การคัดแยกโปรตีนในวิถีการหลั่งมีความสำคัญต่อการรักษาการแบ่งส่วนของเซลล์และภาวะสมดุล นอกเหนือจากการคัดแยกโดยอาศัยเปลือกหุ้มแล้ว บทบาทของลิปิดในการคัดแยกไคเนซินในกระบวนการขนส่งสารหลั่งเป็นคำถามพื้นฐานที่ยังไม่ได้รับคำตอบมานาน ในที่นี้ เราได้ทำการถ่ายภาพสามมิติแบบหลายสีความละเอียดสูงแบบเรียลไทม์พร้อมกัน เพื่อพิสูจน์ในร่างกายว่าโปรตีนที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ซึ่งตรึงอยู่บนไกลโคซิลฟอสฟาติดิลอิโนซิทอลและมีหมู่ลิปิดเซราไมด์ที่ยาวมาก จะรวมกลุ่มและถูกจำแนกไปยังตำแหน่งทางออกเฉพาะของเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม ซึ่งแตกต่างจากที่ใช้โดยโปรตีนที่อยู่ภายในเยื่อหุ้มเซลล์ นอกจากนี้ เรายังแสดงให้เห็นว่าความยาวของสายโซ่เซราไมด์ในเยื่อหุ้มเอนโดพลาสมิกเรติคูลัมมีความสำคัญต่อการเลือกคัดแยกนี้ การศึกษาของเราให้หลักฐานโดยตรงในร่างกายเป็นครั้งแรกในการจำแนกโปรตีนที่ขนส่งตามความยาวของสายโซ่ลิปิดไปยังตำแหน่งการส่งออกที่เลือกได้ในวิถีการหลั่ง
ในเซลล์ยูคาริโอติก โปรตีนที่สังเคราะห์ในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม (ER) จะถูกคัดแยกในระหว่างการขนส่งผ่านทางเดินการหลั่งเพื่อส่งไปยังปลายทางของเซลล์ที่เหมาะสม (1) นอกจากการคัดแยกโดยอาศัยการเคลือบแล้ว ยังมีการคาดการณ์กันมานานแล้วว่าลิปิดบางชนิดสามารถทำหน้าที่เป็นจุดออกที่เลือกได้โดยการรวมกลุ่มลิปิดเหล่านั้นเข้ากับโดเมนของเยื่อหุ้มเซลล์ที่เฉพาะเจาะจงซึ่งมีโปรตีนที่เฉพาะเจาะจง (2-5) อย่างไรก็ตาม ยังขาดหลักฐานโดยตรงในร่างกายเพื่อพิสูจน์กลไกที่ใช้ลิปิดเป็นพื้นฐานที่เป็นไปได้นี้ เพื่อแก้ปัญหาพื้นฐานนี้ เราได้ศึกษาในยีสต์ว่าโปรตีนที่ยึดด้วยไกลโคซิลฟอสฟาติดิลอิโนซิทอล (GPI) (GPI-APs) ถูกส่งออกจาก ER อย่างไร GPI-APs เป็นโปรตีนบนพื้นผิวเซลล์ที่เชื่อมต่อกับลิปิดหลายชนิด (6, 7) GPI-AP เป็นโปรตีนที่หลั่งออกมาซึ่งยึดติดกับชั้นนอกของเยื่อหุ้มพลาสมาผ่านส่วนประกอบไกลโคลิปิด (GPI anchor) พวกมันยอมรับ GPI anchors เป็นการดัดแปลงหลังการแปลแบบอนุรักษ์ในลูเมนของ ER (8) หลังจากยึดติดแล้ว GPI-AP จะผ่านเครื่องมือ Golgi (5, 9) จาก ER ไปยังเยื่อหุ้มเซลล์ การมีอยู่ของ GPI anchors ทำให้ GPI-AP ถูกขนส่งแยกจากโปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ (รวมถึงโปรตีนเยื่อหุ้มเซลล์อื่นๆ) ตามเส้นทางการหลั่ง (5, 9, 10) ในเซลล์ยีสต์ GPI-AP จะถูกแยกออกจากโปรตีนที่หลั่งอื่นๆ ในเอนโดพลาสมิกเรติคูลัม จากนั้นบรรจุลงในเวสิเคิลเฉพาะที่ห่อหุ้มด้วยโปรตีนคอมเพล็กซ์ II (COPII) (6, 7) ปัจจัยกำหนดกระบวนการจำแนกประเภทนี้ในกระบวนการส่งออกของ ER ยังไม่ชัดเจน แต่คาดการณ์ว่ากลไกนี้อาจต้องใช้ไขมัน โดยเฉพาะอย่างยิ่งการปรับโครงสร้างของส่วนไขมันของ GPI anchor (5, 8) ในยีสต์ การปรับโครงสร้างลิปิด GPI เริ่มต้นทันทีหลังจากที่ GPI เกาะติด และในหลายกรณี จะทำให้เซราไมด์จับกับกรดไขมันอิ่มตัวสายยาว 26 คาร์บอน (C26:0) (11, 12) เซราไมด์ C26 เป็นเซราไมด์หลักที่เซลล์ยีสต์ผลิตขึ้นจนถึงปัจจุบัน มันถูกสังเคราะห์ใน ER และส่วนใหญ่ถูกส่งออกไปยังเครื่องมือ Golgi ผ่านทางเวสิเคิล COPII (13) การส่งออก GPI-AP จาก ER โดยเฉพาะอย่างยิ่งต้องอาศัยการสังเคราะห์เซราไมด์อย่างต่อเนื่อง (14, 15) และในทางกลับกัน การเปลี่ยนเซราไมด์เป็นอิโนซิทอลฟอสเฟตเซราไมด์ (IPC) ในเครื่องมือ Golgi ขึ้นอยู่กับการสังเคราะห์ GPI anchor (16) การศึกษาทางชีวฟิสิกส์ด้วยเยื่อเทียมแสดงให้เห็นว่าเซราไมด์สายอะซิลที่ยาวมากสามารถรวมตัวกันเพื่อสร้างโดเมนที่มีระเบียบพร้อมคุณสมบัติทางกายภาพที่เป็นเอกลักษณ์ (17, 18) ข้อมูลเหล่านี้นำไปสู่สมมติฐานที่ว่าเซราไมด์ C26 และ GPI-AP ที่มีเซราไมด์ C26 ใช้คุณสมบัติทางกายภาพของพวกมันเพื่อรวมตัวกันเป็นบริเวณที่เป็นระเบียบหรือบริเวณในสภาพแวดล้อมของไขมันเยื่อหุ้ม ER ที่ค่อนข้างยุ่งเหยิง ซึ่งส่วนใหญ่ประกอบด้วยกลีเซอโรลิปิดสายสั้นและไม่อิ่มตัว (C16:1 และ C18:1) (19, 20) บริเวณเหล่านี้จะมุ่งเน้นไปที่ตำแหน่งทางออกของ ER ที่เฉพาะเจาะจง (ERES) ซึ่งเซราไมด์และ GPI-AP ที่มีเซราไมด์เป็นองค์ประกอบสามารถถูกขนส่งร่วมกันไปยังกอลจิในเวสิเคิล COPII ที่เฉพาะเจาะจงเดียวกัน (5)
ในการศึกษานี้ เราได้ทดสอบกลไกที่ใช้ลิปิดนี้โดยตรงโดยใช้กล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบเรียลไทม์ความละเอียดสูงพิเศษ (SCLIM) ซึ่งเป็นเทคนิคกล้องจุลทรรศน์ที่ทันสมัยที่สามารถสังเกตโปรตีนที่ติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์ได้พร้อมกัน ภาพสามมิติและสามมิติ (3D) มีความละเอียดและความเร็วสูงมากในเซลล์ที่มีชีวิต (21, 22)
เราได้ประยุกต์ใช้เทคโนโลยี SCLIM เป็นครั้งแรกเพื่อกำหนดเพิ่มเติมว่า GPI-AP ปกติที่มีกลุ่มเซราไมด์ C26 ถูกคัดกรองจากโปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์หลังจากออกจาก ER ใน S. cerevisiae อย่างไร เพื่อตรวจสอบการจำแนกประเภทของ ER เราใช้ระบบทางพันธุกรรมที่สามารถมองเห็นสารที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่เข้าสู่ ERES ในร่างกายได้โดยตรง (7, 23) ในฐานะสาร เราเลือก GPI-AP Gas1 ที่มีเซราไมด์ C26 เป็นพื้นฐานซึ่งติดฉลากด้วยโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) และโปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ Mid2 ซึ่งติดฉลากด้วยโปรตีนเรืองแสงอินฟราเรดใกล้ (iRFP) ซึ่งทั้งสองอย่างมีเป้าหมายที่เยื่อหุ้มพลาสมา (24–26) ในกลายพันธุ์ที่ไวต่ออุณหภูมิ sec31-1 สารทั้งสองนี้จะถูกแสดงออกภายใต้โปรโมเตอร์ที่เหนี่ยวนำด้วยกาแลคโตสและเครื่องหมาย ERES แบบคงที่ ที่อุณหภูมิสุดขั้ว (37°C) เนื่องจากการกลายพันธุ์ sec31-1 ส่งผลต่อการทำงานของส่วนประกอบเคลือบ COPII Sec31 เพื่อยับยั้งการงอกของ COPII และการส่งออก ER ทำให้สารที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่สะสมอยู่ที่ ER (23) หลังจากลดอุณหภูมิลงเหลือ 24°C เซลล์กลายพันธุ์ sec31-1 ฟื้นตัวจากบริเวณการหลั่ง และสารสังเคราะห์ใหม่ที่สะสมอยู่เริ่มถูกส่งออกจาก ER การแสดงภาพ CLIM แสดงให้เห็นว่า Gas1-GFP และ Mid2-iRFP ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ส่วนใหญ่ยังคงสะสมอยู่ใน ER ของเซลล์กลายพันธุ์ sec31-1 หลังจากบ่มที่ 37°C แล้วปล่อยออกมาที่ 24°C เป็นเวลา 5 นาที (รูปที่ 1) เนื่องจาก Mid2-iRFP กระจายอยู่ทั่วเยื่อหุ้ม ER และ Gas1-GFP กระจุกตัวและรวมตัวกันในบริเวณเยื่อหุ้ม ER ที่ไม่ต่อเนื่อง การกระจายตัวของพวกมันจึงแตกต่างกันอย่างสิ้นเชิง (รูปที่ 1, A ถึง C และวิดีโอเสริม S1) นอกจากนี้ ดังแสดงในรูปที่ 1D กลุ่ม Gas1-GFP ไม่มี Mid2-iRFP ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า GPI-AP และโปรตีนทรานส์เมมเบรนถูกแยกออกไปยังบริเวณเยื่อหุ้ม ER ที่แตกต่างกันตั้งแต่เนิ่นๆ กลุ่ม Gas1-GFP อยู่ติดกับ ERES เฉพาะที่ติดฉลากด้วยโปรตีนเคลือบ COPII Sec13 ของ mCherry (รูปที่ 1, E และ F และวิดีโอ S1) (23)
เซลล์ sec31-1 แสดงสารคัดหลั่งที่ถูกกระตุ้นด้วยกาแลคโตส ได้แก่ เซราไมด์ GPI-AP สายยาว (C26) Gas1-GFP (GPI-AP, สีเขียว) และโปรตีนทรานส์เมมเบรน Mid2-iRFP (TMP, สีน้ำเงิน) และการติดฉลาก ERES แบบสร้างสรรค์ Sec13-mCherry (ERES, สีม่วงแดง) นำไปบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นย้ายไปที่ 24°C และถ่ายภาพด้วย SCLIM ในอีก 5 นาทีต่อมา (A ถึง C) แสดงภาพรวมหรือภาพ 2 มิติเดี่ยวของระนาบ (A) ภาพฉาย 2 มิติของส่วนตัด z 10 ส่วน (B) หรือภาพครึ่งทรงกลมของเซลล์ 3 มิติของสารที่บรรจุและเครื่องหมาย ERES (C) แถบมาตราส่วน 1 μm (A และ B) หน่วยมาตราส่วนคือ 0.551 μm (C) (C) ตรวจพบ Gas1-GFP ในบริเวณหรือกลุ่ม ER ที่แยกจากกัน ในขณะที่ตรวจพบ Mid2-iRFP และกระจายอยู่ทั่วเยื่อหุ้ม ER (D) กราฟแสดงความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์สัมพัทธ์ของ Gas1-GFP และ Mid2-iRFP ในกลุ่ม Gas1-GFP ตามแนวลูกศรสีขาว (ซ้าย) AU คือหน่วยสุ่ม (E และ F) แสดงภาพ 3 มิติที่รวมสินค้าและเครื่องหมาย ERES เข้าด้วยกัน ตรวจพบกลุ่ม Gas1-GFP ใกล้กับ ERES ที่เฉพาะเจาะจง หน่วยมาตราส่วนคือ 0.551 μm (F) ลูกศรสีขาวทึบทำเครื่องหมายกลุ่ม Gas1-GFP ที่เกี่ยวข้องกับ ERES แผงตรงกลางและด้านขวาแสดงภาพ 3 มิติที่ขยายใหญ่ขึ้นและมุมมองที่หมุนของกลุ่ม Gas1-GFP ที่เลือกไว้
ความสัมพันธ์เชิงพื้นที่ที่ใกล้ชิดระหว่างกลุ่ม Gas1-GFP และ ERES เฉพาะเจาะจง บ่งชี้ว่า Gas1-GFP สามารถเข้าสู่ ERES ที่เลือกได้ ซึ่งแตกต่างจากการเลือกที่ Mid2-iRFP ใช้ในการออกจาก ER เพื่อตรวจสอบความเป็นไปได้นี้ เราได้ทำการวัดอัตราส่วนของ ERES สำหรับสินค้าเพียงหนึ่งหรือสองชนิด (รูปที่ 2, A ถึง C) เราพบว่า ERES ส่วนใหญ่ (70%) มีสินค้าเพียงชนิดเดียว ภาพด้านล่างของรูปที่ 2C แสดงตัวอย่างทั่วไปสองตัวอย่างของ ERES ที่มีเฉพาะ Gas1-GFP (รูปที่ 1) หรือเฉพาะ Mid2-iRFP (รูปที่ 2) ในทางตรงกันข้าม ประมาณ 20% ของ ERES มีสินค้าสองชนิดที่ทับซ้อนกันในพื้นที่เดียวกัน พบว่า ERES บางส่วน (10%) มีสินค้าสองชนิด แต่แยกกันอยู่ในพื้นที่ที่แตกต่างกันอย่างชัดเจน ดังนั้น การวิเคราะห์ทางสถิตินี้แสดงให้เห็นว่าหลังจากที่ ER ถูกส่งออกไปแล้ว GPI-AP Gas1-GFP และสินค้าที่อยู่ภายในเยื่อหุ้มเซลล์ Mid2-iRFP จะถูกแบ่งไปยัง ERES ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 2D) ประสิทธิภาพการคัดแยกนี้สอดคล้องกับการวิเคราะห์ทางชีวเคมีก่อนหน้านี้ (6) และการกำหนดทางสัณฐานวิทยา (7) เป็นอย่างมาก เรายังสามารถสังเกตพฤติกรรมของสินค้าที่ถูกกักกันที่เข้าสู่ ERES (รูปที่ 2E และวิดีโอ S2) รูปที่ 2E แสดงให้เห็นว่ามีเพียงส่วนเล็ก ๆ ของ Gas1-GFP (แผงที่ 3) หรือ Mid2-iRFP (แผงที่ 4) เท่านั้นที่เข้าสู่ ERES จากด้านหนึ่งและถูกจำกัดอยู่ในพื้นที่เฉพาะ แผงที่ 5 ของรูปที่ 2E แสดงให้เห็นว่าบางครั้งพบ Gas1-GFP และ Mid2-iRFP อยู่ใน ERES เดียวกัน แต่พวกมันเข้าจากด้านที่ต่างกันและกระจุกตัวอยู่ในบริเวณที่แยกจากกัน ซึ่งอาจแสดงถึงเวสิเคิล COPII ที่แตกต่างกัน เรายังยืนยันด้วยว่าการแยกและการจำแนก GPI-AP Gas1 ที่ใช้เซราไมด์ C26 ที่สังเกตได้ว่าเป็น ERES ที่เลือกนั้นมีความเฉพาะเจาะจง เนื่องจากสินค้าการหลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์อื่น ๆ เช่น โปรตีนเยื่อหุ้มพลาสมาที่ติดแท็ก GFP Axl2 (27) แสดงพฤติกรรมที่คล้ายกับ Mid2-iRFP (รูปภาพ S1 และวิดีโอ S3) Axl2-GFP ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่จะกระจายตัวผ่านเยื่อหุ้ม ER เช่นเดียวกับ Mid2-iRFP (รูปที่ S1, A และ B) และมีการอยู่ร่วมกันกับ Mid2-iRFP ใน ERES ส่วนใหญ่ (รูปที่ S1, B ถึง D) แผงที่ 1 และ 2 ของรูปที่ 1 S1C แสดงตัวอย่างทั่วไปสองตัวอย่างของ ERES ที่มีสารขนส่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์สองชนิดซ้อนทับกัน ในกรณีเหล่านี้ สารทั้งสองชนิดจะเข้าสู่ ERES พร้อมกัน (รูปที่ S1E, แผงที่ 3 และวิดีโอ S3)
เซลล์ sec31-1 ที่แสดงการหลั่งที่เหนี่ยวนำด้วยกาแลคโตส ได้แก่ Gas1-GFP (GPI-AP, สีเขียว) และ Mid2-iRFP (TMP, สีน้ำเงิน) และการติดฉลาก ERES แบบคงที่ Sec13-mCherry (ERES, สีม่วงแดง) ถูกวางไว้ที่ 37 °C หลังจากบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิ 37 °C แล้ว ย้ายไปที่ 24 °C เพื่อปลดปล่อยการปิดกั้นการหลั่ง และถ่ายภาพด้วย SCLIM หลังจาก 20 นาที (A ถึง C) ภาพฉาย 2 มิติที่เป็นตัวแทน (A; แถบมาตราส่วน 1 μm) หรือภาพซีกเซลล์ 3 มิติ (B และ C; หน่วยมาตราส่วน 0.456 μm) ของสารที่บรรจุและส่วนตัด z 10 ส่วนที่ทำเครื่องหมายด้วย ERES แผงด้านล่างใน (B) และแผงใน (C) แสดงภาพที่ประมวลผลแล้วเพื่อแสดงเฉพาะสารที่อยู่ใน ERES (สีม่วงแดง) [Gas1-GFP (สีเทา) และ Mid2-iRFP (สีฟ้าอ่อน)] (C) ลูกศรเปิด: ERES บรรทุกสินค้าเพียงชิ้นเดียว (1 ถึง 4) ลูกศรสีเทา: ERES บรรจุสินค้าที่แยกออกจากกัน (5) ลูกศรสีขาวทึบ: ERES บรรจุสินค้าที่อยู่ร่วมกัน ด้านล่าง: ERES เดี่ยวที่เลือกไว้บรรจุเฉพาะ Gas1-GFP (1) หรือ Mid2-iRFP (2) แถบมาตราส่วน 100 นาโนเมตร (D) การหาปริมาณของภาพถ่ายจุลทรรศน์ที่อธิบายไว้ใน (C) เปอร์เซ็นต์เฉลี่ยของ ERES ที่บรรจุสินค้าเพียงชิ้นเดียว (Gas1-GFP หรือ Mid2-iRFP) สินค้าที่แยกออกจากกัน และสินค้าที่ทับซ้อนกัน ในการทดลองอิสระสามครั้ง n=432 ใน 54 เซลล์ แถบแสดงข้อผิดพลาด = SD การทดสอบ t แบบสองหางที่ไม่จับคู่ *** P = 0.0002 (E) ภาพ 3 มิติของ ERES ที่เลือกไว้ของสินค้าที่ถูกกักกันซึ่งทำเครื่องหมายด้วย (C) Gas1-GFP (สีเขียว) (3) หรือ Mid2-iRFP (สีน้ำเงิน) (4) เข้าสู่ ERES (สีม่วงแดง) จากด้านหนึ่งและถูกจำกัดให้อยู่ในพื้นที่เล็กๆ ภายใน ERES บางครั้ง สัมภาระทั้งสองประเภทจะเข้าสู่ ERES เดียวกัน (5) จากด้านเดียวกันและถูกจำกัดให้อยู่ในพื้นที่ที่แยกออกจากกันภายใน ERES แถบมาตราส่วน 100 นาโนเมตร
ต่อไป เราได้ทดสอบสมมติฐานที่ว่าเซราไมด์สายยาวอะซิล (C26) ที่มีอยู่ในเยื่อหุ้ม ER เป็นตัวขับเคลื่อนการรวมกลุ่มและการจัดเรียง Gas1 เฉพาะใน ERES ที่เลือกไว้ เพื่อจุดประสงค์นี้ เราใช้สายพันธุ์ยีสต์ GhLag1 ที่ได้รับการดัดแปลง โดยที่เอนไซม์สังเคราะห์เซราไมด์ภายในเซลล์สองตัวคือ Lag1 และ Lac1 ถูกแทนที่ด้วย GhLag1 (ซึ่งเป็นโฮโมล็อกของ Lag1 ในฝ้าย) ส่งผลให้ได้สายพันธุ์ยีสต์ที่มีเซราไมด์ในเยื่อหุ้มเซลล์สั้นกว่าสายพันธุ์ปกติ (รูปที่ 3A) (28) การวิเคราะห์ด้วยแมสสเปกโทรเมตรี (MS) แสดงให้เห็นว่าในสายพันธุ์ปกติ 95% ของเซราไมด์ทั้งหมดเป็นเซราไมด์สายยาวมาก (C26) ในขณะที่ใน GhLag1 85% ของเซราไมด์เป็นเซราไมด์สายยาวมาก (C18 และ C16) มีเพียง 2% ของเซราไมด์เท่านั้นที่เป็นเซราไมด์สายยาวมาก (C26) แม้ว่าเซราไมด์ C18 และ C16 จะเป็นเซราไมด์หลักที่ตรวจพบในเยื่อหุ้มเซลล์ GhLag1 จนถึงปัจจุบัน การวิเคราะห์ MS ยังยืนยันว่า GPI anchor ของ Gas1-GFP ที่แสดงออกในสายพันธุ์ GhLag1 ประกอบด้วยเซราไมด์ C26 ซึ่งเทียบได้กับลิปิดชนิดป่า คุณภาพเหมือนกัน (รูปที่ 3A) (26) ดังนั้น นี่หมายความว่าเอนไซม์ปรับโครงสร้างเซราไมด์ Cwh43 มีความเลือกสูงสำหรับเซราไมด์ C26 ดังแสดงในรูปที่ 26 โดยจะรวม GPI anchor จากเซราไมด์ C26 จำนวนเล็กน้อยในสายพันธุ์ GhLag1 S2 (29) อย่างไรก็ตาม เยื่อหุ้มเซลล์ของ GhLag1 โดยพื้นฐานแล้วมีเพียงเซราไมด์ C18-C16 ในขณะที่ Gas1-GFP ยังคงมีเซราไมด์ C26 ข้อเท็จจริงนี้ทำให้สายพันธุ์นี้เป็นเครื่องมือที่เหมาะสมในการแก้ปัญหาความยาวของโซ่แอซิลของเซราไมด์ในเยื่อหุ้มเซลล์ใน ER โดยเฉพาะ บทบาทสมมุติของคลาสและการคัดแยก จากนั้น เราได้ศึกษาความสามารถของ C26 Gas1-GFP ในการสะสมเป็นกลุ่มใน GhLag1 ที่มีอัลลีลกลายพันธุ์ที่ไวต่ออุณหภูมิของ sec31-1 โดยใช้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์แบบธรรมดา ซึ่งมีเพียงสายโซ่ยาว (C18-C16) เท่านั้นที่มีอยู่ในเซราไมด์ของเยื่อหุ้ม ER (รูปที่ 3) เราสังเกตว่าใน sec31-1 นั้น Gas1-GFP ส่วนใหญ่จะรวมตัวกันเป็นกลุ่ม ในขณะที่ Gas1-GFP ใน sec31-1 GhLag1 ที่มีเซราไมด์ของเยื่อหุ้ม ER สายยาว (C18-C16) นั้นส่วนใหญ่ไม่ได้รวมตัวกันเป็นกลุ่มและกระจายอยู่ทั่วทั้งเยื่อหุ้ม ER กล่าวคือ เนื่องจากการรวมกลุ่มของเซราไมด์ C26 นั้นมีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับ ERES เฉพาะ (รูปที่ 1) เราจึงได้ตรวจสอบต่อไปว่ากระบวนการนี้อาจเกี่ยวข้องกับการทำงานของกลไกโปรตีนส่งออกของ ER ด้วยหรือไม่ GPI-AP ใช้ระบบ COPII พิเศษสำหรับการส่งออก ER ซึ่งถูกควบคุมอย่างแข็งขันโดยการปรับโครงสร้างของส่วนไกลแคนของ GPI anchor โดย Ted1 (30, 31) จากนั้น GPI-glycan ที่สร้างขึ้นใหม่จะถูกจดจำโดยคอมเพล็กซ์ตัวรับสินค้าแบบทรานส์เมมเบรน p24 ซึ่งจะคัดเลือก Lst1 ซึ่งเป็นไอโซฟอร์มเฉพาะของหน่วยย่อยหลักที่จับกับสินค้า COPII คือ Sec24 ทำให้เกิดเวสิเคิล COPII ที่อุดมไปด้วย GPI-AP (31-33) ดังนั้น เราจึงสร้างตัวกลายพันธุ์คู่ที่รวมการลบโปรตีนเดี่ยวเหล่านี้ (ส่วนประกอบคอมเพล็กซ์ p24 Emp24 เอนไซม์ปรับโครงสร้าง GPI-glycan Ted1 และหน่วยย่อย COPII เฉพาะ Lst1) เข้ากับสายพันธุ์กลายพันธุ์ sec31-1 และศึกษาว่าสามารถสร้าง GFP คลัสเตอร์ Gas1 ได้หรือไม่ (รูปที่ 3) เราสังเกตว่าใน sec31-1emp24Δ และ sec31-1ted1Δ นั้น Gas1-GFP ส่วนใหญ่ไม่ได้รวมกลุ่มกันและกระจายอยู่ทั่วเยื่อหุ้ม ER ดังที่เคยพบใน sec31-1 GhLag1 มาก่อน ในขณะที่ใน sec31-1lst1Δ นั้น Gas1-GFP มีลักษณะคล้ายกับ sec31-1 ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า นอกเหนือจากการมีอยู่ของเซราไมด์ C26 ในเยื่อหุ้ม ER แล้ว การรวมกลุ่มของ Gas1-GFP ยังต้องอาศัยการจับกับคอมเพล็กซ์ p24 ด้วย และไม่จำเป็นต้องมีการดึงดูด Lst1 โดยเฉพาะ จากนั้น เราได้สำรวจความเป็นไปได้ที่ความยาวของสายโซ่เซราไมด์ในเยื่อหุ้ม ER สามารถควบคุมการจับของ Gas1-GFP กับ p24 ได้ อย่างไรก็ตาม เราพบว่าการมีอยู่ของเซราไมด์ C18-C16 ในเยื่อหุ้มไม่ได้ส่งผลกระทบต่อ GPI-glycans ที่สร้างขึ้นใหม่โดยคอมเพล็กซ์ p24 (รูปที่ S3 และ S4, A และ B) หรือการจับกับ GPI-AP และการส่งออก GPI-AP ความสามารถในการคัดเลือก COPII ชนิดย่อย Lst1 (รูปที่ S4C) ดังนั้น การรวมกลุ่มที่ขึ้นอยู่กับเซราไมด์ C26 ไม่จำเป็นต้องมีการโต้ตอบของโปรตีนกับกลไกโปรตีนส่งออก ER ที่แตกต่างกัน แต่สนับสนุนกลไกการคัดแยกทางเลือกที่ขับเคลื่อนด้วยความยาวของลิปิด จากนั้น เราได้วิเคราะห์ว่าความยาวของสายอะซิลของเซราไมด์ในเยื่อหุ้ม ER มีความสำคัญต่อการจำแนก Gas1-GFP เป็น ERES ที่เลือกได้อย่างมีประสิทธิภาพหรือไม่ เนื่องจาก Gas1 ในสายพันธุ์ GhLag1 ที่มีเซราไมด์สายสั้นออกจาก ER และเข้าสู่เยื่อหุ้มพลาสมา (รูปที่ S5) เราเชื่อว่าหากการคัดแยกถูกขับเคลื่อนด้วยความยาวของสายอะซิลของเซราไมด์ Gas1 ในสายพันธุ์ GhLag1 สามารถถูกเปลี่ยนทิศทางและข้ามไปยังสินค้า ERES ที่มีเยื่อหุ้มเดียวกันได้
(A) เยื่อหุ้มเซลล์ของ GhLag1 ส่วนใหญ่ประกอบด้วยเซราไมด์ C18-C16 ที่สั้นกว่า ในขณะที่ GPI anchor ของ Gas1-GFP ยังคงมี IPC C26 เหมือนกับเซลล์ชนิดปกติ ด้านบน: การวิเคราะห์ความยาวของสายอะซิลของเซราไมด์ในเยื่อหุ้มเซลล์ของสายพันธุ์ปกติ (Wt) และ GhLag1p โดยใช้แมสสเปกโทรเมตรี (MS) ข้อมูลแสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของเซราไมด์ทั้งหมด ค่าเฉลี่ยจากการทดลองอิสระ 3 ครั้ง แถบแสดงข้อผิดพลาด = ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน การทดสอบ t แบบสองด้านที่ไม่จับคู่ **** P ＜0.0001 แผงด้านล่าง: การวิเคราะห์ MS ของความยาวของสายอะซิลของ IPC ที่มีอยู่ใน GPI anchor ของ Gas1-GFP (GPI-IPC) ที่แสดงออกในสายพันธุ์ปกติและ GhLag1p ข้อมูลแสดงถึงเปอร์เซ็นต์ของสัญญาณ IPC ทั้งหมด ค่าเฉลี่ยจากการทดลองอิสระ 5 ครั้ง แถบแสดงข้อผิดพลาด = ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน การทดสอบ t แบบสองด้านที่ไม่จับคู่ ns, ไม่มีความสำคัญ P = 0.9134 (B) ภาพถ่ายไมโครสโคปเรืองแสงของเซลล์ sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ และ sec31-1lst1Δ ที่แสดงออก Gas1-GFP ที่ถูกเหนี่ยวนำด้วยกาแลคโตส ถูกบ่มที่ 37°C เป็นเวลา 30 นาที แล้วจึงนำไปบ่มต่อที่อุณหภูมิ 24°C เพื่อทำการตรวจด้วยไมโครสโคปเรืองแสงตามปกติ ลูกศรสีขาว: กลุ่ม Gas1-GFP ใน ER ลูกศรเปิด: Gas1-GFP ที่ไม่ได้รวมกลุ่มกระจายอยู่ทั่วเยื่อหุ้ม ER แสดงให้เห็นการย้อมสีวงแหวนนิวเคลียสที่เป็นลักษณะเฉพาะของ ER แถบมาตราส่วน 5 μm (C) การหาปริมาณของภาพถ่ายไมโครสโคปที่อธิบายไว้ใน (B) เปอร์เซ็นต์เฉลี่ยของเซลล์ที่มีโครงสร้าง Gas1-GFP แบบจุด ในการทดลองอิสระสามครั้ง n≥300 เซลล์ แถบแสดงข้อผิดพลาด = SD การทดสอบ t แบบสองหางที่ไม่จับคู่ **** P ＜0.0001
เพื่อแก้ปัญหานี้โดยตรง เราได้ทำการแสดงภาพ SCLIM ของ Gas1-GFP และ Mid2-iRFP ใน GhLag1 ที่มีอัลลีลกลายพันธุ์ที่ไวต่ออุณหภูมิ sec31-1 (รูปที่ 4 และวิดีโอเสริม S4) หลังจากที่ ER ถูกเก็บรักษาไว้ที่ 37°C และปล่อยออกมาที่ 24°C แล้ว Gas1-GFP ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ส่วนใหญ่ไม่ได้รวมกลุ่มกันและกระจายไปทั่วเยื่อหุ้ม ER ดังที่สังเกตได้จากกล้องจุลทรรศน์ทั่วไป (รูปที่ 4, A และ B) นอกจากนี้ ERES จำนวนมาก (67%) ยังมีสารขนส่งสองชนิดอยู่ร่วมกัน (รูปที่ 4D) แผงที่ 1 และ 2 ของรูปที่ 4C แสดงตัวอย่างทั่วไปสองตัวอย่างของ ERES ที่มี Gas1-GFP และ Mid2-GFP ซ้อนทับกัน นอกจากนี้ สารขนส่งทั้งสองชนิดยังถูกดึงดูดเข้าไปใน ERES เดียวกัน (รูปที่ 4E แผงที่ 3 และวิดีโอเสริม S4) ดังนั้น ผลการศึกษาของเราจึงบ่งชี้ว่า ความยาวของสายโซ่แอซิลของเซราไมด์ในเยื่อหุ้ม ER เป็นปัจจัยสำคัญในการรวมกลุ่มและการจำแนกประเภทของโปรตีนใน ER
เซลล์ Sec31-1 GhLag1 ที่แสดงการหลั่งสารที่เกิดจากการกระตุ้นด้วยกาแลคโตส ได้แก่ Gas1-GFP (GPI-AP, สีเขียว) และ Mid2-iRFP (TMP, สีน้ำเงิน) และ Sec13-mCherry ที่ติดฉลาก ERES แบบคงที่ (ERES, สีม่วงแดง) บ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที ลดอุณหภูมิลงเหลือ 24°C เพื่อปล่อยสารหลั่ง และถ่ายภาพด้วย SCLIM หลังจาก 20 นาที (A ถึง C) ภาพฉาย 2 มิติที่เป็นตัวแทน (A; แถบมาตราส่วน 1 μm) หรือภาพซีกเซลล์ 3 มิติ (B และ C; หน่วยมาตราส่วน 0.45 μm) ของส่วนตัด z ทั้ง 10 ส่วนที่ทำเครื่องหมายด้วยสารที่บรรจุและ ERES แผงด้านล่างใน (B) และแผงใน (C) แสดงภาพที่ประมวลผลแล้วเพื่อแสดงเฉพาะสารที่อยู่ใน ERES (สีม่วงแดง) [Gas1-GFP (สีเทา) และ Mid2-iRFP (สีฟ้าอ่อน)] (C) ลูกศรสีขาวทึบ: ERES มีสินค้าทับซ้อนกัน ลูกศรเปิด: ERES มีสินค้าเพียงรายการเดียว แผงด้านล่าง: ERES ที่เลือกมีสินค้าทับซ้อนกัน (1 และ 2) ที่ทำเครื่องหมายไว้ใน (C) แถบมาตราส่วน 100 นาโนเมตร (D) การหาปริมาณของภาพถ่ายจุลทรรศน์ที่อธิบายไว้ใน (C) ในหน่วย sec31-1 และ sec31-1 GhLag1 มีสินค้าเพียงรายการเดียว (Gas1-GFP หรือ Mid2-iRFP) และเปอร์เซ็นต์เฉลี่ยของ ERES สำหรับสินค้าที่แยกเดี่ยวและสินค้าที่ทับซ้อนกัน ในการทดลองอิสระสามครั้ง n = 432 ใน 54 เซลล์ (sec31-1) และ n = 430 ใน 47 เซลล์ (sec31-1 GhLag1) แถบแสดงข้อผิดพลาด = ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน การทดสอบ t แบบสองหางที่ไม่จับคู่ *** P = 0.0002 (sec31-1) และ ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1) (E) ภาพสามมิติของ ERES ที่เลือกไว้ซึ่งมีสินค้าทับซ้อนกัน (3) ทำเครื่องหมายไว้ใน (C) Gas1-GFP (สีเขียว) และ Mid2-iRFP (สีน้ำเงิน) เข้าใกล้ ERES (สีม่วงแดง) จากด้านเดียวกันและอยู่ในพื้นที่จำกัดของ ERES เดียวกัน แถบมาตราส่วน 100 นาโนเมตร
การศึกษานี้ให้หลักฐานโดยตรงในสิ่งมีชีวิตว่าโปรตีนที่ขนส่งโดยใช้ไขมันเป็นฐานจะถูกจำแนกไปยังตำแหน่งการส่งออกที่เลือกไว้ในเส้นทางการหลั่ง และเผยให้เห็นถึงความสำคัญของความยาวของสายอะซิลต่อการเลือกจำแนกประเภท โดยใช้เทคนิคกล้องจุลทรรศน์ที่ทรงพลังและล้ำสมัยที่เรียกว่า SCLIM เราได้สาธิต Gas1-GFP ที่สังเคราะห์ขึ้นใหม่ (GPI-AP หลักของเยื่อหุ้มพลาสมาที่มีส่วนของไขมันเซราไมด์ที่มีสายอะซิลยาวมาก (C26)) ในยีสต์ บริเวณที่รวมกลุ่มกันใน ER ที่แยกจากกันจะเกี่ยวข้องกับ ERES เฉพาะ ในขณะที่โปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์จะกระจายอยู่ทั่วเยื่อหุ้ม ER (รูปที่ 1) นอกจากนี้ สินค้าทั้งสองประเภทนี้ยังเข้าสู่ ERES ที่แตกต่างกันอย่างเลือกสรร (รูปที่ 2) ความยาวของสายอะซิลของเซราไมด์ในเซลล์ในเยื่อหุ้มเซลล์ลดลงจาก C26 เป็น C18-C16 กลุ่ม Gas1-GFP ถูกแยกออกไปยังบริเวณ ER ที่แยกจากกัน และ Gas1-GFP ถูกส่งกลับไปยัง ER พร้อมกับโปรตีนทรานส์เมมเบรนผ่าน ERES เดียวกัน (รูปที่ 3 และรูปที่ 3) 4)
แม้ว่า GPI-AP จะใช้กลไกโปรตีนเฉพาะในการออกจาก ER แต่เราพบว่าการแยกที่ขึ้นอยู่กับเซราไมด์ C26 ไม่ได้อาศัยปฏิกิริยาโปรตีนที่แตกต่างกันซึ่งอาจนำไปสู่ความเชี่ยวชาญของ ERES (รูปที่ S4 และ S5) แต่ผลการค้นพบของเราสนับสนุนกลไกการจำแนกประเภททางเลือกที่ขับเคลื่อนโดยการรวมกลุ่มโปรตีนที่ใช้ไขมันเป็นฐานและการกีดกันสารอื่นๆ ในภายหลัง การสังเกตของเราบ่งชี้ว่าบริเวณหรือกลุ่ม Gas1-GFP ที่เกี่ยวข้องกับ ERES เฉพาะนั้นขาดโปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ Mid2-iRFP ซึ่งแสดงให้เห็นว่ากลุ่ม GPI-AP ที่ขึ้นอยู่กับเซราไมด์ C26 จะช่วยอำนวยความสะดวกในการเข้าสู่ ERES ที่เกี่ยวข้อง และในขณะเดียวกันก็กีดกันสารที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ไม่ให้เข้าสู่ ERES เฉพาะนี้ (รูปที่ 1 และ 2) ในทางตรงกันข้าม การมีอยู่ของเซราไมด์ C18-C16 ในเยื่อหุ้ม ER ไม่ได้ทำให้ GPI-AP ก่อตัวเป็นบริเวณหรือกลุ่ม ดังนั้นจึงไม่กีดกันหรือแทนที่โปรตีนที่หลั่งผ่านเยื่อหุ้มเซลล์ใน ERES เดียวกัน (รูปที่ 3 และ 4) ดังนั้น เราจึงเสนอว่าเซราไมด์ C26 เป็นตัวขับเคลื่อนการแยกและการจำแนกประเภทโดยการอำนวยความสะดวกในการรวมกลุ่มของโปรตีนที่เชื่อมโยงกับ ERES เฉพาะ
จะบรรลุการรวมกลุ่มที่ขึ้นอยู่กับเซราไมด์ C26 นี้ในบริเวณ ER ที่เฉพาะเจาะจงได้อย่างไร? แนวโน้มของเซราไมด์ในเยื่อหุ้มเซลล์ที่จะแยกออกจากกันในแนวด้านข้างอาจทำให้ GPI-AP และเซราไมด์ C26 ก่อตัวเป็นลิปิดขนาดเล็กและเรียงตัวอย่างเป็นระเบียบในทันทีในสภาพแวดล้อมลิปิดที่ไม่เป็นระเบียบมากขึ้นของเยื่อหุ้ม ER ซึ่งประกอบด้วยกลีเซอโรลิปิดที่สั้นกว่าและไม่อิ่มตัว กลุ่มที่มีคุณภาพ (17, 18) กลุ่มชั่วคราวขนาดเล็กเหล่านี้สามารถหลอมรวมกันเป็นกลุ่มที่ใหญ่ขึ้นและเสถียรมากขึ้นหลังจากจับกับคอมเพล็กซ์ p24 (34) สอดคล้องกับเรื่องนี้ เราแสดงให้เห็นว่า C26 Gas1-GFP จำเป็นต้องมีปฏิสัมพันธ์กับคอมเพล็กซ์ p24 เพื่อสร้างกลุ่มที่มองเห็นได้ขนาดใหญ่ขึ้น (รูปที่ 3) คอมเพล็กซ์ p24 เป็นโอลิโกเมอร์แบบเฮเทอโรไซกัสที่ประกอบด้วยโปรตีนทรานส์เมมเบรน p24 ที่แตกต่างกันสี่ชนิดในยีสต์ (35) ซึ่งให้การจับแบบหลายวาเลนซ์ ซึ่งสามารถนำไปสู่การเชื่อมโยงข้ามของกลุ่ม GPI-AP ขนาดเล็ก ทำให้เกิดกลุ่มที่เสถียรขนาดใหญ่ขึ้น (34) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรตีนเอ็กโทโดเมนของ GPI-AP อาจมีส่วนทำให้เกิดการรวมตัวกัน ดังที่แสดงให้เห็นในระหว่างการขนส่ง Golgi ในเซลล์เยื่อบุผิวที่มีขั้วของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม (36) อย่างไรก็ตาม เมื่อมีเซราไมด์ C18-C16 อยู่ในเยื่อหุ้ม ER เมื่อคอมเพล็กซ์ p24 จับกับ Gas1-GFP จะไม่เกิดคลัสเตอร์ขนาดใหญ่ที่แยกจากกัน กลไกพื้นฐานอาจขึ้นอยู่กับคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีเฉพาะของเซราไมด์สายอะซิลยาว การศึกษาทางชีวฟิสิกส์ของเยื่อหุ้มเทียมแสดงให้เห็นว่า แม้ว่าเซราไมด์สายอะซิลยาว (C24) และสั้น (C18-C16) สามารถทำให้เกิดการแยกเฟสได้ แต่มีเพียงเซราไมด์สายอะซิลยาว (C24) เท่านั้นที่สามารถส่งเสริมความโค้งสูงและการโค้งงอของฟิล์มเพื่อปรับรูปร่างฟิล์มใหม่ ผ่านการอ้างอิงซึ่งกันและกัน (17, 37, 38) มีการแสดงให้เห็นว่าเกลียวทรานส์เมมเบรนของ TMED2 ซึ่งเป็นโฮโมล็อกของมนุษย์ของ Emp24 มีปฏิสัมพันธ์แบบเลือกเฉพาะกับสฟิงโกไมอีลินที่ใช้เซราไมด์ C18 ในกลีบไซโตพลาสมิก (39) โดยใช้การจำลองพลศาสตร์โมเลกุล (MD) เราพบว่าทั้งเซราไมด์ C18 และ C26 สะสมอยู่รอบ ๆ กลีบไซโตพลาสมิกของเกลียวทรานส์เมมเบรนของ Emp24 และพวกมันมีความชอบที่คล้ายคลึงกัน (รูปที่ S6) เป็นที่น่าสังเกตว่าสิ่งนี้บ่งชี้ว่าเกลียวทรานส์เมมเบรนของ Emp24 สามารถนำไปสู่การกระจายตัวของลิปิดที่ไม่สมมาตรในเยื่อหุ้มเซลล์ นี่เป็นผลลัพธ์ล่าสุดที่ได้จากเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การจำลอง MD ที่คล้ายกันยังแสดงให้เห็นถึงการมีอยู่ของลิปิดอีเทอร์ (40) ดังนั้น เราจึงคาดการณ์ว่าเซราไมด์ C26 ในกลีบทั้งสองของ ER26 มีความเข้มข้นสูงในบริเวณนั้น เมื่อ GPI-AP ในลูมินัลโลบูลจับกับ p24 แบบหลายวาเลนซ์โดยตรง และการสะสมของเซราไมด์ C26 รอบ p24 ในไซโตพลาสมิกโลบูล จะสามารถส่งเสริมการรวมตัวของโปรตีนที่เกิดขึ้นพร้อมกัน และความโค้งของเยื่อหุ้มเซลล์จะถูกสร้างขึ้นผ่านทางนิ้ว (41) ทำให้ GPI-AP แยกออกเป็นบริเวณที่แยกจากกันซึ่งอยู่ติดกับ ERES ซึ่งยังเอื้อต่อบริเวณที่มีความโค้งสูงของเยื่อหุ้ม ER (42) รายงานก่อนหน้านี้สนับสนุนกลไกที่เสนอ (43, 44) การจับแบบหลายวาเลนซ์ของโอลิโกเลคติน เชื้อโรค หรือแอนติบอดีกับไกลโคสฟิงโกลิปิด (GSL) ที่ใช้เซราไมด์บนเยื่อหุ้มพลาสมาจะกระตุ้นการรวมตัวของ GSL ขนาดใหญ่ เพิ่มการแยกเฟส และทำให้เกิดการเสียรูปของเยื่อหุ้มเซลล์และการนำเข้าสู่ภายใน (44) Iwabuchi เป็นต้น (43) พบว่าในกรณีที่มีโซ่แอซิลยาว (C24) แต่ไม่ใช่โซ่แอซิลสั้น (C16) ลิแกนด์หลายวาเลนต์ที่จับกับแลคโตซิลเซราไมด์ GSL จะกระตุ้นให้เกิดการก่อตัวของคลัสเตอร์ขนาดใหญ่และการเว้าของเยื่อหุ้มเซลล์ และการส่งสัญญาณผ่านไซโตพลาสซึม Lyn บนแผ่นพับจะสอดประสานกันด้วยโซ่แอซิลในนิวโทรฟิลที่จับคู่กัน
ในเซลล์เยื่อบุผิวที่มีขั้วของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม ความเข้มข้นของเครือข่ายต่อต้านกอลจิ (TGN) ที่ระดับเยื่อหุ้มพลาสมาส่วนปลายจะควบคุมการแยกและการจัดเรียงของ GPI-AP (10, 45) การรวมกลุ่มนี้ถูกขับเคลื่อนโดยการเกิดโอลิโกเมอร์ของ GPI-AP (36) แต่ก็อาจขึ้นอยู่กับความยาวของสายโซ่เซราไมด์ที่เราพบในยีสต์ด้วย แม้ว่า GPI-AP ของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมจะมีตัวยึดที่ใช้ลิปิดอีเทอร์ และโครงสร้างทางเคมีของมันแตกต่างจากเซราไมด์ที่มีสายอะซิลยาวมาก แต่การศึกษาล่าสุดพบว่าลิปิดทั้งสองชนิดมีคุณสมบัติทางกายภาพและเคมีและหน้าที่ที่คล้ายคลึงกันในเชิงวิวัฒนาการ (40) ดังนั้น ส่วนของลิปิดอีเทอร์ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมอาจคล้ายกับเซราไมด์ C26 ในยีสต์ และบทบาทของมันคือการเชื่อมโยงกับเซราไมด์สายยาวในเยื่อหุ้มเซลล์เพื่อส่งเสริมการรวมกลุ่มและการจัดเรียงของ GPI-AP แม้ว่าความเป็นไปได้นี้ยังคงต้องได้รับการทดสอบโดยตรง แต่ผลการค้นพบก่อนหน้านี้สนับสนุนว่าการขนส่งเซราไมด์สายอะซิลยาวไปยังกอลจิบอดี้ไม่ได้ดำเนินการโดยโปรตีนถ่ายโอนไซโตพลาสมิก แต่ขึ้นอยู่กับการสังเคราะห์ GPI แองเคอร์เช่นเดียวกับยีสต์ ดังนั้นกลไกการอนุรักษ์เชิงวิวัฒนาการดูเหมือนจะสามารถขนส่งเซราไมด์สายอะซิลยาวมากและ GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) ร่วมกันในเวสิเคิลขนส่งเดียวกันได้อย่างเลือกสรร
ในระบบเซลล์เยื่อบุผิวที่มีขั้วของยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การรวมกลุ่มและการแยกตัวของ GPI-AP จากโปรตีนเยื่อหุ้มพลาสมาอื่นๆ เกิดขึ้นทั้งหมดก่อนที่จะถึงพื้นผิวเซลล์ Paladino et al. (48) พบว่าบน TGN ของเซลล์เยื่อบุผิวที่มีขั้วของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม การรวมกลุ่มของ GPI-AP ไม่เพียงแต่จำเป็นสำหรับการจำแนก GPI-AP ไปยังเยื่อหุ้มพลาสมาส่วนปลายเท่านั้น แต่ยังควบคุมการจัดระเบียบการรวมกลุ่มของ GPI-AP และกิจกรรมทางชีวภาพของมันบนพื้นผิวเซลล์ด้วย ในยีสต์ การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการรวมกลุ่มของ GPI-AP ที่ขึ้นอยู่กับเซราไมด์ C26 บน ER สามารถควบคุมการจัดระเบียบการรวมกลุ่มและกิจกรรมการทำงานของ GPI-AP บนเยื่อหุ้มพลาสมาได้ (24, 49) สอดคล้องกับแบบจำลองนี้ เซลล์ GhLag1 แพ้สารยับยั้ง GPI หรือยาที่ส่งผลต่อความสมบูรณ์ของผนังเซลล์ (28) และความจำเป็นของกลุ่ม Gas1-GFP ที่ทำงานได้ (49) ของเซราไมด์ปลายที่ฉายออกมาในการผสมพันธุ์ของเซลล์ยีสต์บ่งชี้ถึงผลทางสรีรวิทยาที่เป็นไปได้ของเซลล์ hLag1 ข้อผิดพลาด GPI-AP อย่างไรก็ตาม การทดสอบเพิ่มเติมว่าการจัดระเบียบการทำงานของพื้นผิวเซลล์ได้รับการตั้งโปรแกรมจาก ER โดยวิธีการคัดแยกตามความยาวของลิปิดหรือไม่ จะเป็นหัวข้อของการวิจัยในอนาคตของเรา
สายพันธุ์ Saccharomyces cerevisiae ที่ใช้ในงานวิจัยนี้แสดงอยู่ในตาราง S1 สายพันธุ์ MMY1583 และ MMY1635 ของ SCLIM สำหรับการถ่ายภาพเซลล์มีชีวิตถูกสร้างขึ้นในพื้นหลังของ W303 สายพันธุ์เหล่านี้ที่แสดงออก Sec13-mCherry พร้อมแท็กโปรตีนเรืองแสงถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีการแบบปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรส (PCR) โดยใช้พลาสมิด pFA6a เป็นแม่แบบ (23) สายพันธุ์ที่แสดงออก Mid2-iRFP ที่ติดฉลากด้วยโปรตีนเรืองแสงภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GAL1 ถูกสร้างขึ้นดังต่อไปนี้ การขยายลำดับ iRFP-KanMx ด้วย PCR จากเวกเตอร์ pKTiRFP-KAN (ได้รับจาก E. O'Shea, หมายเลขพลาสมิด Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; ตัวระบุทรัพยากรการวิจัย (RRID): Addgene_64687) และแทรกเข้าไปในปลาย C ของ Mid2 ภายในเซลล์ หลังจากที่ลำดับจีโนม Mid2-iRFP ถูกขยายและโคลนลงในโปรโมเตอร์ GAL1 แล้ว ก็ได้ทำการรวมเข้ากับไซต์ Not I-Sac I ของพลาสมิดสำหรับการรวมตัว pRS306 พลาสมิด pRGS7 ที่ได้ถูกทำให้เป็นเส้นตรงด้วย Pst I เพื่อรวมเข้ากับตำแหน่ง URA3
ยีนฟิวชั่น Gas1-GFP ถูกแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GAL1 ในพลาสมิดเซนโทรเมียร์ (CEN) ซึ่งสร้างขึ้นดังต่อไปนี้ ลำดับ Gas1-GFP ถูกขยายโดย PCR จากพลาสมิด pRS416-GAS1-GFP (24) (ได้รับจาก L. Popolo) และโคลนลงในไซต์ Xma I–Xho I ของพลาสมิด CEN pBEVY-GL LEU2 (ได้รับจาก C. Miller; หมายเลขพลาสมิด Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225) พลาสมิดที่ได้ถูกตั้งชื่อว่า pRGS6 ยีนฟิวชั่น Axl2-GFP ก็ถูกแสดงออกภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GAL1 ของเวกเตอร์ pBEVY-GL LEU2 เช่นกัน และการสร้างเป็นไปดังนี้ ลำดับ Axl2-GFP ถูกขยายจากพลาสมิด pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) โดยใช้ PCR และโคลนลงในไซต์ Bam HI-Pst I ของเวกเตอร์ pBEVY-GL LEU2 พลาสมิดที่ได้นั้นถูกตั้งชื่อว่า pRGS12 ลำดับของโอลิโกนิวคลีโอไทด์ที่ใช้ในการศึกษานี้แสดงอยู่ในตาราง S2
สายพันธุ์ดังกล่าวได้รับการเสริมด้วยอะดีนีน 0.2% และกลูโคส 2% [YP-dextrose (YPD)], ราฟฟิโนส 2% [YP-raffinose], โปรตีนสกัดจากยีสต์เข้มข้น (YP) (สารสกัดยีสต์ 1% และโปรตีนสกัด 2%) (YPR) หรือกาแลคโตส 2% [YP-galactose (YPG)] เป็นแหล่งคาร์บอน หรือในอาหารเลี้ยงเชื้อสังเคราะห์ขั้นต่ำ (เบสไนโตรเจนยีสต์ 0.15% และแอมโมเนียมซัลเฟต 0.5%) เพื่อเสริมกรดอะมิโนและเบสที่จำเป็นต่อโภชนาการ และมีกลูโคส 2% (อาหารเลี้ยงเชื้อกลูโคสสังเคราะห์ขั้นต่ำ) หรือกาแลคโตส 2% (อาหารเลี้ยงเชื้อกาแลคโตสสังเคราะห์ขั้นต่ำ) เป็นแหล่งคาร์บอน
สำหรับการถ่ายภาพแบบเรียลไทม์ เซลล์กลายพันธุ์ sec31-1 ที่ไวต่ออุณหภูมิซึ่งแสดงออกถึงโครงสร้างภายใต้โปรโมเตอร์ GAL1 ถูกเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ YPR ที่อุณหภูมิ 24°C ข้ามคืนจนถึงระยะกลางของการเจริญเติบโตแบบลอการิทึม หลังจากเหนี่ยวนำใน YPG ที่อุณหภูมิ 24°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เซลล์ถูกบ่มใน SG ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที แล้วจึงย้ายไปที่อุณหภูมิ 24°C เพื่อปลดปล่อยจากการปิดกั้นการหลั่ง ใช้คอนคาแนเวลิน เอ ในการตรึงเซลล์บนสไลด์แก้วและถ่ายภาพด้วย SCLIM SCLIM เป็นการผสมผสานระหว่างกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนซ์แบบกลับหัว Olympus IX-71 และเลนส์น้ำมัน UPlanSApo 100×1.4 ที่มีรูรับแสงเชิงตัวเลข (Olympus) เครื่องสแกนคอนโฟคอลแบบจานหมุนความเร็วสูงและอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสูง (Yokogawa Electric) สเปกโทรเมตรแบบกำหนดเอง และระบบระบายความร้อนแบบกำหนดเอง ตัวเพิ่มความเข้มของภาพของระบบ (Hamamatsu Photonics) สามารถให้ระบบเลนส์ขยายที่มีกำลังขยายสุดท้ายที่ ×266.7 และกล้องอุปกรณ์ประจุไฟฟ้าที่คูณอิเล็กตรอน (Hamamatsu Photonics) (21) การเก็บภาพดำเนินการโดยซอฟต์แวร์แบบกำหนดเอง (Yokogawa Electric) สำหรับภาพ 3 มิติ เราใช้แอคทูเอเตอร์แบบเพียโซอิเล็กทริกที่ทำขึ้นเองเพื่อสั่นเลนส์วัตถุในแนวตั้ง และรวบรวมชิ้นส่วนออปติคอลที่ห่างกัน 100 นาโนเมตรในกอง ภาพ Z-stack ถูกแปลงเป็นข้อมูล voxel 3 มิติ และฟังก์ชันการกระจายจุดเชิงทฤษฎีที่ใช้สำหรับกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลแบบจานหมุนถูกนำมาใช้ในการประมวลผล deconvolution โดยใช้ซอฟต์แวร์ Volocity (PerkinElmer) โดยใช้ซอฟต์แวร์ Volocity ในการกำหนดค่าเกณฑ์อัตโนมัติสำหรับการวิเคราะห์ตำแหน่งร่วม ทำให้สามารถวัด ERES รวมทั้งสารที่บรรจุอยู่ภายในได้ และทำการวิเคราะห์การสแกนเส้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ MetaMorph (Molecular Devices)
ใช้โปรแกรม GraphPad Prism เพื่อตรวจสอบนัยสำคัญทางสถิติ สำหรับการทดสอบ t ของ Student แบบสองด้านและการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว (ANOVA) ทั่วไป ความแตกต่างระหว่างกลุ่มจะถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อ P < 0.05 (*)
สำหรับการตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์ของ Gas1-GFP เซลล์ในระยะลอการิทึมจะถูกเพาะเลี้ยงข้ามคืนใน YPD และเก็บรวบรวมโดยการปั่นเหวี่ยง ล้างสองครั้งด้วยสารละลายบัฟเฟอร์ฟอสเฟต และบ่มบนน้ำแข็งอย่างน้อย 15 นาที จากนั้นจึงดำเนินการภายใต้กล้องจุลทรรศน์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ตรวจสอบ (24) ใช้กล้องจุลทรรศน์ Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ที่ติดตั้งเลนส์วัตถุ ฟิลเตอร์ L5 (GFP) กล้อง Hamamatsu และซอฟต์แวร์ Application Suite X (LAS X) ในการเก็บข้อมูล
ตัวอย่างถูกทำให้เสียสภาพด้วย SDS sample buffer ที่อุณหภูมิ 65°C เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นแยกด้วย SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) สำหรับการวิเคราะห์อิมมูโนบลอตติง โหลดตัวอย่าง 10 μl ต่อเลน แอนติบอดีหลัก: ใช้แอนติบอดีโพลีโคลนอลจากกระต่ายต่อต้าน Gas1 ที่ความเจือจาง 1:3000, แอนติบอดีโพลีโคลนอลจากกระต่ายต่อต้าน Emp24 ที่ความเจือจาง 1:500 และแอนติบอดีโพลีโคลนอลจากกระต่ายต่อต้าน GFP (ได้รับจาก H. Riezman) ที่ความเจือจาง 1:3000 แอนติบอดีโมโนโคลนอลจากเมาส์ต่อต้าน Pgk1 ใช้ในความเจือจาง 1:5000 (ได้รับจาก J. de la Cruz) แอนติบอดีรอง: อิมมูโนโกลบูลิน G (IgG) จากแพะต่อต้านกระต่ายที่เชื่อมต่อกับฮอร์สแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) ใช้ในความเจือจาง 1:3000 (Pierce) ใช้แอนติบอดี IgG ต่อต้านเมาส์จากแพะที่เชื่อมต่อกับ HRP ในอัตราส่วนเจือจาง 1:3000 (Pierce) สังเกตบริเวณการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันโดยใช้วิธีเคมีเรืองแสงของน้ำยา SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific)
ตามที่อธิบายไว้ใน (31) การทดลองอิมมูโนพรีซิปิเทชันตามธรรมชาติได้ดำเนินการกับเศษส่วน ER ที่เข้มข้น โดยสรุปคือ ล้างเซลล์ยีสต์ด้วยบัฟเฟอร์ TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride และส่วนผสมของสารยับยั้งโปรตีเอส] ที่ 600 nm (OD600) ที่ความหนาแน่นเชิงแสง 100 สองครั้ง จากนั้นทำให้เซลล์แตกด้วยลูกปัดแก้ว และกำจัดเศษเซลล์และลูกปัดแก้วออกโดยการปั่นเหวี่ยง จากนั้นนำสารละลายส่วนบนไปปั่นเหวี่ยงที่ 17,000 g เป็นเวลา 15 นาทีที่ 4°C นำตะกอนมาแขวนลอยใหม่ใน TNE และเติมดิจิทาลิสซาโปนินจนมีความเข้มข้นสุดท้าย 1% นำสารแขวนลอยไปบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงโดยหมุนวนที่อุณหภูมิ 4°C จากนั้นแยกส่วนประกอบที่ไม่ละลายออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 13,000 g ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 60 นาที สำหรับการตกตะกอนภูมิคุ้มกันของ Gas1-GFP ให้บ่มตัวอย่างล่วงหน้ากับลูกปัดอะกาโรสเปล่า (ChromoTek) ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อน จากนั้นบ่มกับ GFP-Trap_A (ChromoTek) ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ลูกปัดที่ตกตะกอนภูมิคุ้มกันแล้วจะถูกล้างห้าครั้งด้วย TNE ที่มีไดจอกซิเจนิน 0.2% จากนั้นชะล้างด้วยบัฟเฟอร์ตัวอย่าง SDS แยกบน SDS-PAGE และวิเคราะห์โดยอิมมูโนบลอตติง
ตามที่อธิบายไว้ใน (31) การกำหนดการเชื่อมโยงข้ามจะดำเนินการกับเศษส่วน ER ที่เข้มข้น โดยสรุป เศษส่วน ER ที่เข้มข้นจะถูกบ่มกับ dithiobis(succinimidyl propionate) 0.5 mM (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 นาที) ปฏิกิริยาการเชื่อมโยงข้ามจะถูกหยุดโดยการเติมไกลซีน (ความเข้มข้นสุดท้าย 50 mM, 5 นาที, 20°C)
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (50) ได้ทำการวิเคราะห์ MS ของเซราไมด์ในสายพันธุ์ป่าและสายพันธุ์ GhLag1 โดยสรุปคือ เซลล์ถูกเลี้ยงจนถึงระยะเอ็กซ์โพเนนเชียล (3 ถึง 4 หน่วย OD600/มล.) ใน YPD ที่อุณหภูมิ 30°C และเก็บเกี่ยวเซลล์จำนวน 25×107 เซลล์ การเผาผลาญของเซลล์ถูกยับยั้งด้วยกรดไตรคลอโรอะซิติก ใช้ตัวทำละลายสกัด [เอทานอล น้ำ อีเทอร์ ไพริดีน และแอมโมเนียมไฮดรอกไซด์ 4.2 N (15:15:5:1:0.018 v/v)] และเซราไมด์ C17 มาตรฐานภายใน 1.2 nmol (860517, Avanti polar lipid คุณภาพ) ใช้รีเอเจนต์โมโนเมทิลอะมีน [เมทานอล น้ำ n-บิวทานอล และสารละลายเมทิลอะมีน (4:3:1:5 v/v)] เพื่อทำการไฮโดรไลซิสแบบด่างอ่อนๆ ของสารสกัด จากนั้นใช้ n-บิวทานอลที่อิ่มตัวด้วยน้ำเพื่อกำจัดเกลือ สุดท้าย สารสกัดถูกละลายใหม่ในตัวทำละลายโหมดบวก [คลอโรฟอร์ม/เมทานอล/น้ำ (2:7:1) + แอมโมเนียมอะซิเตต 5 มิลลิโมลาร์] และฉีดเข้าไปในเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี ทำการตรวจสอบปฏิกิริยาหลายรายการ (MRM) เพื่อระบุและหาปริมาณโมเลกุลสฟิงโกลิปิด เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีแบบควอดรูโพลสามตัว TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ติดตั้งแหล่งกำเนิดไอออนนาโนโฟลว์แบบหุ่นยนต์ Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) สำหรับการวิเคราะห์ลิปิด พลังงานการชนถูกปรับให้เหมาะสมสำหรับเซราไมด์แต่ละประเภท ข้อมูล MS ได้รับในโหมดบวก สำหรับตัวอย่างทางชีวภาพแต่ละตัวอย่าง สัญญาณลิปิดคือค่ามัธยฐานของการวัดอิสระสามครั้ง
ตามที่อธิบายไว้ใน (31) เซลล์ (800×107) ที่แสดง Gas1-GFP จะถูกนำไปผ่านกระบวนการอิมมูโนพรีซิปิเทชันตามธรรมชาติ Gas1-GFP ที่บริสุทธิ์แล้วจะถูกแยกโดย SDS-PAGE และถ่ายโอนไปยังเยื่อโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์ (PVDF) โปรตีนจะถูกมองเห็นได้โดยการย้อม PVDF ด้วยอะไมด์แบล็ก แถบ Gas1-GFP ถูกตัดออกจาก PVDF และล้าง 5 ครั้งด้วยเมทานอลและ 1 ครั้งด้วยน้ำเกรด LC-MS (liquid chromatography-MS) โดยการบ่มแถบเยื่อด้วยบัฟเฟอร์ 0.3 M NaOAc (pH 4.0) 500 μl และส่วนผสมโซเดียมไนไตรต์ 1 M ที่ละลายใหม่ 500 μl ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ส่วนของไขมันจะถูกปล่อยออกจาก Gas1-GFP และสลายตัว การปล่อยเซราไมด์อินโนซีนฟอสเฟตระหว่างกลูโคซามีนและอินโนซิทอล (51) หลังจากนั้น แถบเมมเบรนถูกล้างสี่ครั้งด้วยน้ำเกรด LC-MS ตากให้แห้งที่อุณหภูมิห้อง และเก็บไว้ในบรรยากาศไนโตรเจนที่ -80°C จนกว่าจะทำการวิเคราะห์ เพื่อใช้ตัวอย่างเมมเบรน PVDF เปล่าเป็นตัวควบคุมในการทดลองแต่ละครั้ง จากนั้นจึงวิเคราะห์ลิปิดที่สกัดจาก Gas1-GFP ด้วย MS ตามที่อธิบายไว้ (50) โดยสรุปคือ แถบ PVDF ที่มี GPI-lipid ถูกแขวนลอยในตัวทำละลายแม่พิมพ์ลบ 75 μl [คลอโรฟอร์ม/เมทานอล (1:2) + แอมโมเนียมอะซิเตต 5 mM] และผ่านการวิเคราะห์สฟิงโกลิปิดชนิด ESI-MRM/MS (TSQ Vantage) ในกรณีนี้ ข้อมูล MS ได้รับในโหมดไอออนลบ
ดังที่กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ ส่วนลิปิดของ GPI anchor ถูกแยกออกจาก GPI-AP ที่ติดฉลาก [3H]-inositol (16) ลิปิดถูกแยกโดยโครมาโทกราฟีแบบแผ่นบางโดยใช้ระบบตัวทำละลาย (คลอโรฟอร์ม-เมทานอล-0.25% KCl ในอัตราส่วน 55:45:10) และมองเห็นได้โดยใช้ FLA-7000 (Fujifilm)
เซลล์ที่แสดงออก Gas1-GFP (600×10⁷) ถูกล้างสองครั้งด้วยบัฟเฟอร์ TNE จากนั้นทำให้แตกด้วยลูกปัดแก้ว และปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเศษเซลล์และลูกปัดแก้ว สารละลายส่วนบนถูกนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 17,000 g เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 4°C ตะกอนถูกล้างด้วย TNE และบ่มด้วย 1 U PI-PLC (Invitrogen) ใน TNE ที่มีดิจิทาลิสซาโปนิน 0.2% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C หลังจากการบำบัดด้วยเอนไซม์แล้ว เยื่อหุ้มเซลล์ถูกแยกออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 17,000 g ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อทำการอิมมูโนพรีซิปิเตต Gas1-GFP สารละลายส่วนบนถูกบ่มด้วย GFP-Trap_A (ChromoTek) ที่อุณหภูมิ 4°C ค้างคืน Gas1-GFP ที่บริสุทธิ์แล้วซึ่งแยกโดย SDS-PAGE ถูกย้อมด้วย Coomassie brilliant blue แถบย้อมสี Gas1-GFP ถูกตัดออกจากบริเวณสีเทาที่ล้อมรอบท่อส่งน้ำ จากนั้นหลังจากทำการอัลคิเลชันด้วยไอโอโดอะเซตาไมด์และรีดิวซ์ด้วยไดไทโอไทรทอลแล้ว จึงทำการย่อยด้วยทริปซินในเจล สกัดและทำให้เปปไทด์ทริปติกและเปปไทด์ที่มี GPI-ไกลแคนแห้ง เปปไทด์แห้งถูกละลายในน้ำ 20 ไมโครลิตร ฉีดส่วนหนึ่ง (8 ไมโครลิตร) เข้าสู่ LC ใช้คอลัมน์ออกตาเดซิลไซเลน (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 150 มม. × 1.0 มม.; Nomura Chemical, จังหวัดไอจิ ประเทศญี่ปุ่น) เพื่อแยกเปปไทด์ภายใต้สภาวะการไล่ระดับเฉพาะ เฟสเคลื่อนที่คือตัวทำละลาย A (กรดฟอร์มิก 0.08%) และตัวทำละลาย B (กรดฟอร์มิก 0.15% ในอะเซโตไนไตรล์ 80%) ใช้ระบบ Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ในการชะคอลัมน์ด้วยตัวทำละลาย A ภายใน 55 นาที ที่อัตราการไหล 50 μl min-1 เป็นเวลา 5 นาที จากนั้นจึงเพิ่มความเข้มข้นของตัวทำละลาย B เป็น 40% (สหรัฐอเมริกา) สารละลายที่ได้จากการชะจะถูกป้อนเข้าสู่แหล่งกำเนิดไอออน ESI อย่างต่อเนื่อง และเปปไทด์ที่ได้จากการย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินและเปปไทด์ที่มี GPI-glycans จะถูกวิเคราะห์โดย LTQ Orbitrap XL (เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีแบบไฮบริด linear ion trap-orbitrap; Thermo Fisher Scientific) ในการตั้งค่า MS แรงดันไฟฟ้าของแหล่งกำเนิดแคปิลลารีถูกตั้งไว้ที่ 4.5 kV และอุณหภูมิของแคปิลลารีถ่ายโอนถูกรักษาไว้ที่ 300°C แรงดันไฟฟ้าของแคปิลลารีและแรงดันไฟฟ้าของเลนส์ท่อถูกตั้งไว้ที่ 15 V และ 50 V ตามลำดับ ข้อมูล MS ได้รับในโหมดไอออนบวก (ความละเอียด 60,000; ความแม่นยำของมวล 10 ส่วนต่อล้าน) ในช่วงมวล 300/m/z อัตราส่วนมวลต่อประจุ (m/z) 3000 ข้อมูล MS/MS ได้รับผ่านกับดักไอออนใน LTQ Orbitrap XL [ตัวเลข 3 หลักแรกที่ข้อมูลขึ้นอยู่กับนั้น คือการแตกตัวเนื่องจากการชน (CID)]
การจำลอง MD ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ GROMACS (52) และฟิลด์แรง MARTINI 2 (53-55) จากนั้นใช้ CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) เพื่อสร้างไบเลเยอร์ที่มีไดโอเลออยล์ฟอสฟาติดิลโคลีน (DOPC) และ Cer C18 หรือ DOPC และ Cer C26 โครงสร้างและพิกัดของ Cer C26 ได้มาจาก DXCE โดยการลบลูกปัดส่วนเกินออกจากหางสฟิงโกซีน ใช้กระบวนการที่อธิบายไว้ด้านล่างเพื่อปรับสมดุลของชั้นคู่และเรียกใช้ จากนั้นใช้พิกัดสุดท้ายของระบบเพื่อสร้างระบบที่มี Emp24 โดเมนทรานส์เมมเบรนของยีสต์ Emp24 (เรซิเดนซ์ 173 ถึง 193) ถูกสร้างขึ้นเป็น α-helix โดยใช้โครงสร้างโมเลกุลของเครื่องมือ visual MD (VMD) (58) จากนั้น หลังจากลบลิปิดที่ทับซ้อนกันออก โปรตีนจะถูกทำให้เป็นเม็ดหยาบและแทรกเข้าไปในไบเลเยอร์โดยใช้ CHARMM GUI ระบบสุดท้ายประกอบด้วย DOPC 1202 และ Cer C26 302 หรือ DOPC 1197 และ Cer C18 และ Emp24 295 ทำการแตกตัวเป็นไอออนของระบบให้มีความเข้มข้น 0.150M ทำการทดลองซ้ำ 4 ครั้งสำหรับองค์ประกอบของไบเลเยอร์ 2 แบบ
ชั้นไขมันสองชั้นได้รับการปรับสมดุลโดยใช้กระบวนการ GUI ของ CHARMM ซึ่งเกี่ยวข้องกับการลดค่าต่ำสุดและปรับสมดุล 405,000 ขั้นตอน โดยที่ข้อจำกัดตำแหน่งจะค่อยๆ ลดลงและถูกกำจัดออกไป และขั้นตอนเวลาจะเพิ่มขึ้นจาก 0.005 ps เป็น 0.02 ps หลังจากปรับสมดุลแล้ว จะได้ผลลัพธ์ 6 µs ด้วยขั้นตอนเวลา 0.02 ps หลังจากใส่ Emp24 แล้ว ให้ใช้กระบวนการ GUI ของ CHARMM เดียวกันในการลดค่าต่ำสุดและปรับสมดุลระบบ จากนั้นรันเป็นเวลา 8 วินาทีในสภาพแวดล้อมการผลิต
สำหรับทุกระบบ ในระหว่างกระบวนการปรับสมดุล ความดันจะถูกควบคุมโดยบารอสแตท Berendsen (59) และในระหว่างกระบวนการผลิต ความดันจะถูกควบคุมโดยบารอสแตท Parrinello-Rahman (60) ในทุกกรณี ความดันเฉลี่ยคือ 1 บาร์ และใช้รูปแบบการเชื่อมต่อความดันแบบกึ่งไอโซโทรปิก ในกระบวนการปรับสมดุลและการผลิต จะใช้เทอร์โมสตัท (61) ที่มีการปรับเทียบความเร็วใหม่เพื่อเชื่อมต่ออุณหภูมิของอนุภาคโปรตีน ไขมัน และตัวทำละลายตามลำดับ ในระหว่างการทำงานทั้งหมด อุณหภูมิเป้าหมายคือ 310K ปฏิสัมพันธ์ที่ไม่ใช่พันธะจะถูกคำนวณโดยการสร้างรายการจับคู่โดยใช้รูปแบบ Verlet ที่มีค่าความคลาดเคลื่อนของบัฟเฟอร์ 0.005 เทอม Coulomb จะถูกคำนวณโดยใช้สนามปฏิกิริยาและระยะตัดที่ 1.1 นาโนเมตร เทอม Vander Waals ใช้รูปแบบการตัดที่มีระยะตัดที่ 1.1 นาโนเมตร และใช้รูปแบบการตัด Verlet สำหรับการเลื่อนศักยภาพ (62)
โดยใช้ VMD ความยาวคลื่นตัดระหว่างลูกปัดฟอสเฟต DOPC หรือลูกปัดเซราไมด์ AM1 กับโปรตีนคือ 0.7 นาโนเมตร และจำนวนลิปิดที่ทำปฏิกิริยากับโปรตีนจะถูกคำนวณ ตามสูตรต่อไปนี้ คำนวณปัจจัยการลดลง-เพิ่มขึ้น (DE) ดังใน (63): ปัจจัย DE = (ปริมาณลิปิดทั้งหมดในโปรตีน 0.7) ในโปรตีน 0.7 (ปริมาณ Cer ในลิปิดทั้งหมด)
ค่าที่รายงานได้มาจากการหาค่าเฉลี่ย และแถบแสดงความคลาดเคลื่อนคือค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SE) สี่ค่าที่เป็นอิสระต่อกัน ความสำคัญทางสถิติของปัจจัย DE คำนวณโดยใช้การทดสอบ t [(ค่าเฉลี่ย DE - ปัจจัย - 1) / SE] คำนวณค่า P จากการแจกแจงแบบหางเดียว
ใช้เครื่องมือ GROMACS ในการคำนวณแผนที่ความหนาแน่นด้านข้างแบบ 2 มิติของระบบที่มี Emp24 ภายใน 250 นาโนวินาทีสุดท้ายของข้อมูล เพื่อให้ได้แผนที่การเพิ่มขึ้น/ลดลงของเซราไมด์ แผนที่ความหนาแน่นของ Cer จะถูกหารด้วยผลรวมของแผนที่ Cer และ DOPC จากนั้นหารด้วยความเข้มข้นของ Cer ในร่างกาย โดยใช้มาตราส่วนสีเดียวกัน
สำหรับเอกสารประกอบเพิ่มเติมของบทความนี้ โปรดดูที่ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
บทความนี้เป็นบทความที่เข้าถึงได้โดยเสรี ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ซึ่งอนุญาตให้ใช้งาน แจกจ่าย และทำสำเนาซ้ำในสื่อใดๆ ก็ได้ ตราบใดที่การใช้งานขั้นสุดท้ายไม่ใช่เพื่อผลกำไรทางการค้า และข้อสมมติฐานคือผลงานต้นฉบับถูกต้อง อ้างอิง
หมายเหตุ: เราขอให้คุณระบุที่อยู่อีเมลของคุณก็เพื่อให้ผู้ที่คุณแนะนำไปยังเพจทราบว่าคุณต้องการให้พวกเขาเห็นอีเมลนั้นและไม่ใช่สแปม เราจะไม่เก็บรวบรวมที่อยู่อีเมลใดๆ ทั้งสิ้น
คำถามนี้ใช้เพื่อทดสอบว่าคุณเป็นผู้เยี่ยมชมหรือไม่ และเพื่อป้องกันการส่งสแปมโดยอัตโนมัติ
โซเฟีย โรดริเกซ-กัลลาร์โด้, คาซูโอะ คูโรคาวะ, ซูซาน่า ซาบิโด-โบโซ, อเลฮานโดร กอร์เตซ · โกเมซ (อเลฮานโดร กอร์เตส-โกเมซ), อัตสึโกะ อิเคดะ (อัตสึโกะ อิเคดะ), บาเลเรีย โซนี่ (วาเลเรีย โซนี่), ออซิเลียโดร่า อากีเลรา-โรเมโร, อานา มาเรีย เปเรซ -ลิเนโร), แซร์คิโอ โลเปซ (แซร์คิโอ โลเปซ), มิโฮ วาก้า (มิโฮะ วากะ), มิซาโกะ อาร์มาน (มิซาโกะ อาร์มาน), มิยาโกะ ริมาน (มิยาโกะ ริมาน), พราว อากิระ, สเตฟาโน แฟนนี่, อากิฮิโกะ นากาโนะ, มานูเอล มูนิซ
การสร้างภาพสามมิติความละเอียดสูงแบบเรียลไทม์เผยให้เห็นถึงความสำคัญของความยาวสายโซ่เซราไมด์ต่อการคัดแยกโปรตีนในตำแหน่งส่งออกที่เลือกไว้
โซเฟีย โรดริเกซ-กัลลาร์โด้, คาซูโอะ คูโรคาวะ, ซูซาน่า ซาบิโด-โบโซ, อเลฮานโดร กอร์เตซ · โกเมซ (อเลฮานโดร กอร์เตส-โกเมซ), อัตสึโกะ อิเคดะ (อัตสึโกะ อิเคดะ), บาเลเรีย โซนี่ (วาเลเรีย โซนี่), ออซิเลียโดร่า อากีเลรา-โรเมโร, อานา มาเรีย เปเรซ -ลิเนโร), แซร์คิโอ โลเปซ (แซร์คิโอ โลเปซ), มิโฮ วาก้า (มิโฮะ วากะ), มิซาโกะ อาร์มาน (มิซาโกะ อาร์มาน), มิยาโกะ ริมาน (มิยาโกะ ริมาน), พราว อากิระ, สเตฟาโน แฟนนี่, อากิฮิโกะ นากาโนะ, มานูเอล มูนิซ
การสร้างภาพสามมิติความละเอียดสูงแบบเรียลไทม์เผยให้เห็นถึงความสำคัญของความยาวสายโซ่เซราไมด์ต่อการคัดแยกโปรตีนในตำแหน่งส่งออกที่เลือกไว้
©2020 สมาคมอเมริกันเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ สงวนลิขสิทธิ์. AAAS เป็นหุ้นส่วนของ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef และ COUNTER วิทยาศาสตร์ก้าวหน้า ISSN 2375-2548