ก่อนหน้านี้เราได้รายงานว่าระดับในซีรั่มของสารเมตาโบไลต์ของทริปโตเฟนที่ได้จากลำไส้ คือ อินโดล-3-โพรพิโอนิกแอซิด (IPA) นั้นต่ำกว่าในผู้ป่วยที่มีภาวะตับแข็ง ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ตรวจสอบทรานสคริปโตมและเมทิลโลมของดีเอ็นเอในตับของผู้ป่วยโรคอ้วนที่สัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่ม รวมถึงบทบาทของ IPA ในการเหนี่ยวนำให้เกิดการยับยั้งการทำงานของเซลล์ดาวตับ (HSCs) ในหลอดทดลอง
การศึกษานี้รวมผู้ป่วยโรคอ้วน 116 รายที่ไม่มีโรคเบาหวานชนิดที่ 2 (T2DM) (อายุ 46.8 ± 9.3 ปี; ดัชนีมวลกาย: 42.7 ± 5.0 กก./ตร.ม.) ที่เข้ารับการผ่าตัดลดน้ำหนักที่ศูนย์ผ่าตัดลดน้ำหนักคูโอปิโอ (KOBS) มีการวัดระดับ IPA ในกระแสเลือดโดยใช้เทคนิคโครมาโทกราฟีของเหลว-แมสสเปกโทรเมตรี (LC-MS) ทำการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมของตับโดยใช้การจัดลำดับ RNA ทั้งหมด และทำการวิเคราะห์เมทิลเลชั่นของ DNA โดยใช้ Infinium HumanMethylation450 BeadChip ใช้เซลล์ตับดาว (LX-2) สำหรับการทดลองในหลอดทดลอง
ระดับ IPA ในซีรั่มมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการอะพอพโทซิส ไมโทฟาจี และวิถีการมีอายุยืนยาวในตับ ยีน AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) เป็นยีนที่มีปริมาณมากที่สุดและมีบทบาทเด่นที่สุดในโปรไฟล์การถอดรหัสและการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในตับ การรักษาด้วย IPA กระตุ้นให้เกิดอะพอพโทซิส ลดการหายใจของไมโทคอนเดรีย และเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์และพลวัตของไมโทคอนเดรียโดยการปรับการแสดงออกของยีนที่ทราบกันว่าควบคุมการเกิดพังผืด อะพอพโทซิส และการอยู่รอดของเซลล์ LX-2
โดยสรุปแล้ว ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนว่า IPA มีศักยภาพในการรักษา และสามารถกระตุ้นให้เกิดอะพอพโทซิสและเปลี่ยนฟีโนไทป์ของ HSC ไปสู่สภาวะที่ไม่ทำงาน ซึ่งจะช่วยขยายความเป็นไปได้ในการยับยั้งภาวะตับแข็งโดยการรบกวนการทำงานของ HSC และการเผาผลาญของไมโทคอนเดรีย
ความชุกของโรคอ้วนและกลุ่มอาการเมตาบอลิกมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของอุบัติการณ์ของโรคไขมันพอกตับที่เกี่ยวข้องกับเมตาบอลิก (MASLD) โดยโรคนี้ส่งผลกระทบต่อประชากรทั่วไปร้อยละ 25 ถึง 30 [1] ผลที่ตามมาหลักของสาเหตุของ MASLD คือภาวะพังผืดในตับ ซึ่งเป็นกระบวนการแบบไดนามิกที่มีลักษณะเฉพาะคือการสะสมอย่างต่อเนื่องของเมทริกซ์นอกเซลล์ที่เป็นเส้นใย (ECM) [2] เซลล์หลักที่เกี่ยวข้องกับภาวะพังผืดในตับคือเซลล์ดาวตับ (HSCs) ซึ่งแสดงฟีโนไทป์ที่รู้จักกันสี่แบบ ได้แก่ สงบ ถูกกระตุ้น ไม่ทำงาน และเสื่อมสภาพ [3, 4] HSCs สามารถถูกกระตุ้นและเปลี่ยนสภาพจากรูปแบบที่สงบไปเป็นเซลล์คล้ายไฟโบรบลาสต์ที่เพิ่มจำนวนได้ซึ่งมีความต้องการพลังงานสูง โดยมีการแสดงออกของ α-smooth muscle actin (α-SMA) และคอลลาเจนชนิดที่ 1 (Col-I) เพิ่มขึ้น [5, 6] ในระหว่างการย้อนกลับของภาวะพังผืดในตับ HSCs ที่ถูกกระตุ้นจะถูกกำจัดออกไปโดยผ่านกระบวนการอะพอพโทซิสหรือการไม่ทำงาน กระบวนการเหล่านี้รวมถึงการลดระดับยีนสร้างพังผืดและการปรับเปลี่ยนยีนส่งเสริมการอยู่รอด (เช่น เส้นทางการส่งสัญญาณ NF-κB และ PI3K/Akt) [7, 8] ตลอดจนการเปลี่ยนแปลงในพลวัตและการทำงานของไมโตคอนเดรีย [9]
พบว่าระดับเซรั่มของสารเมตาโบไลต์ของทริปโตเฟน อินโดล-3-โพรพิโอนิกแอซิด (IPA) ซึ่งผลิตในลำไส้ ลดลงในโรคเมตาบอลิกของมนุษย์ รวมถึง MASLD [10–13] IPA เกี่ยวข้องกับการบริโภคใยอาหาร เป็นที่รู้จักในด้านฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระและต้านการอักเสบ และช่วยลดอาการไขมันพอกตับที่ไม่เกิดจากแอลกอฮอล์ (NASH) ที่เกิดจากอาหารทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง [11–14] หลักฐานบางส่วนมาจากงานวิจัยก่อนหน้านี้ของเรา ซึ่งแสดงให้เห็นว่าระดับ IPA ในเซรั่มต่ำกว่าในผู้ป่วยที่มีพังผืดในตับเมื่อเทียบกับผู้ป่วยโรคอ้วนที่ไม่มีพังผืดในตับ ในการศึกษาการผ่าตัดลดน้ำหนัก Kuopio (KOBS) นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย IPA สามารถลดการแสดงออกของยีนที่เป็นเครื่องหมายคลาสสิกของการยึดเกาะของเซลล์ การเคลื่อนย้ายของเซลล์ และการกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดในแบบจำลองเซลล์ดาวตับของมนุษย์ (LX-2) และเป็นสารเมตาโบไลต์ที่อาจช่วยปกป้องตับได้ [15] อย่างไรก็ตาม ยังไม่เป็นที่แน่ชัดว่า IPA กระตุ้นการลดลงของพังผืดในตับได้อย่างไร โดยการกระตุ้นการตายของเซลล์ HSC และกระบวนการสร้างพลังงานชีวภาพของไมโทคอนเดรีย
ในงานวิจัยนี้ เราแสดงให้เห็นว่า IPA ในซีรั่มมีความสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการอะพอพโทซิส ไมโทฟาจี และวิถีการมีอายุยืนยาวในตับของบุคคลที่เป็นโรคอ้วนแต่ไม่ใช่โรคเบาหวานชนิดที่ 2 (KOBS) นอกจากนี้ เรายังพบว่า IPA สามารถกระตุ้นการกำจัดและการสลายตัวของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) ที่ถูกกระตุ้นผ่านทางวิถีการยับยั้ง ผลลัพธ์เหล่านี้เผยให้เห็นบทบาทใหม่ของ IPA ทำให้มันเป็นเป้าหมายในการรักษาที่มีศักยภาพในการส่งเสริมการลดลงของพังผืดในตับ
การศึกษาครั้งก่อนในกลุ่มผู้ป่วย KOBS แสดงให้เห็นว่าผู้ป่วยที่มีภาวะพังผืดในตับมีระดับ IPA ในกระแสเลือดต่ำกว่าเมื่อเทียบกับผู้ป่วยที่ไม่มีภาวะพังผืดในตับ [15] เพื่อไม่ให้เกิดผลกระทบจากโรคเบาหวานประเภทที่ 2 เราจึงคัดเลือกผู้ป่วยโรคอ้วนที่ไม่มีโรคเบาหวานประเภทที่ 2 จำนวน 116 ราย (อายุเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน: 46.8 ± 9.3 ปี; ดัชนีมวลกาย: 42.7 ± 5.0 กก./ตร.ม.) (ตารางที่ 1) จากการศึกษา KOBS ที่กำลังดำเนินอยู่มาเป็นประชากรในการศึกษา [16] ผู้เข้าร่วมทุกคนได้ให้ความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษร และโปรโตคอลการศึกษาได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลประจำเขต North Savo ตามปฏิญญาเฮลซิงกิ (54/2005, 104/2008 และ 27/2010)
ตัวอย่างชิ้นเนื้อตับถูกเก็บรวบรวมระหว่างการผ่าตัดลดน้ำหนักและได้รับการประเมินทางเนื้อเยื่อวิทยาโดยพยาธิแพทย์ผู้เชี่ยวชาญตามเกณฑ์ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [17, 18] เกณฑ์การประเมินสรุปไว้ในตารางเสริม S1 และได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้แล้ว [19]
ตัวอย่างซีรั่มที่อดอาหารจะถูกวิเคราะห์โดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบไม่เจาะจงเป้าหมายร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรี (LC-MS) สำหรับการวิเคราะห์เมตาโบลิกส์ (n = 116) ตัวอย่างจะถูกวิเคราะห์โดยใช้ระบบ UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Germany) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้19 การระบุไอโซโพรพิลแอลกอฮอล์ (IPA) ขึ้นอยู่กับเวลาการคงตัวและการเปรียบเทียบสเปกตรัม MS/MS กับสารมาตรฐานบริสุทธิ์ ความเข้มของสัญญาณ IPA (พื้นที่ยอด) จะถูกนำมาพิจารณาในการวิเคราะห์เพิ่มเติมทั้งหมด [20]
การจัดลำดับ RNA ของตับทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ Illumina HiSeq 2500 และข้อมูลได้รับการประมวลผลล่วงหน้าตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [19, 21, 22] เราได้ทำการวิเคราะห์การแสดงออกที่แตกต่างกันแบบกำหนดเป้าหมายของทรานสคริปต์ที่มีผลต่อการทำงาน/การสร้างไมโทคอนเดรียโดยใช้ยีน 1957 ยีนที่เลือกจากฐานข้อมูล MitoMiner 4.0 [ 23 ] การวิเคราะห์การเมทิลเลชั่นของ DNA ในตับดำเนินการโดยใช้ Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) โดยใช้วิธีการเดียวกันกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [24, 25]
เซลล์ดาวตับของมนุษย์ (LX-2) ได้รับความอนุเคราะห์จากศาสตราจารย์ Stefano Romeo และถูกเพาะเลี้ยงและบำรุงรักษาในอาหารเลี้ยงเซลล์ DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) เพื่อเลือกขนาดยา IPA ที่เหมาะสม เซลล์ LX-2 ถูกบำบัดด้วย IPA ที่ความเข้มข้นต่าง ๆ (10 μM, 100 μM และ 1 mM; Sigma, 220027) ในอาหารเลี้ยงเซลล์ DMEM/F12 เป็นเวลา 24 ชั่วโมง นอกจากนี้ เพื่อตรวจสอบความสามารถของ IPA ในการยับยั้ง HSC เซลล์ LX-2 ถูกบำบัดร่วมกับ TGF-β1 5 ng/ml (R&D systems, 240-B-002/CF) และ IPA 1 mM ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง สำหรับการควบคุมยานพาหนะที่เกี่ยวข้อง ใช้ HCL 4 nM ที่มี BSA 0.1% สำหรับการรักษาด้วย TGF-β1 และใช้ DMSO 0.05% สำหรับการรักษาด้วย IPA โดยใช้ทั้งสองอย่างร่วมกันสำหรับการรักษาแบบผสมผสาน
การประเมินอะพอพโทซิส (Apoptosis) ทำได้โดยใช้ชุดตรวจจับอะพอพโทซิส FITC Annexin V ร่วมกับ 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุปคือ เซลล์ LX-2 (1 × 10⁵ เซลล์/หลุม) ถูกเพาะเลี้ยงข้ามคืนในจานเพาะเลี้ยง 12 หลุม จากนั้นจึงทำการรักษาด้วย IPA หรือ IPA ร่วมกับ TGF-β1 ในหลายขนาด ในวันถัดมา เซลล์ที่ลอยและเซลล์ที่เกาะติดถูกเก็บรวบรวม ย่อยด้วยทริปซิน ล้างด้วย PBS แขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์สำหรับจับกับ Annexin V และบ่มกับ FITC-Annexin V และ 7-AAD เป็นเวลา 15 นาที
ไมโตคอนเดรียในเซลล์ที่มีชีวิตถูกย้อมสีเพื่อตรวจสอบกิจกรรมออกซิเดชันโดยใช้ Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) สำหรับการทดสอบ MTR เซลล์ LX-2 ถูกบ่มที่ความหนาแน่นเท่ากันกับ IPA และ TGF-β1 หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ที่มีชีวิตถูกแยกด้วยทริปซิน ล้างด้วย PBS แล้วบ่มกับ MTR 100 μM ในตัวกลางที่ปราศจากซีรั่มที่ 37 °C เป็นเวลา 20 นาที ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 26 ] สำหรับการวิเคราะห์สัณฐานวิทยาของเซลล์ที่มีชีวิต ขนาดเซลล์และความซับซ้อนของไซโตพลาสซึมถูกวิเคราะห์โดยใช้พารามิเตอร์การกระเจิงไปข้างหน้า (FSC) และการกระเจิงด้านข้าง (SSC) ตามลำดับ
ข้อมูลทั้งหมด (30,000 เหตุการณ์) ได้รับการเก็บรวบรวมโดยใช้ NovoCyte Quanteon (Agilent) และวิเคราะห์โดยใช้ซอฟต์แวร์ NovoExpress® 1.4.1 หรือ FlowJo V.10
อัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) และอัตราการเกิดกรดนอกเซลล์ (ECAR) ถูกวัดแบบเรียลไทม์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์การไหลของสารนอกเซลล์ Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ที่ติดตั้ง Seahorse XF Cell Mito Stress ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยสรุปคือ เซลล์ LX-2 จำนวน 2 × 10⁴ เซลล์/หลุม ถูกเพาะลงบนจานเพาะเลี้ยงเซลล์ XF96 หลังจากบ่มข้ามคืน เซลล์จะได้รับการบำบัดด้วยไอโซโพรพานอล (IPA) และ TGF-β1 (วิธีการเสริม 1) การวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ Seahorse XF Wave ซึ่งรวมถึง Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator จากนั้นจึงคำนวณดัชนีสุขภาพทางชีวพลังงาน (BHI) [27]
RNA ทั้งหมดถูกถอดรหัสเป็น cDNA สำหรับวิธีการเฉพาะ โปรดดูเอกสารอ้างอิง [15] ระดับ mRNA ของโปรตีนกรดไรโบโซม 60S ของมนุษย์ P0 (RPLP0) และไซโคลฟิลิน A1 (PPIA) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมยีนคงที่ ระบบ QuantStudio 6 pro Real-Time PCR (Thermo Fisher, Landsmeer, เนเธอร์แลนด์) ถูกใช้ร่วมกับชุด TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) หรือชุด Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) และคำนวณค่าการแสดงออกของยีนสัมพัทธ์โดยใช้พารามิเตอร์การวนรอบค่า Ct เปรียบเทียบ (ΔΔCt) และวิธีการ ∆∆Ct รายละเอียดของไพรเมอร์มีอยู่ในตารางเสริม S2 และ S3
ดีเอ็นเอในนิวเคลียส (ncDNA) และดีเอ็นเอในไมโทคอนเดรีย (mtDNA) ถูกสกัดโดยใช้ชุด DNeasy blood and tissue kit (Qiagen) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [28] ปริมาณ mtDNA สัมพัทธ์คำนวณโดยการคำนวณอัตราส่วนของแต่ละบริเวณ mtDNA เป้าหมายต่อค่าเฉลี่ยเรขาคณิตของบริเวณดีเอ็นเอในนิวเคลียสทั้งสาม (mtDNA/ncDNA) ตามรายละเอียดในวิธีการเสริม 2 รายละเอียดของไพรเมอร์สำหรับ mtDNA และ ncDNA มีให้ในตารางเสริม S4
เซลล์ที่มีชีวิตจะถูกย้อมด้วย Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) เพื่อให้เห็นภาพเครือข่ายไมโตคอนเดรียระหว่างเซลล์และภายในเซลล์ เซลล์ LX-2 (1 × 104 เซลล์/หลุม) ถูกเพาะเลี้ยงบนสไลด์แก้วในจานเพาะเลี้ยงก้นแก้วที่เหมาะสม (Ibidi GmbH, Martinsried, Germany) หลังจาก 24 ชั่วโมง เซลล์ LX-2 ที่มีชีวิตจะถูกบ่มด้วย MTR 100 μM เป็นเวลา 20 นาทีที่ 37 °C และนิวเคลียสของเซลล์จะถูกย้อมด้วย DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [29] เครือข่ายไมโตคอนเดรียถูกมองเห็นได้โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัว Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) ที่ติดตั้งโมดูลคอนโฟคอล Zeiss LSM 800 ที่อุณหภูมิ 37 °C ในบรรยากาศชื้นที่มี CO2 5% โดยใช้เลนส์วัตถุ 63×NA 1.3 เราได้ภาพ Z-series จำนวน 10 ภาพสำหรับตัวอย่างแต่ละประเภท แต่ละ Z-series ประกอบด้วย 30 ส่วน แต่ละส่วนมีความหนา 9.86 μm สำหรับแต่ละตัวอย่าง ภาพของ 10 ขอบเขตการมองเห็นที่แตกต่างกันถูกบันทึกโดยใช้ซอฟต์แวร์ ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Germany) และการวิเคราะห์สัณฐานวิทยาของไมโตคอนเดรียดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ (v1.54d) [30, 31] ตามพารามิเตอร์ที่ระบุรายละเอียดในวิธีการเสริม 3
เซลล์ถูกตรึงด้วยกลูตารัลดีไฮด์ 2% ในบัฟเฟอร์ฟอสเฟต 0.1 M จากนั้นตรึงด้วยสารละลายออสเมียมเตตระออกไซด์ 1% (Sigma Aldrich, MO, USA) ค่อยๆ กำจัดน้ำออกด้วยอะซิโตน (Merck, Darmstadt, Germany) และสุดท้ายฝังในเรซินอีพ็อกซี เตรียมส่วนตัดบางพิเศษและย้อมด้วยยูรานิลอะซิเตต 1% (Merck, Darmstadt, Germany) และตะกั่วซิเตรต 1% (Merck, Darmstadt, Germany) ภาพโครงสร้างระดับจุลภาคได้จากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ที่แรงดันเร่ง 80 kV
วิเคราะห์สัณฐานวิทยาของเซลล์ LX-2 ที่ได้รับการบำบัดด้วย IPA เป็นเวลา 24 ชั่วโมง โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ที่กำลังขยาย 50 เท่า โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แบบกลับหัวของ Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 และ AxioCam MRm, Jena, Germany)
ข้อมูลทางคลินิกแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน หรือค่ามัธยฐาน (ช่วงควาร์ไทล์: IQR) ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (สำหรับตัวแปรต่อเนื่อง) หรือการทดสอบไคสแควร์ (สำหรับตัวแปรเชิงหมวดหมู่) เพื่อเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกลุ่มศึกษาทั้งสามกลุ่ม ใช้อัตราการเกิดผลบวกเท็จ (FDR) เพื่อแก้ไขปัญหาการทดสอบหลายครั้ง และยีนที่มี FDR < 0.05 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ ใช้การวิเคราะห์สหสัมพันธ์สเปียร์แมนเพื่อหาความสัมพันธ์ระหว่างการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอ CpG กับความเข้มของสัญญาณ IPA โดยรายงานค่า p ที่ระบุ (p < 0.05)
การวิเคราะห์เส้นทางชีวเคมีดำเนินการโดยใช้เครื่องมือวิเคราะห์ชุดยีนบนเว็บ (WebGestalt) สำหรับทรานสคริปต์ 268 รายการ (ค่า p น้อยกว่า 0.01), ทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย 119 รายการ (ค่า p น้อยกว่า 0.05) และ CpG 4350 รายการ จากทรานสคริปต์ตับ 3093 รายการ ที่เกี่ยวข้องกับระดับ IPA ในซีรั่มหมุนเวียน ใช้เครื่องมือ Venny DB (เวอร์ชัน 2.1.0) ที่ใช้งานได้ฟรีเพื่อค้นหายีนที่ซ้ำกัน และใช้ StringDB (เวอร์ชัน 11.5) เพื่อแสดงภาพปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนกับโปรตีน
สำหรับการทดลอง LX-2 ตัวอย่างถูกทดสอบความปกติของการกระจายตัวโดยใช้การทดสอบ D'Agostino-Pearson ข้อมูลได้มาจากตัวอย่างทางชีววิทยาอย่างน้อยสามตัวอย่าง และนำไปวิเคราะห์ด้วย ANOVA แบบทางเดียว ร่วมกับการทดสอบ Bonferroni post hoc ค่า p น้อยกว่า 0.05 ถือว่ามีความสำคัญทางสถิติ ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน และจำนวนการทดลองระบุไว้ในแต่ละภาพ การวิเคราะห์และกราฟทั้งหมดดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ทางสถิติ GraphPad Prism 8 สำหรับ Windows (GraphPad Software Inc., เวอร์ชัน 8.4.3, ซานดิเอโก, สหรัฐอเมริกา)
ขั้นแรก เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ของระดับ IPA ในซีรั่มกับยีนที่ถอดรหัสจากตับ ร่างกายทั้งหมด และไมโทคอนเดรีย ในโปรไฟล์การถอดรหัสทั้งหมด ยีนที่มีความสัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่มมากที่สุดคือ MAPKAPK3 (FDR = 0.0077; mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 3) และในโปรไฟล์การถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย ยีนที่มีความสัมพันธ์มากที่สุดคือ AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (ไฟล์เพิ่มเติม 1 และไฟล์เพิ่มเติม 2)
จากนั้นเราได้วิเคราะห์ทรานสคริปต์ทั่วโลก (n = 268; p < 0.01) และทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย (n = 119; p < 0.05) ซึ่งในที่สุดก็ระบุว่าอะพอพโทซิสเป็นวิถีทางหลักที่มีนัยสำคัญที่สุด (p = 0.0089) สำหรับทรานสคริปต์ของไมโทคอนเดรียที่เกี่ยวข้องกับระดับ IPA ในซีรั่ม เรามุ่งเน้นไปที่อะพอพโทซิส (FDR = 0.00001) ไมโทฟาจี (FDR = 0.00029) และวิถีทางส่งสัญญาณ TNF (FDR = 0.000006) (รูปที่ 1A ตารางที่ 2 และรูปภาพเสริม 1A-B)
การวิเคราะห์การทับซ้อนกันของทรานสคริปต์ระดับโลก ทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย และการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอในตับมนุษย์ที่สัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่ม A แสดงถึงทรานสคริปต์ระดับโลก 268 รายการ ทรานสคริปต์ที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย 119 รายการ และทรานสคริปต์ที่มีการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอ ซึ่งแมปไปยังไซต์ CpG 3092 ตำแหน่งที่สัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่ม (ค่า p < 0.01 สำหรับทรานสคริปต์ระดับโลกและการเมทิลเลชั่นของดีเอ็นเอ และค่า p < 0.05 สำหรับทรานสคริปต์ไมโทคอนเดรีย) ทรานสคริปต์ที่ทับซ้อนกันหลักๆ แสดงอยู่ตรงกลาง (AKT1 และ YKT6) B แผนที่ปฏิสัมพันธ์ของยีน 13 ยีนที่มีคะแนนปฏิสัมพันธ์สูงสุด (0.900) กับยีนอื่นๆ ถูกสร้างขึ้นจากยีนที่ทับซ้อนกัน 56 ยีน (บริเวณเส้นสีดำ) ที่สัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่มอย่างมีนัยสำคัญ โดยใช้เครื่องมือออนไลน์ StringDB สีเขียว: ยีนที่แมปไปยังส่วนประกอบเซลล์ของ Gene Ontology (GO): ไมโทคอนเดรีย (GO:0005739) AKT1 เป็นโปรตีนที่มีคะแนนสูงสุด (0.900) สำหรับการมีปฏิสัมพันธ์กับโปรตีนอื่นๆ โดยพิจารณาจากข้อมูล (ที่ได้จากการวิเคราะห์ข้อความ การทดลอง ฐานข้อมูล และการแสดงออกร่วมกัน) โหนดในเครือข่ายแสดงถึงโปรตีน และเส้นเชื่อมแสดงถึงการเชื่อมต่อระหว่างโปรตีน
เนื่องจากเมตาโบไลต์ของจุลินทรีย์ในลำไส้สามารถควบคุมองค์ประกอบทางพันธุกรรมผ่านการเมทิลเลชั่นของ DNA [32] เราจึงตรวจสอบว่าระดับ IPA ในซีรั่มมีความสัมพันธ์กับการเมทิลเลชั่นของ DNA ในตับหรือไม่ เราพบว่าตำแหน่งเมทิลเลชั่นหลักสองตำแหน่งที่เกี่ยวข้องกับระดับ IPA ในซีรั่มอยู่ใกล้กับบริเวณที่อุดมไปด้วยโพรลีน-เซอรีน 3 (C19orf55) และสมาชิก 6 ของตระกูลโปรตีนช็อกความร้อน B (ขนาดเล็ก) (HSPB6) (ไฟล์เพิ่มเติม 3) การเมทิลเลชั่นของ DNA ที่ 4350 CpG (p < 0.01) มีความสัมพันธ์กับระดับ IPA ในซีรั่มและพบมากในเส้นทางควบคุมอายุยืน (p = 0.006) (รูปที่ 1A ตารางที่ 2 และรูปภาพเสริม 1C)
เพื่อทำความเข้าใจกลไกทางชีววิทยาที่อยู่เบื้องหลังความสัมพันธ์ระหว่างระดับ IPA ในซีรั่ม, การถอดรหัสโดยรวม, การถอดรหัสที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย และการเมทิลเลชั่นของ DNA ในตับของมนุษย์ เราได้ทำการวิเคราะห์การทับซ้อนของยีนที่ระบุในการวิเคราะห์เส้นทางก่อนหน้านี้ (รูปที่ 1A) ผลการวิเคราะห์การเสริมคุณค่าของเส้นทางของยีนที่ทับซ้อนกัน 56 ยีน (ภายในเส้นสีดำในรูปที่ 1A) แสดงให้เห็นว่าเส้นทางอะพอพโทซิส (p = 0.00029) เน้นยีนสองตัวที่พบร่วมกันในการวิเคราะห์ทั้งสามครั้ง ได้แก่ AKT1 และ YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog) ดังแสดงในแผนภาพเวนน์ (รูปภาพเสริม 2 และรูปที่ 1A) ที่น่าสนใจคือ เราพบว่า AKT1 (cg19831386) และ YKT6 (cg24161647) มีความสัมพันธ์เชิงบวกกับระดับ IPA ในซีรั่ม (ไฟล์เพิ่มเติม 3) เพื่อระบุปฏิสัมพันธ์ของโปรตีนที่อาจเกิดขึ้นระหว่างผลิตภัณฑ์ของยีน เราได้เลือกยีน 13 ยีนที่มีคะแนนบริเวณร่วมสูงสุด (0.900) จากยีนที่ทับซ้อนกัน 56 ยีนเป็นข้อมูลป้อนเข้า และสร้างแผนที่ปฏิสัมพันธ์ ตามระดับความเชื่อมั่น (ความเชื่อมั่นแบบมีขอบเขต) ยีน AKT1 ที่มีคะแนนสูงสุด (0.900) อยู่ในอันดับต้น ๆ (รูปที่ 1B)
จากการวิเคราะห์เส้นทาง เราพบว่าอะพอพโทซิสเป็นเส้นทางหลัก ดังนั้นเราจึงตรวจสอบว่าการรักษาด้วย IPA จะส่งผลต่ออะพอพโทซิสของ HSC ในหลอดทดลองหรือไม่ ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นแล้วว่า IPA ในปริมาณที่แตกต่างกัน (10 μM, 100 μM และ 1 mM) ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ LX-2 [15] การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย IPA ที่ความเข้มข้น 10 μM และ 100 μM เพิ่มจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่ตายแล้ว อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม ความสามารถในการมีชีวิตของเซลล์ลดลงที่ความเข้มข้นของ IPA 1 mM ในขณะที่อัตราการตายของเซลล์ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง (รูปที่ 2A, B) ต่อไป เพื่อหาความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดในการกระตุ้นอะพอพโทซิสในเซลล์ LX-2 เราจึงทดสอบ IPA ที่ความเข้มข้น 10 μM, 100 μM และ 1 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (รูปที่ 2A-E และรูปเพิ่มเติมที่ 3A-B) ที่น่าสนใจคือ IPA ที่ความเข้มข้น 10 μM และ 100 μM ลดอัตราการเกิดอะพอพโทซิส (%) ลง ในขณะที่ IPA ที่ความเข้มข้น 1 mM เพิ่มการเกิดอะพอพโทซิสระยะท้ายและอัตราการเกิดอะพอพโทซิส (%) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จึงถูกเลือกใช้ในการทดลองเพิ่มเติม (ภาพที่ 2A–D)
IPA ชักนำให้เกิดอะพอพโทซิสในเซลล์ LX-2 ใช้วิธีการย้อมสีคู่ Annexin V และ 7-AAD ในการวัดอัตราการเกิดอะพอพโทซิสและรูปร่างของเซลล์โดยใช้ฟลอว์ไซโตเมทรี เซลล์ BA ถูกบ่มด้วย IPA ที่ความเข้มข้น 10 μM, 100 μM และ 1 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หรือด้วย F–H TGF-β1 (5 ng/ml) และ IPA 1 mM ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง A: เซลล์มีชีวิต (Annexin V -/ 7AAD-); B: เซลล์ตาย (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: ระยะเริ่มต้น (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: ระยะสุดท้าย (Annexin V+/7AAD.+); E, H: เปอร์เซ็นต์ของเซลล์อะพอพโทซิสระยะเริ่มต้นและระยะสุดท้ายทั้งหมดในอัตราการเกิดอะพอพโทซิส (%) ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน, n = 3 การทดลองอิสระ การเปรียบเทียบทางสถิติใช้วิธีการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) ร่วมกับการทดสอบ Bonferroni post hoc *p < 0.05; ****p < 0.0001
ดังที่เราได้แสดงไว้ก่อนหน้านี้ TGF-β1 5 ng/ml สามารถกระตุ้นการทำงานของ HSC โดยการเพิ่มการแสดงออกของยีนเครื่องหมายคลาสสิก [15] เซลล์ LX-2 ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 5 ng/ml และ IPA 1 mM ร่วมกัน (รูปที่ 2E–H) การรักษาด้วย TGF-β1 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงอัตราการเกิดอะพอพโทซิส อย่างไรก็ตาม การรักษาร่วมกับ IPA เพิ่มการเกิดอะพอพโทซิสระยะหลังและอัตราการเกิดอะพอพโทซิส (%) เมื่อเทียบกับการรักษาด้วย TGF-β1 เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 2E–H) ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า IPA 1 mM สามารถส่งเสริมการเกิดอะพอพโทซิสในเซลล์ LX-2 ได้โดยไม่ขึ้นกับการกระตุ้นของ TGF-β1
เราได้ตรวจสอบผลกระทบของ IPA ต่อการหายใจระดับไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 เพิ่มเติม ผลการวิจัยแสดงให้เห็นว่า IPA ความเข้มข้น 1 mM ทำให้ค่าอัตราการใช้ออกซิเจน (OCR) ลดลง ได้แก่ การหายใจที่ไม่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย การหายใจระดับพื้นฐานและระดับสูงสุด การรั่วไหลของโปรตอน และการผลิต ATP เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3A, B) ในขณะที่ดัชนีสุขภาพด้านพลังงานชีวภาพ (BHI) ไม่เปลี่ยนแปลง
IPA ลดการหายใจระดับไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 กราฟการหายใจระดับไมโทคอนเดรีย (OCR) แสดงเป็นพารามิเตอร์การหายใจระดับไมโทคอนเดรีย (การหายใจที่ไม่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรีย การหายใจพื้นฐาน การหายใจสูงสุด การรั่วไหลของโปรตอน การสร้าง ATP SRC และ BHI) เซลล์ A และ B ถูกบ่มด้วย IPA ที่ความเข้มข้น 10 μM, 100 μM และ 1 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตามลำดับ เซลล์ C และ D ถูกบ่มด้วย TGF-β1 (5 ng/ml) และ IPA 1 mM ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ตามลำดับ การวัดทั้งหมดถูกปรับให้เป็นมาตรฐานตามปริมาณ DNA โดยใช้ชุด CyQuant BHI: ดัชนีสุขภาพทางชีวพลังงาน; SRC: ความจุสำรองการหายใจ; OCR: อัตราการใช้ออกซิเจน ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) โดย n = 5 การทดลองอิสระ การเปรียบเทียบทางสถิติใช้วิธีการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA) และการทดสอบหลังการวิเคราะห์ Bonferroni *p < 0.05; **p < 0.01; และ ***p < 0.001
เพื่อให้เข้าใจผลกระทบของ IPA ต่อโปรไฟล์พลังงานชีวภาพของเซลล์ LX-2 ที่ถูกกระตุ้นด้วย TGF-β1 อย่างครอบคลุมมากขึ้น เราจึงวิเคราะห์การฟอสฟอริเลชันแบบออกซิเดทีฟของไมโทคอนเดรียโดยใช้ OCR (รูปที่ 3C,D) ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าการรักษาด้วย TGF-β1 สามารถลดอัตราการหายใจสูงสุด ความจุสำรองการหายใจ (SRC) และ BHI เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 3C,D) นอกจากนี้ การรักษาแบบผสมผสานยังลดอัตราการหายใจพื้นฐาน การรั่วไหลของโปรตอน และการผลิต ATP แต่ SRC และ BHI สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 3C,D)
นอกจากนี้ เรายังทำการทดสอบ “Cellular Energy Phenotype Test” โดยใช้ซอฟต์แวร์ Seahorse (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4A–D) ดังแสดงในภาพประกอบเพิ่มเติม 3B พบว่าศักยภาพการเผาผลาญของ OCR และ ECAR ลดลงหลังจากได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างระหว่างกลุ่มที่ได้รับการรักษาแบบผสมผสานและกลุ่มที่ได้รับการรักษา IPA เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ยิ่งไปกว่านั้น ระดับ OCR ทั้งในสภาวะปกติและสภาวะเครียดลดลงหลังจากได้รับการรักษาด้วยแบบผสมผสานและกลุ่มที่ได้รับการรักษา IPA เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4C) ที่น่าสนใจคือ พบรูปแบบที่คล้ายกันในการรักษาแบบผสมผสาน โดยไม่พบการเปลี่ยนแปลงในระดับ ECAR ทั้งในสภาวะปกติและสภาวะเครียดเมื่อเทียบกับการรักษาด้วย TGF-β1 เพียงอย่างเดียว (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4C) ใน HSC การลดลงของการฟอสฟอริเลชันแบบออกซิเดทีฟของไมโทคอนเดรียและความสามารถของการรักษาแบบผสมผสานในการฟื้นฟู SCR และ BHI หลังจากได้รับ TGF-β1 ไม่ได้เปลี่ยนแปลงศักยภาพการเผาผลาญ (OCR และ ECAR) โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า IPA อาจลดพลังงานชีวภาพใน HSC ซึ่งแสดงให้เห็นว่า IPA อาจเหนี่ยวนำให้เกิดโปรไฟล์พลังงานที่ต่ำลง ส่งผลให้ฟีโนไทป์ของ HSC เปลี่ยนไปสู่การไม่ทำงาน (ภาพประกอบเพิ่มเติม 4D)
ได้มีการศึกษาผลของ IPA ต่อพลวัตของไมโทคอนเดรียโดยใช้การวัดเชิงปริมาณสามมิติของรูปร่างและการเชื่อมต่อเครือข่ายของไมโทคอนเดรีย รวมถึงการย้อมสี MTR (รูปที่ 4 และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 5) รูปที่ 4 แสดงให้เห็นว่า เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาด้วย TGF-β1 ทำให้พื้นที่ผิวเฉลี่ย จำนวนกิ่ง ความยาวกิ่งทั้งหมด และจำนวนจุดเชื่อมต่อกิ่งลดลง (รูปที่ 4A และ B) และเปลี่ยนสัดส่วนของไมโทคอนเดรียจากทรงกลมเป็นรูปร่างกึ่งกลาง (รูปที่ 4C) มีเพียงการรักษาด้วย IPA เท่านั้นที่ทำให้ปริมาตรเฉลี่ยของไมโทคอนเดรียลดลงและเปลี่ยนสัดส่วนของไมโทคอนเดรียจากทรงกลมเป็นรูปร่างกึ่งกลางเมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม (รูปที่ 4A) ในทางตรงกันข้าม ความเป็นทรงกลม ความยาวกิ่งเฉลี่ย และกิจกรรมของไมโทคอนเดรียที่ประเมินโดย MTR ที่ขึ้นอยู่กับศักย์เยื่อหุ้มไมโทคอนเดรีย (รูปที่ 4A และ E) ยังคงไม่เปลี่ยนแปลง และพารามิเตอร์เหล่านี้ไม่แตกต่างกันระหว่างกลุ่ม โดยสรุป ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า การรักษาด้วย TGF-β1 และ IPA ดูเหมือนจะปรับเปลี่ยนรูปร่างและขนาดของไมโทคอนเดรีย รวมถึงความซับซ้อนของเครือข่ายในเซลล์ LX-2 ที่มีชีวิต
IPA เปลี่ยนแปลงพลวัตของไมโทคอนเดรียและปริมาณ DNA ของไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 A. ภาพตัวอย่างจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของเซลล์ LX-2 ที่มีชีวิตซึ่งบ่มด้วย TGF-β1 (5 ng/ml) และ IPA 1 mM เป็นเวลา 24 ชั่วโมงในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรั่ม แสดงเครือข่ายไมโทคอนเดรียที่ย้อมด้วย Mitotracker™ Red CMXRos และนิวเคลียสที่ย้อมสีน้ำเงินด้วย DAPI ข้อมูลทั้งหมดมีภาพอย่างน้อย 15 ภาพต่อกลุ่ม เราได้ภาพ Z-stack 10 ภาพสำหรับตัวอย่างแต่ละประเภท ลำดับแกน Z แต่ละลำดับประกอบด้วย 30 สไลด์ แต่ละสไลด์มีความหนา 9.86 μm แถบมาตราส่วน: 10 μm B. วัตถุตัวอย่าง (เฉพาะไมโทคอนเดรีย) ที่ระบุโดยการใช้การกำหนดค่าเกณฑ์แบบปรับได้กับภาพ การวิเคราะห์เชิงปริมาณและการเปรียบเทียบการเชื่อมต่อเครือข่ายทางสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียดำเนินการสำหรับเซลล์ทั้งหมดในแต่ละกลุ่ม C. ความถี่ของอัตราส่วนรูปร่างของไมโทคอนเดรีย ค่าที่ใกล้เคียง 0 บ่งชี้ถึงรูปร่างทรงกลม และค่าที่ใกล้เคียง 1 บ่งชี้ถึงรูปร่างเป็นเส้นใย D ปริมาณดีเอ็นเอไมโทคอนเดรีย (mtDNA) ถูกกำหนดตามที่อธิบายไว้ในหัวข้อ วัสดุและวิธีการ E การวิเคราะห์ Mitotracker™ Red CMXRos ดำเนินการโดยใช้โฟลว์ไซโตเมตรี (30,000 เหตุการณ์) ตามที่อธิบายไว้ในหัวข้อ วัสดุและวิธีการ ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน โดย n = 3 การทดลองอิสระ การเปรียบเทียบทางสถิติทำโดยใช้ ANOVA แบบทางเดียวและการทดสอบ Bonferroni post hoc *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
จากนั้นเราได้วิเคราะห์ปริมาณ mtDNA ในเซลล์ LX-2 เพื่อใช้เป็นตัวบ่งชี้จำนวนไมโทคอนเดรีย เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่าปริมาณ mtDNA เพิ่มขึ้นในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 (รูปที่ 4D) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 พบว่าปริมาณ mtDNA ลดลงในกลุ่มที่ได้รับการรักษาแบบผสมผสาน (รูปที่ 4D) ซึ่งบ่งชี้ว่า IPA อาจลดปริมาณ mtDNA และอาจลดจำนวนไมโทคอนเดรียรวมถึงการหายใจของไมโทคอนเดรียด้วย (รูปที่ 3C) นอกจากนี้ IPA ดูเหมือนจะลดปริมาณ mtDNA ในการรักษาแบบผสมผสาน แต่ไม่ส่งผลกระทบต่อกิจกรรมของไมโทคอนเดรียที่ควบคุมโดย MTR (รูปที่ 4A–C)
เราได้ตรวจสอบความสัมพันธ์ของ IPA กับระดับ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับพังผืด การตายของเซลล์ การอยู่รอด และพลวัตของไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 (รูปที่ 5A–D) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม กลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 แสดงการแสดงออกของยีนที่เพิ่มขึ้น เช่น คอลลาเจนชนิดที่ 1 สาย α2 (COL1A2) แอคตินกล้ามเนื้อเรียบ α (αSMA) เมทริกซ์เมทัลโลโปรตีเนส 2 (MMP2) ตัวยับยั้งเนื้อเยื่อของเมทัลโลโปรตีเนส 1 (TIMP1) และยีนไดนามิน 1-ไลค์ (DRP1) ซึ่งบ่งชี้ถึงพังผืดและการกระตุ้นที่เพิ่มขึ้น นอกจากนี้ เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มควบคุม การรักษาด้วย TGF-β1 ช่วยลดระดับ mRNA ของตัวรับนิวเคลียร์เพรกเนนเอ็กซ์ (PXR), แคสเปส 8 (CASP8), MAPKAPK3, ตัวยับยั้งบีเซลล์ α, ตัวเสริมการทำงานของยีนนิวเคลียร์แฟคเตอร์ κ ไลท์เปปไทด์ (NFκB1A) และตัวยับยั้งหน่วยย่อยเบตาของไคเนสของนิวเคลียร์แฟคเตอร์ κB (IKBKB) (รูปที่ 5A–D) เมื่อเปรียบเทียบกับการรักษาด้วย TGF-β1 เพียงอย่างเดียว การรักษาแบบผสมผสานระหว่าง TGF-β1 และ IPA ช่วยลดการแสดงออกของ COL1A2 และ MMP2 แต่เพิ่มระดับ mRNA ของ PXR, TIMP1, บีเซลล์ลิมโฟมา-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β และ IKBKB การรักษาด้วย IPA ช่วยลดการแสดงออกของ MMP2, โปรตีน Bcl-2-associated protein X (BAX), AKT1, โปรตีน optic atrophy protein 1 (OPA1) และโปรตีน mitochondrial fusion protein 2 (MFN2) อย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่การแสดงออกของ CASP8, NFκB1A, NFκB1B และ IKBKB เพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม อย่างไรก็ตาม ไม่พบความแตกต่างในการแสดงออกของ caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1) และ fission protein 1 (FIS1) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการรักษาด้วย IPA ปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับพังผืด การตายของเซลล์ การอยู่รอด และพลวัตของไมโทคอนเดรีย ข้อมูลของเราชี้ให้เห็นว่าการรักษาด้วย IPA ช่วยลดพังผืดในเซลล์ LX-2 ในขณะเดียวกันก็กระตุ้นการอยู่รอดโดยการเปลี่ยนฟีโนไทป์ไปสู่การไม่ทำงาน
IPA ปรับเปลี่ยนการแสดงออกของยีนไฟโบรบลาสต์ การตายของเซลล์ ความมีชีวิต และพลวัตของไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 ฮิสโตแกรมแสดงการแสดงออกของ mRNA เทียบกับตัวควบคุมภายใน (RPLP0 หรือ PPIA) หลังจากที่เซลล์ LX-2 ถูกกระตุ้นด้วย TGF-β1 และ IPA ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรัมเป็นเวลา 24 ชั่วโมง A แสดงถึงไฟโบรบลาสต์ B แสดงถึงเซลล์ที่ตายแบบอะพอพโทซิส C แสดงถึงเซลล์ที่รอดชีวิต และ D แสดงถึงการแสดงออกของยีนพลวัตของไมโทคอนเดรีย ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) โดย n = 3 การทดลองอิสระ การเปรียบเทียบทางสถิติทำโดยใช้ ANOVA แบบทางเดียวและการทดสอบ Bonferroni post hoc *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
จากนั้น ได้ทำการประเมินการเปลี่ยนแปลงขนาดเซลล์ (FSC-H) และความซับซ้อนของไซโตพลาสซึม (SSC-H) โดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี (ภาพที่ 6A,B) และประเมินการเปลี่ยนแปลงรูปร่างของเซลล์หลังการรักษาด้วย IPA โดยใช้กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่งผ่าน (TEM) และกล้องจุลทรรศน์แบบเฟสคอนทราสต์ (ภาพเสริม 6A-B) ตามที่คาดไว้ เซลล์ในกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 มีขนาดใหญ่ขึ้นเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ภาพที่ 6A,B) แสดงให้เห็นถึงการขยายตัวของเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมแบบหยาบ (ER*) และฟาโกไลโซโซม (P) ซึ่งบ่งชี้ถึงการกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) (ภาพเสริม 6A) อย่างไรก็ตาม เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มที่ได้รับการรักษาด้วย TGF-β1 ขนาดเซลล์ ความซับซ้อนของไซโตพลาสซึม (ภาพที่ 6A,B) และปริมาณ ER* ลดลงในกลุ่มที่ได้รับการรักษาร่วมกันด้วย TGF-β1 และ IPA (ภาพเสริม 6A) นอกจากนี้ การรักษาด้วย IPA ยังทำให้ขนาดเซลล์ ความซับซ้อนของไซโตพลาสซึม (รูปที่ 6A,B) ปริมาณ P และ ER* ลดลง (รูปเพิ่มเติมที่ 6A) เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม ยิ่งไปกว่านั้น ปริมาณเซลล์ที่เกิดอะพอพโทซิสเพิ่มขึ้นหลังจากได้รับการรักษาด้วย IPA เป็นเวลา 24 ชั่วโมง เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม (ลูกศรสีขาว รูปเพิ่มเติมที่ 6B) โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า IPA ความเข้มข้น 1 mM สามารถกระตุ้นการเกิดอะพอพโทซิสของ HSC และย้อนกลับการเปลี่ยนแปลงของพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ที่เกิดจาก TGF-β1 ซึ่งเป็นการควบคุมขนาดและความซับซ้อนของเซลล์ ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการทำงานของ HSC
IPA เปลี่ยนแปลงขนาดเซลล์และความซับซ้อนของไซโตพลาสซึมในเซลล์ LX-2 ภาพตัวอย่างการวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมทรี การวิเคราะห์ใช้กลยุทธ์การกำหนดขอบเขตเฉพาะสำหรับเซลล์ LX-2: SSC-A/FSC-A เพื่อกำหนดประชากรเซลล์, FSC-H/FSC-A เพื่อระบุเซลล์คู่ และ SSC-H/FSC-H สำหรับการวิเคราะห์ขนาดเซลล์และความซับซ้อน เซลล์ถูกบ่มด้วย TGF-β1 (5 ng/ml) และ IPA 1 mM ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่ปราศจากซีรั่มเป็นเวลา 24 ชั่วโมง เซลล์ LX-2 ถูกกระจายไปยังควอแดรนต์ล่างซ้าย (SSC-H-/FSC-H-), ควอแดรนต์บนซ้าย (SSC-H+/FSC-H-), ควอแดรนต์ล่างขวา (SSC-H-/FSC-H+) และควอแดรนต์บนขวา (SSC-H+/FSC-H+) สำหรับการวิเคราะห์ขนาดเซลล์และความซับซ้อนของไซโตพลาสซึม B. วิเคราะห์รูปร่างของเซลล์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (flow cytometry) ด้วยเทคนิค FSC-H (การกระเจิงไปข้างหน้า, ขนาดเซลล์) และ SSC-H (การกระเจิงด้านข้าง, ความซับซ้อนของไซโตพลาสซึม) (30,000 เหตุการณ์) ข้อมูลแสดงในรูปค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน โดยทำการทดลองอิสระ 3 ครั้ง ทำการเปรียบเทียบทางสถิติโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (one-way ANOVA) และการทดสอบ Bonferroni post hoc *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 และ ****p < 0.0001
สารเมตาบอไลต์ในลำไส้ เช่น IPA กลายเป็นหัวข้อวิจัยที่ได้รับความสนใจอย่างมาก ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจมีการค้นพบเป้าหมายใหม่ในจุลินทรีย์ในลำไส้ ดังนั้นจึงเป็นเรื่องที่น่าสนใจที่ IPA ซึ่งเป็นสารเมตาบอไลต์ที่เราเชื่อมโยงกับภาวะพังผืดในตับในมนุษย์ [15] ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นสารต้านพังผืดที่มีศักยภาพในแบบจำลองสัตว์ [13, 14] ในที่นี้ เราได้แสดงให้เห็นเป็นครั้งแรกถึงความสัมพันธ์ระหว่าง IPA ในซีรั่มกับทรานสคริปโตมิกส์ของตับโดยรวมและการเมทิลเลชั่นของ DNA ในบุคคลที่เป็นโรคอ้วนที่ไม่มีโรคเบาหวานชนิดที่ 2 (T2D) โดยเน้นที่อะพอพโทซิส ไมโทฟาจี และอายุยืนยาว รวมถึงยีน AKT1 ที่อาจเป็นตัวเลือกในการควบคุมภาวะสมดุลของตับ ความแปลกใหม่ของการศึกษาของเราคือ เราได้แสดงให้เห็นถึงปฏิสัมพันธ์ของการรักษาด้วย IPA กับอะพอพโทซิส รูปร่างของเซลล์ พลังงานชีวภาพของไมโทคอนเดรีย และพลวัตในเซลล์ LX-2 ซึ่งบ่งชี้ถึงสเปกตรัมพลังงานที่ต่ำกว่าซึ่งเปลี่ยนฟีโนไทป์ของ HSC ไปสู่การไม่ทำงาน ทำให้ IPA เป็นตัวเลือกที่มีศักยภาพในการปรับปรุงภาวะพังผืดในตับ
เราพบว่าอะพอพโทซิส ไมโทฟาจี และอายุยืนยาวเป็นวิถีหลักที่สำคัญที่สุดที่อุดมด้วยยีนตับที่เกี่ยวข้องกับ IPA ในซีรั่มที่ไหลเวียน การหยุดชะงักของระบบควบคุมคุณภาพไมโทคอนเดรีย (MQC) อาจนำไปสู่ความผิดปกติของไมโทคอนเดรีย ไมโทฟาจี และอะพอพโทซิส ซึ่งส่งเสริมการเกิด MASLD [33, 34] ดังนั้น เราจึงสามารถคาดการณ์ได้ว่า IPA อาจมีส่วนเกี่ยวข้องในการรักษาสภาพการทำงานของเซลล์และความสมบูรณ์ของไมโทคอนเดรียผ่านอะพอพโทซิส ไมโทฟาจี และอายุยืนยาวในตับ ข้อมูลของเราแสดงให้เห็นว่ามีสองยีนที่พบได้ทั่วไปในการทดสอบทั้งสามครั้ง ได้แก่ YKT6 และ AKT1 เป็นที่น่าสังเกตว่า YKT6 เป็นโปรตีน SNARE ที่เกี่ยวข้องกับกระบวนการหลอมรวมของเยื่อหุ้มเซลล์ YKT6 มีบทบาทในออโตฟาจีและไมโตฟาจีโดยการสร้างคอมเพล็กซ์เริ่มต้นร่วมกับ STX17 และ SNAP29 บนออโตฟาโกโซม ซึ่งส่งเสริมการรวมตัวของออโตฟาโกโซมและไลโซโซม[35] นอกจากนี้ การสูญเสียการทำงานของ YKT6 ส่งผลให้ไมโตฟาจีบกพร่อง[36] ในขณะที่การเพิ่มขึ้นของ YKT6 เกี่ยวข้องกับความก้าวหน้าของมะเร็งตับ (HCC) โดยแสดงให้เห็นถึงการอยู่รอดของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น[37] ในทางกลับกัน AKT1 เป็นยีนที่มีปฏิสัมพันธ์ที่สำคัญที่สุดและมีบทบาทสำคัญในโรคตับ รวมถึงเส้นทางการส่งสัญญาณ PI3K/AKT วงจรเซลล์ การเคลื่อนย้ายเซลล์ การแพร่กระจาย การยึดเกาะเฉพาะจุด การทำงานของไมโตคอนเดรีย และการหลั่งคอลลาเจน[38–40] วิถีการส่งสัญญาณ PI3K/AKT ที่ถูกกระตุ้นสามารถกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) ซึ่งเป็นเซลล์ที่รับผิดชอบในการผลิตเมทริกซ์นอกเซลล์ (ECM) และการทำงานที่ผิดปกติของวิถีนี้อาจส่งผลให้เกิดและลุกลามของภาวะพังผืดในตับ[40] นอกจากนี้ AKT ยังเป็นหนึ่งในปัจจัยสำคัญในการอยู่รอดของเซลล์ที่ยับยั้งการตายของเซลล์แบบพึ่งพา p53 และการกระตุ้น AKT อาจเกี่ยวข้องกับการยับยั้งการตายของเซลล์ตับ[41, 42] ผลลัพธ์ที่ได้แสดงให้เห็นว่า IPA อาจมีส่วนเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ที่เกี่ยวข้องกับไมโทคอนเดรียในตับโดยส่งผลต่อการตัดสินใจของเซลล์ตับระหว่างการเข้าสู่ภาวะตายหรือการอยู่รอด ผลกระทบเหล่านี้อาจถูกควบคุมโดยยีน AKT และ/หรือ YKT6 ซึ่งมีความสำคัญต่อภาวะสมดุลของตับ
ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า IPA ความเข้มข้น 1 mM กระตุ้นให้เกิดอะพอพโทซิสและลดการหายใจของไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 โดยไม่ขึ้นกับการรักษาด้วย TGF-β1 เป็นที่น่าสังเกตว่าอะพอพโทซิสเป็นกลไกหลักในการแก้ไขภาวะพังผืดและการกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) และยังเป็นเหตุการณ์สำคัญในการตอบสนองทางสรีรวิทยาที่ย้อนกลับได้ของภาวะพังผืดในตับ [4, 43] ยิ่งไปกว่านั้น การฟื้นฟู BHI ในเซลล์ LX-2 หลังจากการรักษาแบบผสมผสานให้ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับบทบาทที่เป็นไปได้ของ IPA ในการควบคุมพลังงานชีวภาพของไมโทคอนเดรีย ภายใต้สภาวะพักและไม่ทำงาน เซลล์เม็ดเลือดโดยปกติจะใช้การฟอสโฟรีเลชันแบบออกซิเดชันของไมโทคอนเดรียเพื่อผลิต ATP และมีกิจกรรมการเผาผลาญต่ำ ในทางกลับกัน การกระตุ้น HSC จะเพิ่มการหายใจและการสังเคราะห์ของไมโทคอนเดรียเพื่อชดเชยความต้องการพลังงานของการเข้าสู่สภาวะไกลโคไลซิส [44] ข้อเท็จจริงที่ว่า IPA ไม่มีผลต่อศักยภาพการเผาผลาญและ ECAR บ่งชี้ว่าเส้นทางไกลโคไลซิสมีความสำคัญน้อยกว่า ในทำนองเดียวกัน การศึกษาอื่นแสดงให้เห็นว่า IPA 1 mM สามารถปรับการทำงานของห่วงโซ่การหายใจของไมโทคอนเดรียในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ เซลล์ตับของมนุษย์ (Huh7) และเซลล์บุผนังหลอดเลือดดำสะดือของมนุษย์ (HUVEC) ได้ อย่างไรก็ตาม ไม่พบผลกระทบของ IPA ต่อไกลโคไลซิสในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ ซึ่งบ่งชี้ว่า IPA อาจส่งผลต่อพลังงานชีวภาพของเซลล์ประเภทอื่น [45] ดังนั้น เราจึงคาดการณ์ว่า IPA 1 mM อาจทำหน้าที่เป็นตัวแยกส่วนทางเคมีอย่างอ่อน เนื่องจากสามารถลดการแสดงออกของยีนที่ก่อให้เกิดพังผืด รูปร่างของเซลล์ และพลังงานชีวภาพของไมโทคอนเดรียได้อย่างมีนัยสำคัญโดยไม่เปลี่ยนแปลงปริมาณของ mtDNA [46] สารแยกไมโทคอนเดรียสามารถยับยั้งการเกิดพังผืดที่เกิดจากการเพาะเลี้ยงและการกระตุ้น HSC [47] และลดการผลิต ATP ของไมโทคอนเดรียที่ถูกควบคุมหรือเหนี่ยวนำโดยโปรตีนบางชนิด เช่น โปรตีนแยก (UCP) หรืออะดีนีนนิวคลีโอไทด์ทรานสโลเคส (ANT) ขึ้นอยู่กับชนิดของเซลล์ ปรากฏการณ์นี้สามารถปกป้องเซลล์จากการตายของเซลล์และ/หรือส่งเสริมการตายของเซลล์ได้ [46] อย่างไรก็ตาม จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อชี้แจงบทบาทของ IPA ในฐานะสารแยกไมโทคอนเดรียในการยับยั้งการทำงานของเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด
จากนั้นเราได้ตรวจสอบว่าการเปลี่ยนแปลงในการหายใจของไมโทคอนเดรียสะท้อนให้เห็นในสัณฐานวิทยาของไมโทคอนเดรียในเซลล์ LX-2 ที่มีชีวิตหรือไม่ ที่น่าสนใจคือ การรักษาด้วย TGF-β1 เปลี่ยนแปลงสัดส่วนของไมโทคอนเดรียจากทรงกลมเป็นรูปทรงกลาง โดยมีการแตกแขนงของไมโทคอนเดรียลดลงและมีการแสดงออกของ DRP1 เพิ่มขึ้น ซึ่งเป็นปัจจัยสำคัญในการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรีย [48] ยิ่งไปกว่านั้น การแตกตัวของไมโทคอนเดรียเกี่ยวข้องกับความซับซ้อนของเครือข่ายโดยรวม และการเปลี่ยนจากการรวมตัวเป็นการแบ่งตัวมีความสำคัญต่อการกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) ในขณะที่การยับยั้งการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรียจะนำไปสู่การตายของเซลล์ HSC [49] ดังนั้น ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่าการรักษาด้วย TGF-β1 อาจทำให้ความซับซ้อนของเครือข่ายไมโทคอนเดรียลดลง โดยมีการแตกแขนงลดลง ซึ่งพบได้บ่อยในการแบ่งตัวของไมโทคอนเดรียที่เกี่ยวข้องกับเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) ที่ถูกกระตุ้น นอกจากนี้ ข้อมูลของเรายังแสดงให้เห็นว่า IPA สามารถเปลี่ยนสัดส่วนของไมโทคอนเดรียจากทรงกลมเป็นรูปร่างกลางได้ ส่งผลให้การแสดงออกของ OPA1 และ MFN2 ลดลง การศึกษาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าการลดระดับของ OPA1 อาจทำให้ศักยภาพของเยื่อหุ้มไมโทคอนเดรียลดลงและกระตุ้นให้เกิดอะพอพโทซิสของเซลล์[50] MFN2 เป็นที่ทราบกันดีว่ามีบทบาทในการรวมตัวของไมโทคอนเดรียและอะพอพโทซิส[51] ผลลัพธ์ที่ได้แสดงให้เห็นว่าการเหนี่ยวนำเซลล์ LX-2 โดย TGF-β1 และ/หรือ IPA ดูเหมือนจะปรับเปลี่ยนรูปร่างและขนาดของไมโทคอนเดรีย รวมถึงสถานะการทำงานและความซับซ้อนของเครือข่ายด้วย
ผลการศึกษาของเราบ่งชี้ว่า การรักษาแบบผสมผสานระหว่าง TGFβ-1 และ IPA สามารถลด mtDNA และพารามิเตอร์ทางสัณฐานวิทยาของเซลล์ได้โดยการควบคุมการแสดงออกของ mRNA ของยีนที่เกี่ยวข้องกับพังผืด การตายของเซลล์ และการอยู่รอดในเซลล์ที่หลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ แท้จริงแล้ว IPA ลดระดับการแสดงออกของ mRNA ของ AKT1 และยีนพังผืดที่สำคัญ เช่น COL1A2 และ MMP2 แต่เพิ่มระดับการแสดงออกของ CASP8 ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตายของเซลล์ ผลการศึกษาของเราแสดงให้เห็นว่า หลังจากได้รับการรักษาด้วย IPA การแสดงออกของ BAX ลดลง และการแสดงออกของ mRNA ของหน่วยย่อยในกลุ่ม TIMP1, BCL-2 และ NF-κB เพิ่มขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่า IPA สามารถกระตุ้นสัญญาณการอยู่รอดในเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) ที่หลีกเลี่ยงการตายของเซลล์ได้ โมเลกุลเหล่านี้อาจทำหน้าที่เป็นสัญญาณส่งเสริมการอยู่รอดในเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือดที่ถูกกระตุ้น ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับการแสดงออกของโปรตีนต้านการตายของเซลล์ที่เพิ่มขึ้น (เช่น Bcl-2) การแสดงออกของ BAX ที่ส่งเสริมการตายของเซลล์ที่ลดลง และการทำงานร่วมกันที่ซับซ้อนระหว่าง TIMP และ NF-κB [5, 7] IPA ออกฤทธิ์ผ่าน PXR และเราพบว่าการรักษาแบบผสมผสานด้วย TGF-β1 และ IPA เพิ่มระดับการแสดงออกของ mRNA ของ PXR ซึ่งบ่งชี้ถึงการยับยั้งการกระตุ้น HSC การส่งสัญญาณ PXR ที่ถูกกระตุ้นเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถยับยั้งการกระตุ้น HSC ทั้งในร่างกายและในหลอดทดลอง [52, 53] ผลลัพธ์ของเราบ่งชี้ว่า IPA อาจมีส่วนร่วมในการกำจัด HSC ที่ถูกกระตุ้นโดยการส่งเสริมการตายของเซลล์ ลดพังผืดและการเผาผลาญของไมโตคอนเดรีย และเพิ่มสัญญาณการอยู่รอด ซึ่งเป็นกระบวนการทั่วไปที่เปลี่ยนฟีโนไทป์ของ HSC ที่ถูกกระตุ้นให้เป็นฟีโนไทป์ที่ไม่ทำงาน คำอธิบายที่เป็นไปได้อีกประการหนึ่งสำหรับกลไกและบทบาทของ IPA ในการเกิดอะพอพโทซิสคือ IPA จะกำจัดไมโทคอนเดรียที่ทำงานผิดปกติโดยหลักผ่านทางไมโทฟาจี (เส้นทางภายใน) และเส้นทางการส่งสัญญาณ TNF ภายนอก (ตารางที่ 1) ซึ่งเชื่อมโยงโดยตรงกับเส้นทางการส่งสัญญาณการอยู่รอดของ NF-κB (รูปภาพเสริมที่ 7) ที่น่าสนใจคือ ยีนที่เกี่ยวข้องกับ IPA ที่ได้รับการเสริมคุณค่าสามารถกระตุ้นสัญญาณที่ส่งเสริมการเกิดอะพอพโทซิสและการอยู่รอดในเส้นทางการเกิดอะพอพโทซิส [54] ซึ่งบ่งชี้ว่า IPA อาจกระตุ้นเส้นทางการเกิดอะพอพโทซิสหรือการอยู่รอดโดยการโต้ตอบกับยีนเหล่านี้ อย่างไรก็ตาม วิธีที่ IPA กระตุ้นการเกิดอะพอพโทซิสหรือการอยู่รอดในระหว่างการกระตุ้น HSC และกลไกการทำงานของมันยังคงไม่ชัดเจน
IPA เป็นเมตาโบไลต์ของจุลินทรีย์ที่เกิดจากทริปโตเฟนในอาหารผ่านทางจุลินทรีย์ในลำไส้ การศึกษาแสดงให้เห็นว่า IPA มีคุณสมบัติต้านการอักเสบ ต้านอนุมูลอิสระ และควบคุมเอพิเจเนติกส์ในสภาพแวดล้อมของลำไส้[55] การศึกษาแสดงให้เห็นว่า IPA สามารถปรับเปลี่ยนการทำงานของเยื่อกั้นลำไส้และลดความเครียดจากออกซิเดชัน ซึ่งอาจมีส่วนช่วยให้เกิดผลทางสรีรวิทยาในระดับท้องถิ่น[56] ในความเป็นจริง IPA ถูกขนส่งไปยังอวัยวะเป้าหมายผ่านทางระบบไหลเวียนโลหิต และเนื่องจาก IPA มีโครงสร้างเมตาโบไลต์หลักที่คล้ายคลึงกับทริปโตเฟน เซโรโทนิน และอนุพันธ์ของอินโดล IPA จึงออกฤทธิ์ทางเมตาโบลิซึมส่งผลให้เกิดการแข่งขันทางเมตาโบลิซึม[52] IPA อาจแข่งขันกับเมตาโบไลต์ที่ได้จากทริปโตเฟนเพื่อจับกับตำแหน่งบนเอนไซม์หรือตัวรับ ซึ่งอาจรบกวนวิถีเมตาโบลิซึมปกติ สิ่งนี้เน้นย้ำถึงความจำเป็นในการศึกษาเพิ่มเติมเกี่ยวกับเภสัชจลนศาสตร์และเภสัชพลศาสตร์เพื่อให้เข้าใจช่วงการรักษาได้ดียิ่งขึ้น[57] ยังต้องดูกันต่อไปว่าปรากฏการณ์นี้จะเกิดขึ้นในเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSCs) ได้หรือไม่
เรายอมรับว่าการศึกษาของเรามีข้อจำกัดบางประการ เพื่อตรวจสอบความสัมพันธ์ที่เกี่ยวข้องกับ IPA โดยเฉพาะ เราได้ยกเว้นผู้ป่วยโรคเบาหวานประเภทที่ 2 (T2DM) เรายอมรับว่าสิ่งนี้จำกัดการนำผลการศึกษาไปใช้กับผู้ป่วยโรคเบาหวานประเภทที่ 2 และโรคตับขั้นรุนแรงได้อย่างกว้างขวาง แม้ว่าความเข้มข้นทางสรีรวิทยาของ IPA ในซีรั่มของมนุษย์จะอยู่ที่ 1–10 μM [11, 20] แต่เราเลือกใช้ความเข้มข้นของ IPA ที่ 1 mM โดยพิจารณาจากความเข้มข้นที่ไม่เป็นพิษสูงสุด [15] และอัตราการเกิดอะพอพโทซิสสูงสุด โดยไม่มีความแตกต่างในเปอร์เซ็นต์ของประชากรเซลล์ที่ตาย แม้ว่าจะใช้ระดับ IPA ที่สูงกว่าระดับทางสรีรวิทยาในการศึกษานี้ แต่ปัจจุบันยังไม่มีข้อสรุปเกี่ยวกับปริมาณ IPA ที่มีประสิทธิภาพ [52] แม้ว่าผลลัพธ์ของเราจะมีนัยสำคัญ แต่ชะตากรรมทางเมตาบอลิซึมที่กว้างขึ้นของ IPA ยังคงเป็นหัวข้อการวิจัยที่กำลังดำเนินอยู่ ยิ่งไปกว่านั้น ผลการค้นพบของเราเกี่ยวกับความสัมพันธ์ระหว่างระดับ IPA ในซีรั่มและการเมทิลเลชั่นของ DNA ในทรานสคริปต์ของตับนั้นได้มาจากเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) และเนื้อเยื่อตับด้วยเช่นกัน เราเลือกใช้เซลล์ LX-2 ของมนุษย์โดยอิงจากผลการค้นพบก่อนหน้านี้ของเราจากการวิเคราะห์ทรานสคริปโตมที่พบว่า IPA เกี่ยวข้องกับการกระตุ้นเซลล์ต้นกำเนิดเม็ดเลือด (HSC) [15] และ HSC เป็นเซลล์หลักที่เกี่ยวข้องกับการดำเนินไปของภาวะพังผืดในตับ ตับประกอบด้วยเซลล์หลายชนิด ดังนั้นแบบจำลองเซลล์อื่นๆ เช่น ระบบการเพาะเลี้ยงร่วมของเซลล์ตับ-HSC-เซลล์ภูมิคุ้มกัน ร่วมกับการกระตุ้นแคสเปสและการแตกตัวของ DNA รวมถึงกลไกการทำงานที่รวมถึงระดับโปรตีน ควรได้รับการพิจารณาเพื่อศึกษาบทบาทของ IPA และปฏิสัมพันธ์กับเซลล์ตับชนิดอื่นๆ