลข้างเคียงที่ไม่เฉพาะเจาะจงมากมาย เท่าที่เราทราบ การศึกษานี้เป็นการตรวจสอบอย่างเป็นระบบขนาดใหญ่ครั้งแรกเกี่ยวกับบทบาทของ ET ในการใช้ ET เพื่อผลิตและรับรู้พืชดัดแปลงพันธุกรรมที่บกพร่องเพื่อประสานพลวัตของเมตาโบโลมของพืช การเหนี่ยวนำ ET ที่จำเพาะต่อสัตว์กินพืชสามารถปรับการตอบสนองของเมตาโบโลมได้ในที่สุด สิ่งที่สำคัญที่สุดคือการจัดการยีนการสังเคราะห์ ET (ACO) และการรับรู้ (ETR1) ทางพันธุกรรมที่เผยให้เห็นการสะสมฟีนอลาไมด์แบบ de novo ที่จำเพาะต่อสัตว์กินพืช ก่อนหน้านี้มีการแสดงให้เห็นแล้วว่า ET สามารถปรับแต่งการสะสมนิโคตินที่เหนี่ยวนำโดย JA โดยการควบคุมพิวเทรสซีน N-เมทิลทรานสเฟอเรส (49) อย่างไรก็ตาม จากมุมมองทางกลไก ยังไม่ชัดเจนว่า ET ปรับแต่งการเหนี่ยวนำของฟีนอลาไมด์อย่างไร นอกเหนือจากหน้าที่การส่งสัญญาณของ ET แล้ว กระแสการเผาผลาญยังสามารถถูกเปลี่ยนเส้นทางไปยัง S-adenosyl-1-methionine เพื่อควบคุมการลงทุนในโพลีอะมิโนฟีนอลอะไมด์ได้อีกด้วย S-adenosyl-1-methionine เป็น ET และเป็นสารตัวกลางทั่วไปในวิถีการสังเคราะห์โพลีอะมีน กลไกที่สัญญาณ ET ควบคุมระดับของฟีนอลอะไมด์นั้นจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม
เป็นเวลานานแล้วที่เนื่องจากมีเมตาโบไลต์พิเศษจำนวนมากที่มีโครงสร้างไม่เป็นที่รู้จัก การให้ความสนใจอย่างเข้มข้นกับหมวดหมู่เมตาโบลิกเฉพาะจึงไม่สามารถประเมินการเปลี่ยนแปลงของความหลากหลายทางเมตาโบลิกตามเวลาหลังจากการปฏิสัมพันธ์ทางชีวภาพได้อย่างแม่นยำ ในปัจจุบัน จากการวิเคราะห์ตามทฤษฎีสารสนเทศ ผลลัพธ์หลักของการได้มาซึ่งสเปกตรัม MS/MS โดยอิงจากเมตาโบไลต์ที่ไม่ลำเอียงคือ สัตว์กินพืชที่กินหรือจำลองพฤติกรรมของสัตว์กินพืชยังคงลดความหลากหลายทางเมตาโบลิกโดยรวมของเมตาโบโลมในใบลง ในขณะที่เพิ่มระดับความเชี่ยวชาญเฉพาะด้าน การเพิ่มขึ้นชั่วคราวของความเฉพาะเจาะจงของเมตาโบโลมที่เกิดจากสัตว์กินพืชนี้เกี่ยวข้องกับการเพิ่มขึ้นแบบเสริมฤทธิ์กันของความเฉพาะเจาะจงของทรานสคริปโตม คุณลักษณะที่ส่งผลต่อความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของเมตาโบโลมที่มากขึ้นนี้มากที่สุด (มีค่า Si สูงกว่า) คือเมตาโบไลต์พิเศษที่มีหน้าที่การกินพืชที่ได้รับการระบุไว้ก่อนหน้านี้ แบบจำลองนี้สอดคล้องกับการทำนายของทฤษฎี OD แต่การทำนายของ MT ที่เกี่ยวข้องกับความสุ่มของการปรับเปลี่ยนเมตาโบโลมนั้นไม่สอดคล้องกัน อย่างไรก็ตาม ข้อมูลนี้ยังสอดคล้องกับการคาดการณ์ของแบบจำลองผสม (MT ที่ดีที่สุด; รูปที่ 1B) เนื่องจากเมตาโบไลต์อื่นๆ ที่ยังไม่ได้รับการระบุลักษณะและมีหน้าที่ป้องกันที่ไม่ทราบแน่ชัด อาจยังคงมีการกระจายตัวของ Si แบบสุ่มอยู่
รูปแบบที่น่าสนใจที่งานวิจัยนี้บันทึกไว้เพิ่มเติมคือ ตั้งแต่ระดับวิวัฒนาการระดับจุลภาค (พืชเดี่ยวและประชากรยาสูบ) ไปจนถึงระดับวิวัฒนาการที่ใหญ่ขึ้น (สายพันธุ์ยาสูบที่ใกล้เคียงกัน) ระดับการจัดระเบียบวิวัฒนาการที่แตกต่างกันนั้นอยู่ใน “การป้องกันที่ดีที่สุด” มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความสามารถของสัตว์กินพืช Moore et al. (20) และ Kessler และ Kalske (1) เสนอให้แปลงระดับการทำงานสามระดับของความหลากหลายทางชีวภาพที่ Whittaker (50) แยกแยะไว้แต่เดิม ให้เป็นการเปลี่ยนแปลงตามเวลาของความหลากหลายทางเคมีที่เกิดขึ้นเองและที่ถูกกระตุ้น ผู้เขียนเหล่านี้ไม่ได้สรุปขั้นตอนการรวบรวมข้อมูลเมตาโบโลมขนาดใหญ่ และไม่ได้ระบุวิธีการคำนวณความหลากหลายทางเมตาโบลิกจากข้อมูลเหล่านี้ ในการศึกษาครั้งนี้ การปรับเปลี่ยนเล็กน้อยในการจำแนกประเภทการทำงานของ Whittaker จะพิจารณาความหลากหลายทางเมตาโบลิก α เป็นความหลากหลายของสเปกตรัม MS/MS ในพืชที่กำหนด ความหลากหลายทางเมตาโบลิก β เป็นเมตาโบลิซึมพื้นฐานภายในสายพันธุ์ของกลุ่มประชากร และความหลากหลายทางเมตาโบลิก γ จะเป็นการขยายการวิเคราะห์สายพันธุ์ที่คล้ายคลึงกัน
สัญญาณ JA มีความสำคัญต่อการตอบสนองทางเมตาบอลิซึมของสัตว์กินพืชหลากหลายชนิด อย่างไรก็ตาม ยังขาดการทดสอบเชิงปริมาณที่เข้มงวดเกี่ยวกับบทบาทของการควบคุมการสังเคราะห์ JA ภายในสายพันธุ์เดียวกันต่อความหลากหลายของเมตาโบโลม และยังไม่ชัดเจนว่าสัญญาณ JA เป็นจุดทั่วไปสำหรับการกระจายตัวทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากความเครียดในระดับวิวัฒนาการมหภาคที่สูงขึ้นหรือไม่ เราพบว่าลักษณะการกินพืชของ Nepenthes herbivorous กระตุ้นให้เกิดความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของเมตาโบโลม และความแปรผันของความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของเมตาโบโลมภายในประชากรของสายพันธุ์ Nicotiana และระหว่างสายพันธุ์ Nicotiana ที่ใกล้เคียงกันนั้นมีความสัมพันธ์เชิงบวกอย่างเป็นระบบกับสัญญาณ JA นอกจากนี้ เมื่อสัญญาณ JA บกพร่อง ความเฉพาะเจาะจงทางเมตาบอลิซึมที่เกิดจากสัตว์กินพืชที่มีจีโนไทป์เดียวจะถูกยกเลิก (รูปที่ 3, C และ E) เนื่องจากการเปลี่ยนแปลงสเปกตรัมเมตาบอลิซึมของประชากร Nepenthes ที่อ่อนแอตามธรรมชาติส่วนใหญ่เป็นการเปลี่ยนแปลงเชิงปริมาณ การเปลี่ยนแปลงในความหลากหลายและความจำเพาะของเมตาบอลิซึม β ในการวิเคราะห์นี้จึงอาจเกิดจากการกระตุ้นอย่างรุนแรงของกลุ่มสารประกอบที่มีเมตาบอไลต์สูงเป็นส่วนใหญ่ กลุ่มสารประกอบเหล่านี้มีบทบาทสำคัญในโปรไฟล์เมตาโบโลมและนำไปสู่ความสัมพันธ์เชิงบวกกับสัญญาณ JA
เนื่องจากกลไกทางชีวเคมีของยาสูบสายพันธุ์ที่ใกล้เคียงกันนั้นแตกต่างกันมาก จึงมีการระบุเมตาโบไลต์อย่างเฉพาะเจาะจงในเชิงคุณภาพ ซึ่งทำให้การวิเคราะห์มีความแม่นยำมากขึ้น การประมวลผลข้อมูลโปรไฟล์เมตาโบลิกที่ได้มาโดยใช้ทฤษฎีสารสนเทศเผยให้เห็นว่า การเหนี่ยวนำโดยสัตว์กินพืชทำให้ความสมดุลระหว่างความหลากหลายแกมมาของเมตาโบลิกและความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านรุนแรงขึ้น สัญญาณ JA มีบทบาทสำคัญในความสมดุลนี้ การเพิ่มขึ้นของความเชี่ยวชาญเฉพาะด้านของเมตาโบโลมสอดคล้องกับการทำนาย OD หลักและมีความสัมพันธ์เชิงบวกกับสัญญาณ JA ในขณะที่สัญญาณ JA มีความสัมพันธ์เชิงลบกับความหลากหลายแกมมาของเมตาโบลิก แบบจำลองเหล่านี้บ่งชี้ว่าความสามารถในการสร้างความหลากหลาย (OD) ของพืชส่วนใหญ่ถูกกำหนดโดยความยืดหยุ่นของ JA ไม่ว่าจะเป็นในระดับวิวัฒนาการจุลภาคหรือในระดับวิวัฒนาการที่ใหญ่กว่า การทดลองประยุกต์ใช้ JA จากภายนอกที่หลีกเลี่ยงข้อบกพร่องในการสังเคราะห์ JA เผยให้เห็นเพิ่มเติมว่าสายพันธุ์ยาสูบที่ใกล้เคียงกันสามารถแยกแยะได้เป็นสายพันธุ์ที่ตอบสนองต่อสัญญาณและสายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณ เช่นเดียวกับรูปแบบความยืดหยุ่นของ JA และเมตาโบลิซึมที่เกิดจากการกินของสัตว์กินพืช สายพันธุ์ที่ไม่ตอบสนองต่อสัญญาณไม่สามารถตอบสนองได้เนื่องจากไม่สามารถผลิต JA ภายในร่างกายได้ จึงอยู่ภายใต้ข้อจำกัดทางสรีรวิทยา ซึ่งอาจเกิดจากการกลายพันธุ์ในยีนสำคัญบางตัวในเส้นทางการส่งสัญญาณ JA (AOS และ JAR4 ใน N. crescens) ผลลัพธ์นี้เน้นย้ำว่ารูปแบบวิวัฒนาการระดับมหภาคระหว่างสายพันธุ์เหล่านี้อาจถูกขับเคลื่อนเป็นหลักโดยการเปลี่ยนแปลงในการรับรู้และการตอบสนองต่อฮอร์โมนภายใน
นอกเหนือจากปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชและสัตว์กินพืชแล้ว การสำรวจความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมยังเกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าทางทฤษฎีที่สำคัญทั้งหมดในการวิจัยเกี่ยวกับการปรับตัวทางชีวภาพต่อสิ่งแวดล้อมและวิวัฒนาการของลักษณะฟีโนไทป์ที่ซับซ้อน ด้วยปริมาณข้อมูลที่เพิ่มขึ้นจากเครื่องมือ MS ที่ทันสมัย ​​การทดสอบสมมติฐานเกี่ยวกับความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมจึงสามารถก้าวข้ามความแตกต่างของเมตาบอไลต์แต่ละชนิด/หมวดหมู่ และทำการวิเคราะห์ในระดับโลกเพื่อเปิดเผยรูปแบบที่ไม่คาดคิด ในกระบวนการวิเคราะห์ขนาดใหญ่ อุปมาอุปไมยที่สำคัญคือแนวคิดของการสร้างแผนที่ที่มีความหมายซึ่งสามารถใช้ในการสำรวจข้อมูลได้ ดังนั้น ผลลัพธ์ที่สำคัญของการผสมผสานระหว่างเมตาโบโลมิกส์ MS/MS ที่ไม่ลำเอียงและทฤษฎีสารสนเทศในปัจจุบัน คือการให้เมตริกที่เรียบง่ายซึ่งสามารถใช้สร้างแผนที่เพื่อสำรวจความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมในระดับอนุกรมวิธานที่แตกต่างกัน นี่คือข้อกำหนดพื้นฐานของวิธีการนี้ การศึกษาเกี่ยวกับวิวัฒนาการระดับจุลภาค/มหภาค และนิเวศวิทยาของชุมชน
ในระดับวิวัฒนาการมหภาค แก่นของทฤษฎีวิวัฒนาการร่วมระหว่างพืชและแมลงของ Ehrlich และ Raven (51) คือการทำนายว่าความแปรผันของความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมระหว่างสายพันธุ์เป็นสาเหตุของการกระจายตัวของสายพันธุ์พืช อย่างไรก็ตาม ในช่วงห้าสิบปีนับตั้งแต่การตีพิมพ์ผลงานสำคัญนี้ สมมติฐานนี้ได้รับการทดสอบน้อยมาก (52) ซึ่งส่วนใหญ่เป็นผลมาจากลักษณะทางวิวัฒนาการของลักษณะทางเมตาบอลิซึมที่เทียบเคียงกันได้ในสายพันธุ์พืชที่อยู่ห่างไกลกัน ความหายากนี้สามารถใช้เป็นจุดยึดสำหรับวิธีการวิเคราะห์เป้าหมายได้ เวิร์กโฟลว์ MS/MS ในปัจจุบันที่ประมวลผลโดยทฤษฎีสารสนเทศจะวัดปริมาณความคล้ายคลึงกันของโครงสร้าง MS/MS ของเมตาบอไลต์ที่ไม่รู้จัก (โดยไม่ต้องเลือกเมตาบอไลต์ก่อน) และแปลง MS/MS เหล่านี้ให้เป็นชุดของ MS/MS ดังนั้นในเมตาบอลิซึมระดับมืออาชีพ โมเดลวิวัฒนาการมหภาคเหล่านี้จึงถูกเปรียบเทียบในระดับการจำแนกประเภท ตัวบ่งชี้ทางสถิติอย่างง่าย กระบวนการนี้คล้ายกับการวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการ ซึ่งสามารถใช้การจัดเรียงลำดับเพื่อหาปริมาณอัตราการกระจายตัวหรือวิวัฒนาการของลักษณะโดยไม่ต้องคาดการณ์ล่วงหน้า
ในระดับชีวเคมี สมมติฐานการคัดกรองของ Firn และ Jones (53) แสดงให้เห็นว่าความหลากหลายทางเมตาบอลิซึมได้รับการรักษาไว้ในระดับต่างๆ เพื่อจัดหาวัตถุดิบในการแสดงกิจกรรมทางชีวภาพของเมตาบอไลต์ที่ไม่เกี่ยวข้องหรือถูกแทนที่ก่อนหน้านี้ วิธีการทฤษฎีสารสนเทศให้กรอบการทำงานที่สามารถวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงวิวัฒนาการเฉพาะเมตาบอไลต์เหล่านี้ที่เกิดขึ้นระหว่างความเชี่ยวชาญของเมตาบอไลต์ได้ ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการคัดกรองวิวัฒนาการที่เสนอ: การปรับตัวที่ออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากความจำเพาะต่ำไปสู่ความจำเพาะสูง เมตาบอไลต์ที่ถูกยับยั้งของสภาพแวดล้อมที่กำหนด
โดยสรุปแล้ว ในช่วงแรกๆ ของชีววิทยาโมเลกุล ทฤษฎีการป้องกันพืชที่สำคัญได้รับการพัฒนาขึ้น และวิธีการแบบนิรนัยที่ขับเคลื่อนด้วยสมมติฐานนั้นถือกันอย่างกว้างขวางว่าเป็นหนทางเดียวของความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ ส่วนใหญ่เป็นเพราะข้อจำกัดทางเทคนิคในการวัดเมตาโบโลมทั้งหมด แม้ว่าวิธีการที่ขับเคลื่อนด้วยสมมติฐานจะมีประโยชน์อย่างยิ่งในการเลือกกลไกเชิงสาเหตุอื่นๆ แต่ความสามารถในการพัฒนาความเข้าใจของเราเกี่ยวกับเครือข่ายชีวเคมีนั้นมีจำกัดมากกว่าวิธีการคำนวณที่มีอยู่ในปัจจุบันในวิทยาศาสตร์ที่เน้นข้อมูลจำนวนมาก ดังนั้น ทฤษฎีที่ไม่สามารถคาดการณ์ได้จึงอยู่นอกเหนือขอบเขตของข้อมูลที่มีอยู่ ดังนั้นวงจรสูตรสมมติฐาน/การทดสอบความก้าวหน้าในสาขาการวิจัยจึงไม่สามารถถูกยกเลิกได้ (4) เราคาดการณ์ว่าเวิร์กโฟลว์การคำนวณของเมตาโบโลมิกส์ที่นำเสนอในที่นี้สามารถจุดประกายความสนใจในประเด็นล่าสุด (อย่างไร) และประเด็นสุดท้าย (ทำไม) ของความหลากหลายทางเมตาโบลิก และมีส่วนช่วยในยุคใหม่ของวิทยาศาสตร์ข้อมูลที่ชี้นำด้วยทฤษฎี ยุคนี้จะทบทวนทฤษฎีที่สำคัญที่สร้างแรงบันดาลใจให้กับคนรุ่นก่อนๆ
การดูดกินโดยตรงของแมลงกินพืชทำได้โดยการเลี้ยงตัวอ่อนระยะที่สองหรือตัวอ่อน Sl บนใบหม้อข้าวหม้อแกงลิงสีอ่อนเพียงใบเดียวของต้นกุหลาบที่กำลังออกดอก โดยทำซ้ำ 10 ต้นต่อต้น ตัวอ่อนแมลงจะถูกหนีบด้วยที่หนีบ และเนื้อเยื่อใบที่เหลืออยู่จะถูกเก็บรวบรวม 24 และ 72 ชั่วโมงหลังการติดเชื้อ จากนั้นนำไปแช่แข็งอย่างรวดเร็วและสกัดสารเมตาบอไลต์ออกมา
จำลองการบำบัดโดยสัตว์กินพืชในลักษณะที่ประสานกันอย่างมาก วิธีการคือใช้ล้อลายผ้าเจาะหนามสามแถวที่แต่ละด้านของเส้นกลางใบของใบที่เจริญเต็มที่สามใบของพืชในช่วงระยะการเจริญเติบโตของพวงมาลัยผ้า และใช้ Ms ที่เจือจาง 1:5 ทันที หรือใช้นิ้วที่สวมถุงมือสอด S1 OS เข้าไปในแผลที่เจาะ เก็บเกี่ยวและแปรรูปใบตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้เพื่อสกัดเมตาโบไลต์หลักและฮอร์โมนพืช (54)
สำหรับการใช้ JA จากภายนอก จะทำการบำบัดใบสามใบจากก้านใบของต้นกุหลาบที่กำลังออกดอกจำนวนหกต้นของแต่ละสายพันธุ์ โดยใช้สารละลายลาโนลิน 20 ไมโครลิตรที่มี MeJA 150 ไมโครกรัม (Lan + MeJA) และลาโนลิน 20 ไมโครลิตรพร้อมการบำบัดบาดแผล (Lan + W) หรือใช้ลาโนลินบริสุทธิ์ 20 ไมโครลิตรเป็นกลุ่มควบคุม เก็บเกี่ยวใบหลังจากบำบัด 72 ชั่วโมง แช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว และเก็บรักษาไว้ที่ -80°C จนกว่าจะใช้งาน
กลุ่มวิจัยของเราได้ระบุสายพันธุ์ทรานส์เจนิก JA และ ET จำนวน 4 สายพันธุ์ ได้แก่ irAOC (36), irCOI1 (55), irACO และ sETR1 (48) irAOC แสดงให้เห็นการลดลงของระดับ JA และ JA-Ile อย่างชัดเจน ในขณะที่ irCOI1 ไม่ไวต่อ JA เมื่อเปรียบเทียบกับ EV การสะสมของ JA-Ile เพิ่มขึ้น ในทำนองเดียวกัน irACO จะลดการผลิต ET และเมื่อเปรียบเทียบกับ EV แล้ว sETR1 ซึ่งไม่ไวต่อ ET จะเพิ่มการผลิต ET
ใช้เครื่องวัดการระเหยน้ำด้วยเลเซอร์แบบโฟโตอะคูสติก (เซ็นเซอร์วัดการระเหยน้ำแบบเรียลไทม์ Sensor Sense ETD-300) ในการวัดการระเหยน้ำแบบไม่รุกราน หลังจากทำการรักษาแล้ว ใบไม้ครึ่งหนึ่งจะถูกตัดและย้ายไปยังขวดแก้วปิดผนึกขนาด 4 มล. และปล่อยให้ปริมาตรของสารละลายสะสมตัวเป็นเวลา 5 ชั่วโมง ในระหว่างการวัด ขวดแต่ละขวดจะถูกล้างด้วยกระแสอากาศบริสุทธิ์ 2 ลิตร/ชั่วโมง เป็นเวลา 8 นาที ซึ่งก่อนหน้านี้ได้ผ่านตัวเร่งปฏิกิริยาที่จัดหาโดย Sensor Sense เพื่อกำจัด CO2 และน้ำออกไปแล้ว
ข้อมูลไมโครอาร์เรย์ได้รับการเผยแพร่ครั้งแรกใน (35) และบันทึกไว้ในฐานข้อมูลการแสดงออกของยีนที่ครอบคลุมของศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ (NCBI) (หมายเลขการเข้าถึง GSE30287) ข้อมูลที่สอดคล้องกับใบที่ได้รับการรักษาด้วย W + OSMs และกลุ่มควบคุมที่ไม่ได้รับความเสียหายถูกดึงออกมาสำหรับการศึกษาครั้งนี้ ความเข้มดิบคือ log2 ก่อนการวิเคราะห์ทางสถิติ ค่าพื้นฐานถูกแปลงและทำให้เป็นมาตรฐานที่เปอร์เซ็นไทล์ที่ 75 โดยใช้แพ็คเกจซอฟต์แวร์ R
ข้อมูลลำดับ RNA ดั้งเดิม (RNA-seq) ของสายพันธุ์ Nicotiana ได้รับการดึงมาจาก NCBI Short Reading Archives (SRA) หมายเลขโครงการคือ PRJNA301787 ซึ่งรายงานโดย Zhou et al. (39) และดำเนินการตามที่อธิบายไว้ใน (56) ข้อมูลดิบที่ประมวลผลโดย W + W, W + OSM และ W + OSS1 ที่สอดคล้องกับสายพันธุ์ Nicotiana ได้รับเลือกสำหรับการวิเคราะห์ในการศึกษานี้ และประมวลผลในลักษณะต่อไปนี้: ขั้นแรก ข้อมูลการอ่าน RNA-seq ดิบจะถูกแปลงเป็นรูปแบบ FASTQ HISAT2 แปลง FASTQ เป็น SAM และ SAMtools แปลงไฟล์ SAM เป็นไฟล์ BAM ที่เรียงลำดับ StringTie ใช้ในการคำนวณการแสดงออกของยีน โดยวิธีการแสดงออกคือมีชิ้นส่วนต่อพันเบสต่อล้านชิ้นส่วนการถอดรหัสที่เรียงลำดับ
คอลัมน์โครมาโทกราฟี Acclaim (150 มม. x 2.1 มม.; ขนาดอนุภาค 2.2 μm) ที่ใช้ในการวิเคราะห์ และคอลัมน์ป้องกันขนาด 4 มม. x 4 มม. ประกอบด้วยวัสดุชนิดเดียวกัน ระบบโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษ (UHPLC) Dionex UltiMate 3000 ใช้การไล่ระดับแบบไบนารีดังต่อไปนี้: 0 ถึง 0.5 นาที, แบบไอโซแครติก 90% A [น้ำปราศจากไอออน, อะซีโตไนไตรล์ 0.1% (v/v) และกรดฟอร์มิก 0.05%], 10% B (อะซีโตไนไตรล์และกรดฟอร์มิก 0.05%); 0.5 ถึง 23.5 นาที, เฟสการไล่ระดับคือ 10% A และ 90% B ตามลำดับ; 23.5 ถึง 25 นาที, แบบไอโซแครติก 10% A และ 90% B อัตราการไหลคือ 400 μl/นาที สำหรับการวิเคราะห์ MS ทั้งหมด ให้ฉีดสารละลายจากคอลัมน์เข้าไปในเครื่องวิเคราะห์ควอดรูโพลและไทม์ออฟไฟลต์ (qTOF) ที่ติดตั้งแหล่งกำเนิดอิเล็กโทรสเปรย์ซึ่งทำงานในโหมดไอออนไนเซชันบวก (แรงดันแคปิลลารี 4500 V; ทางออกแคปิลลารี 130 V; อุณหภูมิการอบแห้ง 200°C; อัตราการไหลของอากาศอบแห้ง 10 ลิตร/นาที)
ทำการวิเคราะห์การแตกตัวของ MS/MS (ต่อไปนี้เรียกว่า MS/MS) ซึ่งไม่เกี่ยวข้องหรือไม่สามารถแยกแยะได้จากข้อมูล เพื่อให้ได้ข้อมูลโครงสร้างเกี่ยวกับโปรไฟล์เมตาบอลิกที่ตรวจจับได้โดยรวม แนวคิดของวิธีการ MS/MS แบบไม่จำแนกนั้นอาศัยข้อเท็จจริงที่ว่าควอดรูโพลมีหน้าต่างการแยกมวลที่กว้างมาก [ดังนั้น ให้พิจารณาสัญญาณอัตราส่วนมวลต่อประจุ (m/z) ทั้งหมดเป็นชิ้นส่วน] ด้วยเหตุนี้ เนื่องจากเครื่องมือ Impact II ไม่สามารถสร้างการเอียง CE ได้ จึงได้ทำการวิเคราะห์อิสระหลายครั้งโดยใช้ค่าพลังงานการชนที่เหนี่ยวนำให้เกิดการแตกตัว (CE) ที่เพิ่มขึ้น กล่าวโดยสรุปคือ ขั้นแรกให้วิเคราะห์ตัวอย่างด้วย UHPLC-electrospray ionization/qTOF-MS โดยใช้โหมดสเปกโทรเมตรีมวลเดี่ยว (สภาวะการแตกตัวต่ำที่สร้างขึ้นโดยการแตกตัวในแหล่งกำเนิด) สแกนจาก m/z 50 ถึง 1500 ที่ความถี่การทำซ้ำ 5 Hz ใช้ไนโตรเจนเป็นก๊าซชนสำหรับการวิเคราะห์ MS/MS และทำการวัดอิสระที่แรงดันการแตกตัวที่เกิดจากการชนสี่ค่าที่แตกต่างกันดังต่อไปนี้: 20, 30, 40 และ 50 eV ตลอดกระบวนการวัด ควอดรูโพลจะมีช่วงการแยกมวลที่ใหญ่ที่สุด ตั้งแต่ m/z 50 ถึง 1500 เมื่อตั้งค่าการทดลอง m/z และความกว้างการแยกของตัวด้านหน้าเป็น 200 ช่วงมวลจะถูกเปิดใช้งานโดยอัตโนมัติโดยซอฟต์แวร์การทำงานของเครื่องมือและ 0 Da สแกนหาชิ้นส่วนมวลเช่นเดียวกับในโหมดมวลเดี่ยว ใช้โซเดียมฟอร์เมต (ไอโซโพรพานอล 50 มล., กรดฟอร์มิก 200 ไมโครลิตร และสารละลาย NaOH 1M 1 มล.) สำหรับการสอบเทียบมวล โดยใช้อัลกอริทึมการสอบเทียบความแม่นยำสูงของ Bruker ไฟล์ข้อมูลจะได้รับการสอบเทียบหลังจากเรียกใช้สเปกตรัมเฉลี่ยในช่วงเวลาที่กำหนด ใช้ฟังก์ชันการส่งออกของซอฟต์แวร์ Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Germany) เพื่อแปลงไฟล์ข้อมูลดิบเป็นรูปแบบ NetCDF ชุดข้อมูล MS/MS ได้ถูกบันทึกไว้ในฐานข้อมูลเมตาโบลิกส์แบบเปิด MetaboLights (www.ebi.ac.uk) โดยมีหมายเลขการเข้าถึง MTBLS1471
การประกอบ MS/MS สามารถทำได้โดยการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ระหว่างสัญญาณคุณภาพ MS1 และ MS/MS สำหรับพลังงานการชนต่ำและสูง และกฎที่เพิ่งนำมาใช้ใหม่ สคริปต์ R ถูกใช้เพื่อทำการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ของการกระจายตัวของสารตั้งต้นไปยังผลิตภัณฑ์ และสคริปต์ C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) ถูกใช้เพื่อนำกฎเหล่านั้นมาใช้
เพื่อลดข้อผิดพลาดแบบผลบวกเท็จที่เกิดจากสัญญาณรบกวนพื้นหลังและความสัมพันธ์เท็จที่เกิดจากการตรวจจับคุณลักษณะ m/z บางอย่างในตัวอย่างเพียงไม่กี่ตัวอย่าง เราจึงใช้ฟังก์ชัน “filled peak” ของแพ็กเกจ XCMS ใน R (สำหรับการแก้ไขสัญญาณรบกวนพื้นหลัง) เพื่อแทนที่ค่าความเข้ม “NA” (undetected peak) เมื่อใช้ฟังก์ชัน fill peak แล้ว ยังคงมีค่าความเข้ม “0” จำนวนมากในชุดข้อมูล ซึ่งจะส่งผลต่อการคำนวณความสัมพันธ์ ดังนั้น เราจึงเปรียบเทียบผลลัพธ์การประมวลผลข้อมูลที่ได้เมื่อใช้ฟังก์ชัน fill peak และเมื่อไม่ได้ใช้ฟังก์ชัน fill peak และคำนวณค่าสัญญาณรบกวนพื้นหลังโดยอิงจากค่าเฉลี่ยที่แก้ไขแล้ว และแทนที่ค่าความเข้ม 0 เหล่านี้ด้วยค่าพื้นหลังที่คำนวณได้ นอกจากนี้ เรายังพิจารณาเฉพาะคุณลักษณะที่มีความเข้มมากกว่าสามเท่าของค่าพื้นหลังและถือว่าเป็น “true peaks” สำหรับการคำนวณ PCC จะพิจารณาเฉพาะสัญญาณ m/z ของสารตั้งต้นตัวอย่าง (MS1) และชุดข้อมูลชิ้นส่วนที่มี true peaks อย่างน้อยแปดจุดเท่านั้น
หากความเข้มของคุณลักษณะคุณภาพของสารตั้งต้นในตัวอย่างทั้งหมดมีความสัมพันธ์อย่างมีนัยสำคัญกับความเข้มที่ลดลงของคุณลักษณะคุณภาพเดียวกันที่ได้รับพลังงานการชนต่ำหรือสูง และคุณลักษณะนั้นไม่ได้ถูกระบุว่าเป็นพีคไอโซโทปโดย CAMERA ก็สามารถกำหนดรายละเอียดเพิ่มเติมได้ จากนั้น โดยการคำนวณคู่สารตั้งต้น-ผลิตภัณฑ์ที่เป็นไปได้ทั้งหมดภายใน 3 วินาที (ช่วงเวลาการคงตัวโดยประมาณสำหรับการคงตัวของพีค) จะทำการวิเคราะห์ความสัมพันธ์ เฉพาะเมื่อค่า m/z ต่ำกว่าค่าสารตั้งต้นและการแตกตัวของ MS/MS เกิดขึ้นในตำแหน่งตัวอย่างเดียวกันในชุดข้อมูลกับสารตั้งต้นที่ได้มาเท่านั้น จึงจะถือว่าเป็นชิ้นส่วน
โดยอิงตามกฎง่ายๆ สองข้อนี้ เราจะตัดชิ้นส่วนที่ระบุซึ่งมีค่า m/z มากกว่าค่า m/z ของสารตั้งต้นที่ระบุออกไป และอิงตามตำแหน่งของตัวอย่างที่สารตั้งต้นปรากฏและชิ้นส่วนที่ระบุ นอกจากนี้ยังสามารถเลือกคุณลักษณะคุณภาพที่สร้างขึ้นโดยชิ้นส่วนภายในแหล่งกำเนิดจำนวนมากที่สร้างขึ้นในโหมด MS1 เป็นสารตั้งต้นที่เป็นไปได้ ซึ่งจะสร้างสารประกอบ MS/MS ที่ซ้ำซ้อน เพื่อลดความซ้ำซ้อนของข้อมูลนี้ หากความคล้ายคลึงกันของ NDP ของสเปกตรัมเกิน 0.6 และสเปกตรัมเหล่านั้นอยู่ในโครมาโตแกรม “pcgroup” ที่ระบุโดย CAMERA เราจะรวมสเปกตรัมเหล่านั้นเข้าด้วยกัน สุดท้าย เราจะรวมผลลัพธ์ CE ทั้งสี่ที่เกี่ยวข้องกับสารตั้งต้นและชิ้นส่วนเข้ากับสเปกตรัมคอมโพสิตที่แยกส่วนขั้นสุดท้าย โดยเลือกยอดที่มีความเข้มสูงสุดในบรรดายอดที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่มีค่า m/z เดียวกันที่พลังงานการชนที่แตกต่างกัน ขั้นตอนการประมวลผลในลำดับถัดไปนั้นอิงตามแนวคิดของสเปกตรัมแบบผสม และคำนึงถึงเงื่อนไข CE ที่แตกต่างกันซึ่งจำเป็นต่อการเพิ่มโอกาสในการแตกตัวให้สูงสุด เนื่องจากชิ้นส่วนบางชิ้นสามารถตรวจจับได้ภายใต้พลังงานการชนที่เฉพาะเจาะจงเท่านั้น
RDPI (30) ถูกใช้เพื่อคำนวณความสามารถในการเหนี่ยวนำของโปรไฟล์เมตาบอลิก ความหลากหลายของสเปกตรัมเมตาบอลิก (ดัชนี Hj) ได้มาจากความอุดมสมบูรณ์ของสารตั้งต้น MS/MS โดยใช้เอนโทรปีของ Shannon ของการกระจายความถี่ MS/MS โดยใช้สมการต่อไปนี้ที่อธิบายโดย Martínez et al. (8) Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) โดยที่ Pij สอดคล้องกับความถี่สัมพัทธ์ของ MS/MS ตัวที่ i ในตัวอย่างที่ j (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t)
ความจำเพาะของเมตาบอลิซึม (ดัชนี Si) ถูกกำหนดให้เป็นความเหมือนกันของการแสดงออกของ MS/MS ที่กำหนด โดยสัมพันธ์กับความถี่ระหว่างตัวอย่างที่กำลังพิจารณา ความจำเพาะของ MS/MS คำนวณได้จากสูตร Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
ใช้สูตรต่อไปนี้ในการวัดดัชนี δj เฉพาะเมตาโบโลมของแต่ละตัวอย่าง j และค่าเฉลี่ยของความจำเพาะ MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
สเปกตรัม MS/MS จะถูกจัดเรียงเป็นคู่ และคำนวณความคล้ายคลึงกันโดยอิงจากคะแนนทั้งสอง ขั้นแรก ใช้ NDP มาตรฐาน (หรือที่รู้จักกันในชื่อวิธีการหาความสัมพันธ์แบบโคไซน์) โดยใช้สมการต่อไปนี้ในการให้คะแนนความคล้ายคลึงกันของส่วนต่างๆ ระหว่างสเปกตรัม NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 โดยที่ S1 และ S2 ตามลำดับ สำหรับสเปกตรัม 1 และสเปกตรัม 2 รวมถึง WS1, i และ WS2, i แทนน้ำหนักโดยอิงจากความเข้มของยอดพีคที่ความแตกต่างของยอดพีคร่วมที่ i ระหว่างสองสเปกตรัมมีค่าน้อยกว่า 0.01 Da น้ำหนักคำนวณดังนี้: W = [ความเข้มของยอดพีค] m [คุณภาพ] n, m = 0.5, n = 2 ตามที่ MassBank แนะนำ
มีการนำวิธีการให้คะแนนแบบที่สองมาใช้ ซึ่งเกี่ยวข้องกับการวิเคราะห์ NL ที่ใช้ร่วมกันระหว่าง MS/MS เพื่อจุดประสงค์นี้ เราใช้รายการ NL 52 รายการที่พบได้บ่อยในระหว่างกระบวนการแตกตัวของ MS ควบคู่กันไป และ NL ที่เฉพาะเจาะจงมากขึ้น (ไฟล์ข้อมูล S1) ที่ได้รับการระบุคำอธิบายประกอบไว้ก่อนหน้านี้สำหรับสเปกตรัม MS/MS ของเมตาโบไลต์รองของสายพันธุ์ Nepenthes ที่อ่อนแอ (9, 26) สร้างเวกเตอร์ไบนารี 1 และ 0 สำหรับแต่ละ MS/MS ซึ่งสอดคล้องกับ NL ที่มีอยู่และไม่มีอยู่ตามลำดับ คะแนนความคล้ายคลึงของ NL จะถูกคำนวณสำหรับแต่ละคู่ของเวกเตอร์ไบนารี NL โดยอิงจากความคล้ายคลึงของระยะทางแบบยูคลิด
ในการดำเนินการคลัสเตอร์แบบคู่ เราใช้แพ็กเกจ R ชื่อ DiffCoEx ซึ่งอิงตามส่วนขยายของ Weighted Gene Co-expression Analysis (WGCNA) โดยใช้เมทริกซ์การให้คะแนน NDP และ NL ของสเปกตรัม MS/MS เราใช้ DiffCoEx ในการคำนวณเมทริกซ์ความสัมพันธ์เชิงเปรียบเทียบ การจัดคลัสเตอร์แบบไบนารีดำเนินการโดยการตั้งค่าพารามิเตอร์ “cutreeDynamic” เป็น method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T และ minClusterSize = 10 ซอร์สโค้ด R ของ DiffCoEx ได้รับการดาวน์โหลดจากไฟล์เพิ่มเติม 1 โดย Tesson et al. (57); แพ็กเกจซอฟต์แวร์ R WGCNA ที่จำเป็นสามารถพบได้ใน https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA
เพื่อทำการวิเคราะห์เครือข่ายโมเลกุล MS/MS เราได้คำนวณการเชื่อมต่อสเปกตรัมแบบจับคู่โดยอิงตามประเภทความคล้ายคลึง NDP และ NL และใช้ซอฟต์แวร์ Cytoscape เพื่อแสดงภาพโครงสร้างเครือข่ายโดยใช้เค้าโครงแบบออร์แกนิกในแอปพลิเคชันส่วนขยายอัลกอริธึมเค้าโครง CyFilescape yFiles
ใช้โปรแกรม R เวอร์ชัน 3.0.1 ในการวิเคราะห์ทางสถิติข้อมูล ประเมินความมีนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (ANOVA) ตามด้วยการทดสอบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญของ Tukey (HSD) เพื่อวิเคราะห์ความแตกต่างระหว่างกลุ่มทดลองที่ถูกสัตว์กินพืชทำลายกับกลุ่มควบคุม วิเคราะห์การแจกแจงแบบสองด้านของกลุ่มตัวอย่างทั้งสองกลุ่มที่มีความแปรปรวนเท่ากันโดยใช้การทดสอบ t ของ Student
สำหรับเอกสารประกอบเพิ่มเติมของบทความนี้ โปรดดูที่ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
บทความนี้เป็นบทความที่เข้าถึงได้โดยเสรี ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ซึ่งอนุญาตให้ใช้งาน แจกจ่าย และทำสำเนาซ้ำในสื่อใดๆ ก็ได้ ตราบใดที่การใช้งานขั้นสุดท้ายไม่ใช่เพื่อผลกำไรทางการค้า และข้อสมมติฐานคือผลงานต้นฉบับถูกต้อง อ้างอิง
หมายเหตุ: เราขอให้คุณระบุที่อยู่อีเมลของคุณก็เพื่อให้ผู้ที่คุณแนะนำไปยังเพจทราบว่าคุณต้องการให้พวกเขาเห็นอีเมลนั้นและไม่ใช่สแปม เราจะไม่เก็บรวบรวมที่อยู่อีเมลใดๆ ทั้งสิ้น
คำถามนี้ใช้เพื่อทดสอบว่าคุณเป็นผู้เยี่ยมชมหรือไม่ และเพื่อป้องกันการส่งสแปมโดยอัตโนมัติ
ทฤษฎีสารสนเทศเป็นมาตรฐานสากลสำหรับการเปรียบเทียบเมตาโบโลมเฉพาะกลุ่ม และการทำนายทฤษฎีการป้องกันการทดสอบ
ทฤษฎีสารสนเทศเป็นมาตรฐานสากลสำหรับการเปรียบเทียบเมตาโบโลมเฉพาะกลุ่ม และการทำนายทฤษฎีการป้องกันการทดสอบ
©2021 สมาคมอเมริกันเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ สงวนลิขสิทธิ์. AAAS เป็นหุ้นส่วนของ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef และ COUNTER วิทยาศาสตร์ก้าวหน้า ISSN 2375-2548