ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แตกต่างจากสัตว์มีกระดูกสันหลัง แมลงมักถูกมองว่าไม่มีฮอร์โมนสเตียรอยด์เพศที่เอนเอียงไปทางเพศผู้ ในยุง Anopheles gambiae สเตียรอยด์เอคไดโซน 20-ไฮดรอกซีเอคไดโซน (20E) ดูเหมือนจะวิวัฒนาการมาเพื่อควบคุมการพัฒนาของไข่เมื่อถูกสังเคราะห์โดยตัวเมีย² และเพื่อเหนี่ยวนำให้เกิดช่วงเวลาที่ไม่พร้อมผสมพันธุ์เมื่อถูกถ่ายทอดทางเพศโดยตัวผู้³ เนื่องจากการพัฒนาของไข่และการผสมพันธุ์เป็นลักษณะการสืบพันธุ์ที่สำคัญ การทำความเข้าใจว่ายุง Anopheles ตัวเมียผสานรวมสัญญาณฮอร์โมนเหล่านี้อย่างไร อาจช่วยในการออกแบบโปรแกรมควบคุมมาลาเรียแบบใหม่ได้ ที่นี่ เราเปิดเผยว่าหน้าที่การสืบพันธุ์เหล่านี้ถูกควบคุมโดยสเตียรอยด์เพศที่แตกต่างกันผ่านเครือข่ายที่ซับซ้อนของเอนไซม์ที่กระตุ้น/ยับยั้งเอคไดสเตียรอยด์ เราได้ระบุเอคไดโซนออกซิไดซ์เฉพาะตัวผู้ 3-ดีไฮโดร-20E (3D20E) ซึ่งปกป้องความเป็นพ่อแม่โดยการปิดกั้นการรับการผสมพันธุ์ของตัวเมียหลังจากการถ่ายทอดทางเพศและการกระตุ้นโดยการกำจัดฟอสเฟต ที่น่าสังเกตคือ การถ่ายทอด 3D20E นอกจากนี้ยังกระตุ้นการแสดงออกของยีนสืบพันธุ์ที่ช่วยรักษาการพัฒนาของไข่ในระหว่างการติดเชื้อพลาสโมเดียม ทำให้มั่นใจได้ว่าตัวเมียที่ติดเชื้อจะมีสุขภาพดี ฮอร์โมน 20E ที่สร้างจากตัวเมียไม่ได้กระตุ้นการตอบสนองทางเพศ แต่ช่วยให้ตัวที่ผสมพันธุ์สามารถวางไข่ได้หลังจากที่เอนไซม์ไคเนสที่ยับยั้ง 20E ถูกยับยั้ง การระบุฮอร์โมนสเตียรอยด์ของแมลงที่พบเฉพาะในตัวผู้และบทบาทของมันในการควบคุมการตอบสนองทางเพศ ความอุดมสมบูรณ์ และปฏิสัมพันธ์ของตัวเมียกับพลาสโมเดียม ชี้ให้เห็นถึงศักยภาพในการลดความสำเร็จในการสืบพันธุ์ของยุงที่เป็นพาหะนำโรคมาลาเรีย
จำนวนผู้ป่วยและผู้เสียชีวิตจากโรคมาลาเรียกำลังเพิ่มสูงขึ้นอีกครั้ง4 เนื่องจากการดื้อยาฆ่าแมลงอย่างแพร่หลายในยุงอะโนเฟลส์ ซึ่งเป็นพาหะเพียงชนิดเดียวของปรสิตมาลาเรียในมนุษย์ ชีววิทยาการผสมพันธุ์ของยุงเหล่านี้เป็นเป้าหมายที่น่าสนใจเป็นพิเศษสำหรับการแทรกแซงการควบคุมมาลาเรียแบบใหม่ เนื่องจากยุงตัวเมียผสมพันธุ์เพียงครั้งเดียว5 การทำให้การผสมพันธุ์ครั้งเดียวนี้เป็นหมันจะมีศักยภาพอย่างมากในการลดจำนวนประชากรยุงในพื้นที่
ผู้หญิงจะเกิดภาวะเสื่อมสมรรถภาพทางเพศหลังจากได้รับฮอร์โมนสเตียรอยด์ที่มีความเข้มข้นสูงจากผู้ชาย การศึกษาพบว่าตัวกระตุ้นให้เกิดความยากลำบากในการผสมพันธุ์ต่อไปคือ 20-ไฮดรอกซีเอ็กไดโซน (20E) ซึ่งเป็นฮอร์โมนสเตียรอยด์ที่รู้จักกันดีในฐานะตัวควบคุมวงจรการลอกคราบในระยะตัวอ่อน ความสามารถของตัวผู้ในการสังเคราะห์และถ่ายทอด 20E ได้วิวัฒนาการขึ้นโดยเฉพาะในสายพันธุ์ Anopheles ที่เป็นส่วนหนึ่งของสกุลย่อย Cellia7 ซึ่งกระจายอยู่ในแอฟริกาและรวมถึงพาหะนำโรคมาลาเรียที่อันตรายที่สุด เช่น Anopheles gambiae เรื่องนี้มีความสำคัญเป็นพิเศษเพราะในสายพันธุ์เหล่านี้ ตัวเมียก็ผลิต 20E หลังจากการดูดเลือดแต่ละครั้ง และ 20E เป็นตัวขับเคลื่อนวงจรการสร้างไข่ (ดูอ้างอิง 8) อย่างไรก็ตาม ยังมีข้อมูลน้อยมากเกี่ยวกับวิธีที่ตัวเมียรวมสัญญาณจากแหล่งเอ็กไดโซนสองแหล่งที่แตกต่างกัน (การถ่ายทอดจากตัวผู้และการกระตุ้นจากการดูดเลือด) โดยไม่กระทบต่อความสามารถในการผสมพันธุ์ของตนเอง ในความเป็นจริง หาก 20E ที่ผลิตโดยตัวเมียกระตุ้นให้เกิดภาวะไม่ทนต่อเพศ สิ่งนี้ จะนำไปสู่ภาวะมีบุตรยากในยุงที่ดูดเลือดจากตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ ซึ่งเป็นพฤติกรรมที่พบได้บ่อยมากในยุงเหล่านี้5
คำอธิบายที่เป็นไปได้คือ ตัวผู้ของ A. gambiae ถ่ายทอดเอคไดโซนที่ดัดแปลงเฉพาะตัวผู้ ซึ่งกระตุ้นกระบวนการส่งสัญญาณในระบบสืบพันธุ์ของตัวเมีย ส่งผลให้เกิดความไม่เสถียรในการผสมพันธุ์ อย่างไรก็ตาม แม้ว่าสัตว์มีกระดูกสันหลังจะมีฮอร์โมนสเตียรอยด์หลายชนิด เช่น เอสโตรเจนและแอนโดรเจน (ดูในเอกสารอ้างอิงที่ 9) แต่เท่าที่เรารู้ ยังไม่มีการระบุสเตียรอยด์ที่มีแนวโน้มไปทางแอนโดรเจนในแมลง
เราตั้งเป้าหมายที่จะกำหนดกลุ่มของฮอร์โมนสเตียรอยด์ในต่อมเสริมเพศผู้ (MAG) ของ A. gambiae ที่เจริญพันธุ์เต็มที่ เพื่อค้นหาสเตียรอยด์ที่อาจปรับเปลี่ยนได้ โดยใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงร่วมกับแมสสเปกโทรเมตรีแบบคู่ (HPLC-MS/MS) แทนวิธีการที่ไม่เฉพาะเจาะจงเท่าที่เคยใช้มาก่อน เราตรวจพบเอคไดโซน (E) และ 20E ในเนื้อเยื่อนี้ ซึ่งยืนยันผลลัพธ์ก่อนหน้านี้ อย่างไรก็ตาม ตัวอย่างส่วนใหญ่ประกอบด้วยสเตียรอยด์ฟอสฟอริเลตที่ถูกออกซิไดซ์ ซึ่งสอดคล้องกับสูตร 3-ดีไฮโดร-20E-22-ฟอสเฟต (3D20E22P)12 (รูปที่ 1) รูปแบบอื่นๆ ได้แก่ 3-ดีไฮโดร-20E (3D20E) และ 20E-22-ฟอสเฟต (20E22P) ความเข้มของสัญญาณ HPLC-MS/MS ของ 3D20E22P สูงกว่ารูปแบบที่ไม่มีฟอสเฟต 3D20E ถึงสองลำดับความ magnitud และสามลำดับ มีปริมาณสูงกว่า E และ 20E อย่างมาก (รูปที่ 1) แม้ว่าจะพบในส่วนอื่นๆ ของร่างกายและระบบสืบพันธุ์ส่วนล่าง (LRT; รูปภาพเพิ่มเติม 1a) เรายังวิเคราะห์เอคไดสเตอรอยด์ในตัวผู้และตัวเมียที่เพิ่งปิดรังไข่ (<1 วัน) และตรวจพบ 3D20E และ 3D20E22P เฉพาะใน MAG เท่านั้น ส่วน E, 20E และ 20E22P พบในทั้งสองเพศ (รูปภาพเพิ่มเติม 1b) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าตัวผู้ A. gambiae ที่โตเต็มวัยผลิตฮอร์โมนปรับเปลี่ยนในปริมาณสูงใน MAG ซึ่งตัวเมียไม่สามารถสังเคราะห์ได้
เนื้อเยื่อ MAG และ LRT ของตัวเมีย (รวมถึงเอเทรียม ถุงน้ำอสุจิ และพาราวาเรียม) ถูกแยกออกจากตัวผู้ที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์อายุ 4 วัน และตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์และผสมพันธุ์แล้ว (0.5, 3 และ 12 ชั่วโมงหลังการผสมพันธุ์) วิเคราะห์เอคไดโซนในเนื้อเยื่อเหล่านี้โดยใช้ HPLC-MS/MS (ค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน; การทดสอบ t แบบไม่จับคู่ สองด้าน แก้ไขอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR); NS ไม่มีความสำคัญทางสถิติ; *P < 0.05, **P < 0.01 3D20E: 3 ชั่วโมง เทียบกับ 0.5 ชั่วโมง, P = 0.035; 12 ชั่วโมง เทียบกับ 3 ชั่วโมง, P = 0.0015; 12 ชั่วโมง เทียบกับ 0.5 ชั่วโมง, P = 0.030 3D20E22P: 3 ชั่วโมง เทียบกับ 0.5 ชั่วโมง, P = 0.25; 12 ชั่วโมง เทียบกับ 3 ชั่วโมง ชั่วโมง, P = 0.0032; 12 ชั่วโมง เทียบกับ 0.5 ชั่วโมง, P = 0.015) ข้อมูลได้มาจากตัวอย่างทางชีววิทยา 3 ชุด พื้นที่สูงสุดของเอคไดโซนแต่ละชนิดที่สนใจถูกคำนวณและปรับให้เป็นมาตรฐานตามจำนวนยุง เอคไดโซนแสดงด้วยสีดังนี้: E, สีเขียว; 20E, สีส้ม; 20E22P, สีม่วง; 3D20E, สีน้ำเงิน; 3D20E22P, สีชมพู ภาพแทรกเพิ่มขนาดบนแกน y เพื่อแสดงระดับเอคไดโซนที่ต่ำกว่า
เพื่อตรวจสอบว่า 3D20E22P และ 3D20E ถูกถ่ายทอดระหว่างการผสมพันธุ์หรือไม่ เราจึงผ่าแยกต่อมน้ำเหลืองของตัวเมียในช่วงเวลาต่างๆ หลังการผสมพันธุ์ แม้ว่าจะไม่พบฮอร์โมนเอคไดโซนในตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ แต่เราสังเกตเห็นปริมาณ 3D20E22P จำนวนมากในต่อมน้ำเหลืองทันทีหลังการผสมพันธุ์ (0.5 ชั่วโมงหลังการผสมพันธุ์) ซึ่งลดลงเมื่อเวลาผ่านไป ในขณะที่ระดับของ 3D20E เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 1) เมื่อใช้ 3D20E ที่สังเคราะห์ทางเคมีเป็นมาตรฐาน เราพบว่าระดับของฮอร์โมนสเตียรอยด์นี้ในต่อมน้ำเหลืองที่ผสมพันธุ์นั้นสูงกว่า 20E อย่างน้อย 100 เท่า (ตารางข้อมูลเพิ่มเติม 1) ดังนั้น 3D20E22P จึงเป็นเอคไดโซนตัวผู้หลักที่ถูกถ่ายทอดไปยังต่อมน้ำเหลืองตัวเมียระหว่างการผสมพันธุ์ และรูปแบบที่ปราศจากฟอสเฟตของมันคือ 3D20E จะมีปริมาณมากในเวลาไม่นานหลังการผสมพันธุ์ ซึ่งชี้ให้เห็นถึงบทบาทสำคัญของเอคไดโซนตัวหลังในตัวเมีย ชีววิทยาหลังการผสมพันธุ์
หลังจากสร้างชุดข้อมูลการจัดลำดับ RNA (RNA-seq) ใหม่ (รูปที่ 2a) โดยใช้ไปป์ไลน์ชีวสารสนเทศที่สร้างขึ้นเอง เราได้ค้นหายีน ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO) และยีน ecdysone encoding 20E-modified phosphatase (EPP) ซึ่งแสดงออกในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ เราได้ระบุยีน EPP ที่เป็นตัวเลือกหนึ่งยีนและยีน EcK ที่มีศักยภาพสองยีน (EcK1 และ EcK2) แต่ไม่สามารถหายีน EO ที่เป็นตัวเลือกที่ดีได้ ที่น่าสังเกตคือ ยีน EPP แต่ละตัวแสดงออกในระดับสูง (เปอร์เซ็นไทล์ที่ 98.9) ใน MAG ของแกมเบีย แต่ไม่พบใน LRT ของเพศเมีย (รูปที่ 2b) ซึ่งขัดกับความคาดหวังของเรา เนื่องจาก dephosphorylation ของ 3D20E22P เกิดขึ้นในเนื้อเยื่อเพศเมียนี้ ดังนั้น เราเชื่อว่า EPP ของเพศผู้สามารถถ่ายทอดได้ในระหว่างการผสมพันธุ์ อันที่จริง เราใช้การติดฉลากไอโซโทปเสถียรในร่างกายเพื่อปิดบังโปรตีนเพศเมียหลังจากนั้น การผสมพันธุ์ เอนไซม์ที่ระบุโดย MS ในห้องหัวใจของตัวเมีย (รูปที่ 2c และตารางเสริม 1) การมีอยู่ของ EPP ใน MAG และ LRT ของตัวเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว (แต่ไม่ใช่ตัวเมียที่ยังไม่ผสมพันธุ์) ได้รับการยืนยันโดยใช้แอนติบอดีจำเพาะ (รูปที่ 2d)
a, กระบวนการประมวลผลข้อมูลชีวภาพที่สร้างขึ้นเองเพื่อค้นหายีนที่เข้ารหัส EcK, EO และ EPP ในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของแต่ละเพศ ตัวเลขที่อยู่ถัดจากลูกศรแสดงจำนวนผู้สมัครเพศผู้และเพศเมียในแต่ละขั้นตอน การวิเคราะห์นี้ระบุยีน EPP หนึ่งยีน (EPP) และยีน EcK หนึ่งยีน (EcK1) ที่แสดงออกในเพศผู้ และยีน EcK หนึ่งยีน (EcK2) ที่แสดงออกในทั้งสองเพศ แต่ไม่พบยีน EO ที่เป็นไปได้ b, แผนภูมิความร้อนเปรียบเทียบการแสดงออกของยีนที่เป็นไปได้ในเนื้อเยื่อ Anopheles gambiae และ Anopheles albicans ที่ยังไม่ผสมพันธุ์ (V) และผสมพันธุ์แล้ว (M) Spca, การปฏิสนธิ; MAGs, ต่อมเสริมในเพศผู้; ส่วนอื่นๆ ของร่างกาย รวมถึงเต้านม ปีก ขา เนื้อเยื่อไขมัน และอวัยวะภายในในทั้งสองเพศ และรังไข่ในเพศเมีย EcK2 มีการแสดงออกสูงทั้งใน MAG และ atria ของ Gambia ในขณะที่ EPP พบเฉพาะใน MAG เท่านั้น c การวิเคราะห์โปรตีนของกลุ่มน้ำอสุจิที่เคลื่อนย้ายไปยัง atria ของเพศเมียที่ 3, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิ แสดงโปรตีนที่พบมากที่สุด 67 ชนิด เพศเมียถูกเลี้ยงด้วยอาหารที่มี 15N เพื่อติดฉลาก (และปิดบัง) โปรตีนทั้งหมด เพศผู้ที่ไม่ติดฉลากถูกผสมพันธุ์กับเพศเมียที่ติดฉลาก และ LRT ของเพศเมียถูกผ่าที่ 3, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการปฏิสนธิเพื่อการวิเคราะห์โปรตีน (ดูตารางเสริม 1 สำหรับรายการโปรตีนในน้ำอสุจิทั้งหมด) ภาพแทรก ตรวจพบ EPP, Eck1 และ EcK2 ใน MAG ของเพศผู้ที่ยังไม่ผสมพันธุ์โดยการวิเคราะห์โปรตีนของเนื้อเยื่อเหล่านี้ d ตรวจพบ EPP โดยวิธี western blot ใน MAG และ LRT ของเพศเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว แต่ ไม่พบในตัวเมียหรือตัวผู้ที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ หรือในส่วนอื่นๆ ของร่างกายตัวเมีย มีการตรวจสอบเมมเบรนพร้อมกันด้วยแอนติบอดีต่อแอคติน (ตัวควบคุมการโหลด) และแอนติบอดีต่อ EPP ตัวผู้ทั้งหมดยังไม่เคยผสมพันธุ์ ดูรูปที่ 1 ในเอกสารประกอบเพิ่มเติมสำหรับข้อมูลแหล่งที่มาของเจล ทำการวิเคราะห์เวสเทิร์นบลอตสองครั้งโดยได้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกัน
กิจกรรมของเอนไซม์ ecdysteroid phosphophosphatase ของ EPP ได้รับการยืนยันหลังจากการบ่มด้วย HPLC-MS/MS ร่วมกับ 3D20E22P ที่แยกได้จาก MAG (รูปภาพเพิ่มเติม 2a) นอกจากนี้ เมื่อเรายับยั้งการทำงานของ EPP ด้วยการรบกวนผ่าน RNA (RNAi) เราตรวจพบการลดลงอย่างมากของกิจกรรมฟอสฟาเทสในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของยุงตัวผู้เหล่านี้ (รูปที่ 3a) และยุงตัวเมียที่ผสมพันธุ์กับยุงตัวผู้ที่ถูกยับยั้งการทำงานของ EPP แสดงให้เห็นสัดส่วนของ 3D20E ที่ถูกกำจัดฟอสเฟตลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 3b) แม้ว่าจะมีการยับยั้งการทำงานของยีนเพียงบางส่วน (รูปภาพเพิ่มเติม 2b,c) ในทางตรงกันข้าม เราไม่พบการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในอัตราส่วน 20E22P/20E ในยุงกลุ่มเดียวกัน ซึ่งอาจบ่งชี้ว่าเอนไซม์มีความจำเพาะต่อ 3D20E22P (รูปที่ 3b)
a. กิจกรรมของฟอสฟาเทสใน MAG ลดลงเนื่องจากการปิดกั้น EPP โดยใช้ RNA EPP สองสาย (dsEPP) หรือ RNA GFP สองสาย (dsGFP) เป็นตัวควบคุม ใช้กลุ่ม MAG จำนวน 20 กลุ่มในแต่ละชุดการทดลอง (P = 0.0046, การทดสอบ t แบบจับคู่, สองด้าน) แสดงด้วยจุดแยกกัน b. ตัวเมียที่ผสมพันธุ์กับตัวผู้ที่ถูกปิดกั้น EPP มีสัดส่วนของ 3D20E ที่ถูกกำจัดฟอสเฟตลดลงอย่างมีนัยสำคัญที่ 3 ชั่วโมงหลังการผสมพันธุ์ (P = 0.0043, การทดสอบ t แบบไม่จับคู่, สองด้าน) ในขณะที่ระดับ 20E ไม่ได้รับผลกระทบ (P = 0.063, แบบไม่จับคู่) (การทดสอบ t แบบสองด้าน) ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานจากกลุ่มตัวอย่างเพศเมีย 3 กลุ่ม กลุ่มละ 13, 16 และ 19 ตัว ค. เพศเมียที่ผสมพันธุ์กับเพศผู้ที่ยับยั้งการทำงานของ EPP มีอัตราการผสมพันธุ์ซ้ำสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (P = 0.0002, การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์ แบบสองด้าน) เพศเมียถูกบังคับให้ผสมพันธุ์ก่อนเพื่อให้แน่ใจในสถานะการผสมพันธุ์ของพวกมัน 2 วันต่อมา พวกมันถูกติดต่อกับตัวผู้ตัวอื่นที่มียีนอสุจิที่ถูกดัดแปลงพันธุกรรม เพื่อประเมินอัตราการผสมพันธุ์ซ้ำโดยการตรวจหาทรานส์ยีนด้วยวิธี PCR เชิงปริมาณ ตัวเมียที่กินเลือดแล้วผสมพันธุ์กับตัวผู้ที่ถูกยับยั้งการทำงานของ EPP มีความสามารถในการสืบพันธุ์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (P < 0.0001; การทดสอบ Mann-Whitney แบบสองด้าน) และจำนวนไข่ลดลงเล็กน้อย (P = 0.088, การทดสอบ Mann-Whitney แบบสองด้าน) ในขณะที่อัตราการวางไข่ไม่ได้รับผลกระทบ (P = 0.94, การทดสอบ Fisher's exact test แบบสองด้าน) ในทุกแผง n แทนจำนวนตัวอย่างยุงที่เป็นอิสระทางชีววิทยา NS ไม่มีความสำคัญทางสถิติ *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001
ต่อไป เราได้ประเมินว่าการลดฟอสเฟตของเอคไดโซนมีความสำคัญต่อการเหนี่ยวนำความต้านทานการผสมพันธุ์ในตัวเมียหรือไม่ ที่น่าสังเกตคือ ตัวเมียที่ผสมพันธุ์กับตัวผู้ที่ขาด EPP จะผสมพันธุ์ซ้ำบ่อยกว่ามาก (44.9%) เมื่อเทียบกับตัวเมียกลุ่มควบคุม (10.4%) เมื่อสัมผัสกับตัวผู้เพิ่มเติม (ตัวผู้ดัดแปลงพันธุกรรม) (รูปที่ 3c) เรายังสังเกตเห็นการลดลงอย่างมีนัยสำคัญของความสามารถในการสืบพันธุ์ (รูปที่ 3d ด้านซ้าย) และการลดลงเล็กน้อยของจำนวนไข่ที่ตัวเมียเหล่านี้วาง (รูปที่ 3d ด้านกลาง) ในขณะที่เปอร์เซ็นต์ของไข่ที่ตัวเมียวาง (การตอบสนองอีกอย่างหนึ่งที่เกิดขึ้นในตัวเมียจากการผสมพันธุ์) ไม่ได้รับผลกระทบ (รูปที่ 3d ด้านขวา) เมื่อพิจารณาถึงความจำเพาะของ EPP ต่อ 3D20E22P ที่สังเกตได้ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้น 3D20E โดย EPP ที่ถ่ายทอดระหว่างการผสมพันธุ์อาจมีบทบาทสำคัญในการปิดการตอบสนองของตัวเมียต่อการผสมพันธุ์เพิ่มเติม ซึ่งเป็นพฤติกรรมที่ก่อนหน้านี้ถูกระบุว่าเป็นผลมาจากการถ่ายทอดทางเพศของ 20E ดังนั้น ฮอร์โมนเฉพาะเพศชายนี้จึงส่งผลกระทบอย่างมากต่อภาวะเจริญพันธุ์ของเพศหญิงด้วย
ถัดมา เราได้เปรียบเทียบกิจกรรมของ 20E และ 3D20E ในการทดลองฉีดในตัวเมียที่โตเต็มวัยทางเพศโดยใช้ 3D20E ที่สังเคราะห์ทางเคมี (รูปที่ 4a–c) และ 20E ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ เราพบว่า 3D20E มีประสิทธิภาพมากกว่า 20E อย่างมีนัยสำคัญในการยับยั้งความไวของตัวเมียต่อการผสมพันธุ์ที่ความเข้มข้นทั้งสองระดับ (รูปที่ 4d) ที่น่าสังเกตคือ ระดับ 3D20E ใน LRT ที่ครึ่งหนึ่งของระดับทางสรีรวิทยา (1,066 pg หลังการฉีด เทียบกับ 2,022 pg หลังการผสมพันธุ์) ทำให้เกิดสัดส่วนของตัวเมียที่ไม่ตอบสนองต่อการผสมพันธุ์สูงกว่าระดับทางสรีรวิทยาของ 20E (361 pg หลังการฉีด) ถึง 20 เท่า 24 ชั่วโมงหลังการฉีดที่ความเข้มข้นสูงสุด 18 pg หลังการผสมพันธุ์ (ตารางข้อมูลเพิ่มเติม 1) ผลลัพธ์นี้สอดคล้องกับแนวคิดที่ว่าการถ่ายทอดทางเพศของ 20E ไม่ก่อให้เกิดช่วงเวลาที่ไม่สามารถผสมพันธุ์ได้ และยังชี้ให้เห็นว่า 3D20E เป็นปัจจัยสำคัญในการสร้างความสัมพันธ์ระหว่างพ่อแม่และลูก 3D20E ยังมีกิจกรรมมากกว่า 20E อย่างมีนัยสำคัญในการทดสอบการวางไข่ในตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ (รูปที่ 4e) ซึ่งบ่งชี้ว่าอัตราการวางไข่ปกติที่เราสังเกตได้หลังจากการยับยั้ง EPP บางส่วนนั้นเกิดจากการมีกิจกรรมของ 3D20E ที่เหลืออยู่ซึ่งยังคงผลิตโดยปัจจัยของตัวเมียที่ถูกกระตุ้นโดยการผสมพันธุ์
(a,b) 3D20E สังเคราะห์ทางเคมีจาก 20E (a) ด้วยอัตราการแปลง/ประสิทธิภาพสูงมาก (ข้อมูลแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานจากปฏิกิริยาการสังเคราะห์อิสระสามครั้ง) (b) (c) สเปกตรัมมวล (ครึ่งล่าง) ตรงกับเอคไดโซนที่พบใน LRT ของตัวเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว (ครึ่งบน) (d) เปรียบเทียบกับ 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์ สองด้าน) และเอทานอล 10% (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์ สองด้าน) พบว่า 20E มีค่าสูงกว่ากลุ่มควบคุมอย่างมีนัยสำคัญเฉพาะที่ขนาดยาที่สูงกว่า (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์, สองด้าน) e, การฉีด 3D20E กระตุ้นอัตราการวางไข่ในยุงตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์สูงกว่ากลุ่มควบคุมที่ใช้เอทานอล 10% อย่างมีนัยสำคัญ (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์, สองด้าน) ในขณะที่ 20E เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม พบว่ามีอัตราการวางไข่สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเฉพาะในปริมาณที่สูงกว่า (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์, สองด้าน) 3D20E กระตุ้นอัตราการวางไข่สูงกว่า 20E อย่างมีนัยสำคัญในปริมาณที่สูงกว่า (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์, สองด้าน) ในทุกแผง n แทนจำนวนตัวอย่างยุงที่เป็นอิสระทางชีววิทยา NS, ไม่ มีนัยสำคัญทางสถิติ *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001 ข้อมูลได้มาจากการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง
จากการศึกษาครั้งก่อน เราพบว่าการถ่ายทอดฮอร์โมนสเตียรอยด์ทางเพศกระตุ้นการแสดงออกของ MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11) ซึ่งเป็นยีนสืบพันธุ์เพศเมียที่ช่วยปกป้องยุง Anopheles gambiae เพศเมียจากการติดเชื้อ Plasmodium falciparum ซึ่งเป็นปรสิตมาลาเรียที่ร้ายแรงที่สุดในมนุษย์ เนื่องจาก MISO มีความสำคัญต่อความสามารถในการสืบพันธุ์ของยุง Anopheles ในพื้นที่ที่มีโรคมาลาเรียระบาด เราจึงตัดสินใจที่จะตรวจสอบว่าฮอร์โมน 3D20E หรือ 20E ตัวใดกระตุ้นการแสดงออกของยีนนี้ เราพบว่าในขณะที่การฉีด 20E กระตุ้นตัวรับฮอร์โมนนิวเคลียร์ (HR) บางชนิดโดยเฉพาะหรืออย่างมีประสิทธิภาพมากกว่า เช่น HR3 และ HR4 และเป้าหมายสเตียรอยด์ปลายทางทั่วไป เช่น ยีนสร้างไข่แดง Vg14, 15, 16 แต่ MISO ถูกกระตุ้นอย่างรุนแรงกว่าโดย 3D20E (รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติมที่ 3) ดังนั้น การถ่ายทอดฮอร์โมนสเตียรอยด์แอนโดรเจนิกทางเพศนี้จึงดูเหมือนจะ... กระตุ้นกลไกที่ปกป้องเพศเมียจากผลเสียที่เกิดจากการติดเชื้อปรสิต นอกจากนี้ 3D20E ยังส่งผลต่อไอโซฟอร์มทั้งสองของตัวรับฮอร์โมนเอคไดโซน (EcR) แตกต่างกัน โดยกระตุ้น EcR-A และยับยั้ง EcR-B และกระตุ้นยีนเหนี่ยวนำการผสมพันธุ์อื่นๆ อย่างรุนแรงยิ่งขึ้น รวมถึง HPX15 ซึ่งส่งผลต่อภาวะเจริญพันธุ์ของเพศเมีย นี่อาจอธิบายถึงภาวะมีบุตรยากอย่างมีนัยสำคัญที่พบในเพศเมียที่ผสมพันธุ์กับเพศผู้ที่ยับยั้ง EPP (รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติมที่ 3) ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงการมีอยู่ของเส้นทางปลายทางที่ถูกกระตุ้นโดยฮอร์โมนเอคไดโซนสองชนิดโดยเฉพาะ ซึ่งอาจเป็นพื้นฐานของหน้าที่เฉพาะเพศ
ถัดมา เราได้ทดสอบการทำงานของยีน EcK ทั้งสองตัวที่ระบุได้จากกระบวนการวิเคราะห์ข้อมูลชีวภาพของเรา การยับยั้งการทำงานของ EcK1 หรือ EcK2 ส่งผลให้ตัวผู้ตายเป็นจำนวนมาก (รูปภาพเพิ่มเติม 4a) ซึ่งบ่งชี้ว่าการฟอสโฟรีเลชันของเอคไดโซน และดังนั้นการยับยั้งการทำงาน จึงมีความสำคัญต่อการอยู่รอด เนื่องจาก EcK2 มีการแสดงออกในระดับที่สูงกว่า EcK1 และตรวจพบใน MAGs โดยวิธีการโปรตีโอมิกส์ (รูปที่ 2b,c และตารางเสริม 2) เราจึงตรวจสอบกิจกรรมของเอนไซม์เอคไดสเตอรอยด์ไคเนสโดยการบ่มกับ 20E ซึ่งส่งผลให้เกิดการฟอสโฟรีเลชัน 20E22P (รูปภาพเพิ่มเติม 2b) เมื่อใช้ 3D20E เป็นสารตั้งต้น เราไม่สามารถตรวจพบผลิตภัณฑ์ฟอสโฟรีเลชัน 3D20E22P ได้ (รูปภาพเพิ่มเติม 4c) ซึ่งบ่งชี้ว่า 20E อาจเป็นเป้าหมายที่ EcK2 ต้องการมากกว่า 3D20E
จากการวิเคราะห์ RNA-seq ของเรา พบว่า EcK2 มีการแสดงออกสูงใน LRT ของตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ โดยจะถูกปิดการทำงานหลังจากผสมพันธุ์แล้ว (รูปที่ 2b) เราได้ยืนยันข้อมูลเหล่านี้และพบว่าการแสดงออกของ EcK2 ไม่ได้รับผลกระทบจากการดูดเลือด (รูปเพิ่มเติมที่ 5a) จากการทดลอง MS เบื้องต้น เราพบว่าจุดสูงสุดของ 20E22P มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับจุดสูงสุดของ 20E (22-26 ชั่วโมงหลังจากการดูดเลือด; รูปเพิ่มเติมที่ 5b) การยับยั้งการทำงานของ EcK2 ในตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ ส่งผลให้สัดส่วนสัมพัทธ์ของ 20E ต่อ 20E22P เพิ่มขึ้น 3 เท่าที่ 26 ชั่วโมงหลังจากการดูดเลือด (รูปเพิ่มเติมที่ 2c และ 5c) ซึ่งยืนยันว่า EcK2 ยังทำการฟอสฟอริเลต 20E ในตัวเมียด้วย ที่น่าสังเกตคือ ตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ซึ่งขาด EcK2 ยังคงมีความพร้อมในการผสมพันธุ์อย่างเต็มที่ (รูปเพิ่มเติมที่ 5d,e) ซึ่งแสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าการผลิตของตัวเมีย 20E ไม่ทำให้เกิดภาวะไม่พร้อมผสมพันธุ์ อย่างไรก็ตาม ตัวเมียเหล่านี้มีอัตราการวางไข่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม โดยมีตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์มากกว่า 30% ที่วางไข่ (รูปภาพเพิ่มเติม 5f) หากฉีด RNA Eck2 แบบสองสาย (dsEcK2) หลังจากการดูดเลือด การวางไข่จะไม่เกิดขึ้น ซึ่งในขณะนั้นระดับ 20E สูงสุดเนื่องจากการดูดเลือดได้ลดลงแล้ว โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนแบบจำลองที่ว่า 20E ที่ผลิตขึ้นหลังจากการดูดเลือดสามารถกระตุ้นการวางไข่ได้ แต่เฉพาะเมื่อการปิดกั้นการวางไข่ (EcK2 และอาจรวมถึงปัจจัยอื่นๆ) ถูกปิดลงโดยการผสมพันธุ์ การฉีด 20E หรือ 3D20E ไม่ได้ยับยั้งการแสดงออกของ EcK2 ในตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ (รูปภาพเพิ่มเติม 5g) ซึ่งบ่งชี้ว่าปัจจัยอื่นๆ เป็นตัวกลางในการยับยั้งไคเนสนี้ อย่างไรก็ตาม ระดับ 20E หลังจากการดูดเลือดไม่เพียงพอที่จะทำให้เกิดความไม่สบายในการผสมพันธุ์ แต่ถูกกระตุ้นอย่างมีประสิทธิภาพโดยความเข้มข้นสูงของการถ่ายทอดทางเพศ 3D20E.
ผลการศึกษาของเราให้ข้อมูลเชิงลึกที่สำคัญเกี่ยวกับกลไกที่ควบคุมความสำเร็จในการสืบพันธุ์ของ A. gambiae แบบจำลองที่เกิดขึ้นแสดงให้เห็นว่าตัวผู้ได้วิวัฒนาการให้สังเคราะห์ 3D20E ในปริมาณสูง ซึ่งเป็นเอคไดโซนที่ดัดแปลงเฉพาะตัวผู้และช่วยยืนยันความเป็นพ่อแม่โดยการทำให้ตัวเมียไม่ไวต่อการผสมพันธุ์ต่อไป ในขณะเดียวกัน แมลงพาหะนำโรคมาลาเรียเหล่านี้ก็ได้วิวัฒนาการระบบที่มีประสิทธิภาพในการกระตุ้น 3D20E ในตัวเมียเพื่อตอบสนองต่อการถ่ายทอดทางเพศของ EPP เฉพาะตัวผู้ เท่าที่เราทราบ นี่เป็นตัวอย่างแรกของระบบฮอร์โมนสเตียรอยด์ที่ตัวผู้และตัวเมียมีบทบาทเด่น ซึ่งทำหน้าที่เฉพาะและสำคัญในแมลง หน้าที่ของเอคไดโซนเฉพาะตัวผู้ได้รับการตั้งสมมติฐานไว้ แต่ยังไม่ได้รับการพิสูจน์อย่างแน่ชัด ตัวอย่างเช่น สมมติฐานที่ถูกหักล้างไปมากแล้ว 18 คือ หน้าที่เหล่านี้อาจทำได้โดยสารตั้งต้น 20E คือ E1 เป็นที่ทราบกันดีว่าใน Drosophila การมีคู่เดียวจะถูกกระตุ้นโดยการถ่ายทอดทางเพศของเปปไทด์เพศขนาดเล็ก 19,20 ซึ่งมีปฏิสัมพันธ์กับเซลล์ประสาทที่ควบคุมระบบสืบพันธุ์เพศเมียผ่านตัวรับเปปไทด์เพศเฉพาะ21,22 จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อกำหนดลำดับการส่งสัญญาณที่ควบคุมโดย 3D20E ในยุงตัวเมีย A. gambiae และเพื่อตรวจสอบว่าลำดับการส่งสัญญาณเหล่านี้สามารถคงไว้ได้ระหว่างยุงและแมลงหวี่หรือไม่
จากการศึกษาของเราพบว่า 3D20E มีบทบาทสำคัญในเรื่องความสามารถในการสืบพันธุ์และพฤติกรรมของยุงเพศเมีย ซึ่งเส้นทางที่นำไปสู่การสังเคราะห์และการกระตุ้น 3D20E จึงเปิดโอกาสใหม่ๆ สำหรับกลยุทธ์การควบคุมยุงในอนาคต เช่น การสร้างยุงเพศผู้ที่เป็นหมันที่มีความสามารถในการแข่งขันในกลยุทธ์เทคโนโลยีแมลงที่เป็นหมัน การปล่อยสู่ธรรมชาติ หรือการเลียนแบบ 3D20E ในการผสมพันธุ์ของยุงเพศเมีย หน้าที่เฉพาะของ 3D20E ในเพศผู้ อาจวิวัฒนาการขึ้นเมื่อ A. gambiae และยุงสกุล Cellia อื่นๆ ได้รับความสามารถในการทำให้เชื้ออสุจิแข็งตัวเป็นปลั๊กผสมพันธุ์ ซึ่งช่วยให้การถ่ายโอนฮอร์โมนและเอนไซม์กระตุ้นฮอร์โมนจำนวนมากมีประสิทธิภาพ ในทางกลับกัน วิวัฒนาการของ 3D20E ที่นำไปสู่การมีคู่เดียว (monandry) เป็นกลไกที่ทำให้เพศเมีย (ผ่านการแสดงออกของ MISO ในระดับสูง) สามารถส่งเสริมความเหมาะสมในการสืบพันธุ์ในพื้นที่ที่มีการระบาดของมาลาเรียสูง ซึ่งส่งผลทางอ้อมต่อการแพร่กระจายของเชื้อ Plasmodium เนื่องจากพบว่า 20E ในเพศเมียมีผลกระทบอย่างมากต่อการอยู่รอดและการเจริญเติบโตของ P. falciparum ในเพศเมีย ยุง Anopheles²⁴ ทั้งเพศผู้และเพศเมีย เส้นทางฮอร์โมนสเตียรอยด์ถือเป็นแง่มุมสำคัญของปฏิสัมพันธ์ระหว่างยุงกับปรสิตในปัจจุบัน
ยุงลาย A. gambiae สายพันธุ์ G3 ถูกเลี้ยงภายใต้สภาวะมาตรฐานของแมลง (26-28 °C, ความชื้นสัมพัทธ์ 65-80%, ช่วงแสง/ความมืด 12:12 ชั่วโมง) ตัวอ่อนได้รับอาหารเป็นอาหารปลาผง (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets และ Tetra Pond Sticks ในอัตราส่วน 7:7:2) ยุงตัวเต็มวัยได้รับอาหารเป็นสารละลายเดกซ์โทรส 10% อย่างไม่จำกัด และเลือดมนุษย์สัปดาห์ละครั้ง (ส่วนประกอบของเลือดที่ใช้ในการศึกษา) ยุงตัวเมียที่ยังไม่ผสมพันธุ์ได้มาจากการแยกเพศในระยะดักแด้หลังจากตรวจสอบปลายด้วยกล้องจุลทรรศน์ ยุงตัวผู้ที่มียีน DsRed ได้รับการอธิบายไว้แล้วในเอกสารก่อนหน้านี้
การทดลองผสมพันธุ์แบบบังคับดำเนินการตามโปรโตคอลที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ สำหรับการผสมพันธุ์ตามธรรมชาติ ตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์อายุ 4 วันถูกเลี้ยงไว้ในอัตราส่วน 1:3 กับตัวผู้ที่โตเต็มวัยและยังไม่เคยผสมพันธุ์เป็นเวลาสองคืน สำหรับการทดลองที่ฉีด dsEPP เข้าไปในตัวผู้ การเลี้ยงร่วมกันจะเกิดขึ้นในวันที่ 3-4 หลังการฉีด ซึ่งเป็นช่วงที่กิจกรรมของฟอสฟาเทสถูกยับยั้งอย่างสูงสุด (รูปภาพข้อมูลเพิ่มเติม 2b)
เนื้อเยื่อของยุง ซากที่เหลือ (ส่วนที่เหลือของร่างกาย) หรือทั้งตัว ถูกแยกชิ้นส่วนลงในเมทานอล 100% และบดให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยเครื่องบดลูกปัด (ลูกปัดแก้วขนาด 2 มม., 2,400 รอบต่อนาที, 90 วินาที) ปริมาณเนื้อเยื่อและปริมาตรของเมทานอลมีดังนี้: ส่วนที่เหลือของร่างกาย 50 ชิ้น ใน 1,000 ไมโครลิตร; MAG 50–100 ชิ้น ใน 80 ไมโครลิตร; LRT ของตัวเมีย 25–50 ชิ้น ใน 80 ไมโครลิตร ตะกอนถูกนำไปสกัดด้วยเมทานอลอีกครั้งด้วยปริมาตรเมทานอลเท่าเดิม เศษเซลล์ถูกกำจัดออกโดยการปั่นเหวี่ยง เมทานอลจากการสกัดทั้งสองครั้งถูกรวมเข้าด้วยกันและทำให้แห้งภายใต้กระแสไนโตรเจน จากนั้นละลายใหม่ในปริมาตรของเมทานอล 80% ในน้ำดังนี้: ส่วนที่เหลือของร่างกาย 50 ไมโครลิตร; MAG และ LRT ของตัวเมีย 30 ไมโครลิตร
ตัวอย่างถูกวิเคราะห์ด้วยเครื่องแมสสเปกโทรเมตรี (ID-X, Thermo Fisher) ที่เชื่อมต่อกับเครื่อง LC (Vanquish, Thermo Fisher) ฉีดตัวอย่าง 5 µl ลงบนคอลัมน์ขนาด 3 µm, 100 × 4.6 mm (Inspire C8, Dikma) ที่อุณหภูมิ 25 °C เฟสเคลื่อนที่สำหรับ LC คือ A (น้ำ, กรดฟอร์มิก 0.1%) และ B (อะซีโตไนไตรล์, กรดฟอร์มิก 0.1%) การไล่ระดับ LC เป็นดังนี้: 5% B เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นเพิ่มเป็น 100% B ในเวลา 11 นาที หลังจาก 8 นาทีที่ 100% ปรับสมดุลคอลัมน์ใหม่ที่ 5% B เป็นเวลา 4 นาที อัตราการไหลคือ 0.3 ml/min การแตกตัวเป็นไอออนในแหล่งกำเนิด MS ทำได้โดยการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสเปรย์แบบให้ความร้อนในโหมดบวกและลบ
เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีวัดข้อมูลในช่วง m/z ตั้งแต่ 350 ถึง 680 ที่ความละเอียด 60,000 ในโหมด MS เต็มรูปแบบ ข้อมูล MS/MS ได้รับการเก็บรวบรวมจาก [M + H]+ (เป้าหมายทั้งหมด), [M - H2O + H]+ (เป้าหมายทั้งหมด) และ [M - H]- (เป้าหมายที่ถูกฟอสโฟรีเลต) ข้อมูล MS/MS ถูกนำมาใช้เพื่อยืนยันคุณสมบัติของเอคไดโซนของเป้าหมายที่ไม่มีสารมาตรฐาน สำหรับการระบุเอคไดสเตอรอยด์ที่ไม่ใช่เป้าหมาย ข้อมูล MS/MS สำหรับพีค HPLC ทั้งหมดที่มีความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ >15% ได้รับการวิเคราะห์ การหาปริมาณโดยใช้เส้นโค้งมาตรฐานที่สร้างจากสารมาตรฐานบริสุทธิ์ (20E, 3D20E) เพื่อคำนวณปริมาณสัมบูรณ์หรือการเจือจางของตัวอย่างเฉพาะหนึ่งตัวอย่าง (เป้าหมายอื่นๆ ทั้งหมด) เพื่อคำนวณความเทียบเท่ากับปริมาณที่พบในตัวผู้หนึ่งตัว สำหรับ 3D20E การหาปริมาณดำเนินการโดยใช้ผลรวมของแอดดักต์ต่อไปนี้: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]- ข้อมูลถูกดึงและหาปริมาณโดยใช้ Tracefinder (เวอร์ชัน 4.1) ข้อมูล MS/MS ถูกวิเคราะห์โดยใช้ Xcalibur (เวอร์ชัน 4.4) สเปกตรัม MS ของ E, 20E และ 3D20E ถูกเปรียบเทียบกับสารมาตรฐานที่เกี่ยวข้อง 3D20E22P ถูกวิเคราะห์โดยการทำอนุพันธ์ด้วยรีเอเจนต์ของ Girard 20E22P ถูกวิเคราะห์โดยอัตราส่วน m/z
สาร 3D20E22P ถูกทำให้บริสุทธิ์จาก MAG โดยดำเนินการทำให้บริสุทธิ์ในระดับการวิเคราะห์โดยใช้เครื่องโครมาโทกราฟของเหลวประสิทธิภาพสูง (Acquity, Waters) พร้อมด้วยตัวตรวจจับมวลแบบควอดรูโพล (QDa, Acquity, Waters) ภายใต้สภาวะ LC เดียวกันกับการวิเคราะห์ HPLC-MS/MS การเก็บรวบรวมเศษส่วนเริ่มต้นเมื่อตรวจพบค่า m/z ที่สอดคล้องกับ 3D20E22P ที่เวลาการคงตัวเดียวกันกับที่กำหนดไว้ก่อนหน้านี้ จากนั้นจึงตรวจสอบความบริสุทธิ์ของสารประกอบที่สกัดได้โดย HPLC-MS/MS ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
สกัด RNA ทั้งหมดจากเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ 10-12 ชิ้น หรือส่วนอื่นๆ ของร่างกาย (ไม่มีหัว) โดยใช้ TRI reagent (Thermo Fisher) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต RNA ถูกบำบัดด้วย TURBO DNase (Thermo Fisher) สังเคราะห์ cDNA โดยใช้ Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ไพรเมอร์สำหรับ reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR; ตารางข้อมูลเพิ่มเติม 2) ได้รับการตีพิมพ์ไว้ก่อนหน้านี้แล้ว24 หรือออกแบบโดยใช้ Primer-BLAST26 โดยให้ความสำคัญกับผลิตภัณฑ์ที่มีขนาด 70-150 bp และครอบคลุมรอยต่อระหว่างเอ็กซอน หรือไพรเมอร์คู่ที่แยกเอ็กซอนออกจากกัน ตัวอย่าง cDNA จากตัวอย่างทางชีวภาพสามถึงสี่ชุดถูกเจือจางสี่เท่าในน้ำสำหรับ RT-qPCR การหาปริมาณทำในปฏิกิริยาซ้ำ 15 µl ที่มี 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo) ไพรเมอร์ Fisher และ cDNA ที่เจือจาง 5 µl ปฏิกิริยาถูกดำเนินการบนระบบ PCR แบบเรียลไทม์ QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) และข้อมูลถูกรวบรวมและวิเคราะห์โดยใช้ Design and Analysis (เวอร์ชัน 2.4.3) ดังที่แสดงในงานวิจัยนี้ ปริมาณสัมพัทธ์ถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยยีนไรโบโซม RpL19 (AGAP004422) ซึ่งการแสดงออกไม่เปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อได้รับอาหารเลือด 27 หรือผสมพันธุ์ 3
ตรวจสอบคุณภาพ RNA โดยใช้ Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) เตรียมและรันไลบรารีแบบ paired-end ของ Illumina ที่ Broad Institute of MIT and Harvard จัดเรียงลำดับนิวคลีโอไทด์ที่อ่านได้เข้ากับจีโนมของ A. gambiae (สายพันธุ์ PEST เวอร์ชัน 4.12) โดยใช้ HISAT2 (เวอร์ชัน 2.0.5) ด้วยพารามิเตอร์เริ่มต้น ลบข้อมูลการอ่านที่มีคะแนนคุณภาพการจับคู่ (MAPQ) น้อยกว่า 30 โดยใช้ Samtools (เวอร์ชัน 1.3.1) นับจำนวนการอ่านที่จับคู่กับยีนโดยใช้ htseq-count (เวอร์ชัน 0.9.1) ด้วยพารามิเตอร์เริ่มต้น คำนวณจำนวนการอ่านที่ปรับให้เป็นมาตรฐานและวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันโดยใช้แพ็คเกจ DESeq2 (เวอร์ชัน 1.28.1) ใน R (เวอร์ชัน 4.0.3)
ยีนที่ดัดแปลงเอคไดโซนได้รับการระบุโดยการค้นหาจีโนมของ A. gambiae ก่อนโดยใช้อัลกอริทึม PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) โดยใช้ค่าพารามิเตอร์เริ่มต้นกับลำดับโปรตีนที่ใช้ในการค้นหาดังต่อไปนี้: จาก Bombyx mori (หมายเลขการเข้าถึง NP_001038956.1), Musca domestica (หมายเลขการเข้าถึง XP_005182020.1, XP_005175332.1 และ XP_011294434.1) และ Microplitis demolitor (หมายเลขการเข้าถึง XP_008552646.1 และ XP_008552645.1) EcK จาก B. mori (หมายเลขการเข้าถึง NP_001036900), Drosophila melanogaster (หมายเลขการเข้าถึง...) NP_651202), Apis mellifera (หมายเลขการเข้าถึง XP_394838) และ Acyrthosiphon pisum (หมายเลขการเข้าถึง XP_001947166); และ EPP จาก B. mori (หมายเลขการเข้าถึง XP_001947166) NP_001177919.1 และ NP_001243996.1) และ EO ของ D. melanogaster (หมายเลขการเข้าถึง NP_572986.1) (ขั้นตอนที่ 1) จากนั้น กรองผลลัพธ์โดยพิจารณาจากการแสดงออกของ mRNA ในระดับสูง (>100 ชิ้นส่วน/กิโลเบสเอ็กซอนต่อการอ่านที่แมปได้หนึ่งล้านครั้ง (FPKM) หรือ >85%) ในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ (LRT หรือ MAG ของเพศเมีย) ในประเทศแกมเบีย (ขั้นตอนที่ 2) เพื่อเพิ่มความจำเพาะ เราได้คัดเลือกเอนไซม์เป้าหมายที่แสดงออกในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของ A. albimanus ซึ่งเป็นยุงสกุล Anopheles ที่ไม่สังเคราะห์หรือถ่ายทอดฮอร์โมนเอคไดโซนระหว่างการผสมพันธุ์ ยีนเป้าหมายถูกคัดกรองโดยพิจารณาจากการแสดงออกต่ำ (<100 FPKM หรือ <เปอร์เซ็นไทล์ที่ 85) ในเนื้อเยื่อสืบพันธุ์ของ A. albimanus (ขั้นตอนที่ 3) ในการคัดกรองขั้นสุดท้าย (ขั้นตอนที่ 4) ยีนเป้าหมายต้องเป็นไปตามเงื่อนไขอย่างน้อยหนึ่งข้อต่อไปนี้: (1) มีการเพิ่มระดับการแสดงออกอย่างมีนัยสำคัญหลังการผสมพันธุ์ (P < 0.05) ตามการวิเคราะห์ยีนที่มีการแสดงออกแตกต่างกัน และ (2) ในเนื้อเยื่อที่ไม่เกี่ยวข้องกับการสืบพันธุ์ (< 85% หรือ <100 FPKM)
เราได้ปรับเปลี่ยนวิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 28,29,30 เพื่อให้ได้การติดฉลากไอโซโทปของสิ่งมีชีวิตทั้งหมด โดยสรุปคือ ยีสต์ Saccharomyces cerevisiae ชนิด II (YSC2, Sigma) สายพันธุ์ป่าถูกทดสอบในฐานไนโตรเจนของยีสต์ (BD Difco, DF0335) ที่ประกอบด้วยกลูโคส (G7528, Sigma) 2% (น้ำหนัก/ปริมาตร), กรดอะมิโนที่ปราศจาก 1.7% และแอมโมเนียมซัลเฟต ใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ (culture medium) และแอมโมเนียมซัลเฟต 15N 5% (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) เป็นแหล่งไนโตรเจนเพียงอย่างเดียว แยกยีสต์โดยการปั่นเหวี่ยง และเลี้ยงลูกน้ำยุงอย่างอิสระจนกระทั่งเข้าดักแด้ เสริมด้วยปลาป่น (0.5 มิลลิกรัมต่อลูกน้ำ 300 ตัว) เพื่อป้องกันการตายของลูกน้ำระยะที่สี่ จากนั้นจึงใช้เฉพาะตัวเมียในการทดลองผสมพันธุ์กับตัวผู้ที่ไม่ติดฉลาก เพื่อวิเคราะห์โปรตีนที่ถ่ายทอดระหว่างการผสมพันธุ์ของตัวผู้
ตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ อายุ 4-6 วัน ที่ติดแท็ก 15N ถูกบังคับให้ผสมพันธุ์กับตัวผู้ที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ อายุเท่ากัน และไม่ได้ติดแท็ก การผสมพันธุ์ที่สำเร็จได้รับการตรวจสอบโดยการตรวจหาปลั๊กผสมพันธุ์ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบเอพิฟลูออเรสเซนซ์ ที่เวลา 3, 12 และ 24 ชั่วโมงหลังการผสมพันธุ์ หัวใจห้องบนของตัวเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว 45-55 ตัว ถูกผ่าแยกออกมาในบัฟเฟอร์แอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 ไมโครลิตร (pH 7.8) และบดให้เป็นเนื้อเดียวกันด้วยครก สารละลายที่ได้ถูกนำไปปั่นเหวี่ยง และส่วนที่เป็นของเหลวใสถูกผสมกับ RapiGest 0.1% (186001860, Waters) 50 ไมโครลิตร ในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 มิลลิโมลาร์ ส่วนที่เป็นของเหลวใสและส่วนที่เป็นตะกอนจากแต่ละตัวอย่างถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วบนน้ำแข็งแห้งและจัดส่งข้ามคืนไปยังห้องปฏิบัติการ MacCoss ที่มหาวิทยาลัยวอชิงตัน ซึ่งจะทำการเตรียมตัวอย่างสำหรับ LC-MS/MS ให้เสร็จสมบูรณ์ ละลายตะกอนใน 50 ไมโครลิตรของ นำ RapiGest 0.1% ในแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 50 mM มาทำการโซนิเคทในอ่างน้ำ วัดความเข้มข้นของโปรตีนในส่วนตะกอนและส่วนของเหลวโดยวิธี BCA assay จากนั้นทำการรีดิวซ์ตัวอย่างด้วยไดไทโอไทรทอล (DTT; Sigma) 5 mM ทำการอัลคิเลชันด้วยไอโอโดอะเซตาไมด์ (Sigma) 15 mM และบ่มที่ 37 °C (1:0:50) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง โดยใช้ทริปซินไนเซชันในอัตราส่วนทริปซินต่อสารตั้งต้น ทำการสลาย RapiGest ด้วยการเติม HCl 200 mM ตามด้วยการบ่มที่ 37 °C เป็นเวลา 45 นาที และปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ที่ 4 °C เพื่อกำจัดเศษตะกอน ล้างตัวอย่างด้วยการสกัดแบบเฟสของแข็งสองโหมด (ตลับ Oasis MCX, Waters) และแขวนลอยใหม่ในกรดฟอร์มิก 0.1% เพื่อให้ได้ความเข้มข้นของโปรตีนสุดท้ายที่ 0.33 µg µl-1 โปรตีน MAG ที่ไม่ติดฉลากได้รับการวิเคราะห์ในทำนองเดียวกันจากตัวผู้ที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ มีการวิเคราะห์ตัวอย่างซ้ำสองครั้งสำหรับแต่ละตัวอย่าง จากนั้น นำตัวอย่าง 1 µg จากแต่ละตัวอย่างมาวิเคราะห์โดยใช้คอลัมน์ซิลิกาหลอมเหลวขนาด 25 ซม. 75 μm พร้อมด้วยแผ่นกรองซิลิกาหลอมเหลว Kasil1 (PQ) ขนาด 4 ซม. บรรจุด้วยเรซินเฟสผกผัน Jupiter C12 (Phenomenex) และทำการแยกด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวเป็นเวลา 180 นาที การย่อยตัวอย่าง – MS/MS ดำเนินการโดยใช้เครื่องแมสสเปกโทรเมตรี Q-Exactive HF (Thermo Fisher) ร่วมกับระบบ nanoACQUITY UPLC (Waters) ข้อมูลการได้มาซึ่งข้อมูลที่เกี่ยวข้องกับการทำงานแต่ละครั้งถูกแปลงเป็นรูปแบบ mzML โดยใช้ Proteowizard (เวอร์ชัน 3.0.20287) และใช้ Comet31 (เวอร์ชัน 3.2) กับฐานข้อมูล FASTA ที่มีลำดับโปรตีนจาก Anopheles gambiae (VectorBase เวอร์ชัน 54), Anopheles coluzzi A การค้นหาดำเนินการใน Mali-NIH (VectorBase เวอร์ชัน 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, มีนาคม 2021), A. gambiae RNA-seq และการแปลสามเฟรมของสารปนเปื้อนในมนุษย์ที่รู้จัก ค่า FDR ที่ตรงกับแผนที่เปปไทด์ถูกกำหนดโดยใช้ Percolator32 (เวอร์ชัน 3.05) ด้วยเกณฑ์ 0.01 และเปปไทด์ถูกประกอบเข้าด้วยกันเพื่อระบุโปรตีนโดยใช้หลักการความประหยัดของโปรตีน (protein parsimony) ใน Limelight33 (เวอร์ชัน 2.2.0) ปริมาณโปรตีนสัมพัทธ์ถูกประมาณโดยใช้ปัจจัยความอุดมสมบูรณ์ของสเปกตรัมแบบนอร์มาไลซ์ (NSAF) ที่คำนวณสำหรับแต่ละโปรตีนในแต่ละรอบการทดลองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ NSAF สัมพัทธ์กับแต่ละโปรตีนถูกหาค่าเฉลี่ยจากตัวอย่างจากตัวอย่างทางชีววิทยาที่แตกต่างกันสองชุด การติดฉลาก 15N สามารถปกปิดโปรตีนของเพศเมียได้สำเร็จ แม้ว่าจะตรวจพบโปรตีนที่ไม่ได้ติดฉลากจำนวนเล็กน้อยจากตัวอย่างเพศเมียที่ติดฉลากแล้วก็ตาม เราบันทึกการตรวจพบการลดลงของโปรตีนเพศผู้ (1-5 สเปกตรัม) ในตัวอย่างดิบของเพศเมียเฉพาะในรอบการทดลองทางเทคนิคเท่านั้น ซึ่งตัวอย่างดิบถูกนำมาวิเคราะห์หลังจากตัวอย่างเพศผู้/ตัวอย่างผสมพันธุ์แล้ว อันเป็นผลมาจากการ "ตกค้าง" ของ HPLC โปรตีนที่พบเป็นครั้งคราวว่าเป็น 'สารปนเปื้อน' จากตัวอย่างเพศเมียที่ติดฉลากแล้วแสดงอยู่ในตารางเสริม 1
เปปไทด์แอนติเจนิกสองชนิด ได้แก่ QTTDRVAPAPDQQQ (ภายในไอโซไทป์ PA) และ MESDGTTPSGDSEQ (ภายในไอโซไทป์ PA และ PB) ใน Genscript ถูกนำมารวมกัน จากนั้นเชื่อมต่อกับโปรตีนพาหะ KLH และฉีดเข้าไปในกระต่ายนิวซีแลนด์ กระต่ายถูกฆ่าหลังจากการฉีดครั้งที่สี่ และแยก IgG ทั้งหมดโดยวิธีการทำให้บริสุทธิ์แบบอาศัยความสัมพันธ์ IgG จากกระต่ายที่มีความจำเพาะต่อ EPP มากที่สุดถูกนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์ด้วยวิธี Western blotting ต่อไป
สำหรับการวิเคราะห์ด้วยวิธี Western blot นั้น ได้ทำการแยกตัวอย่าง MAG (n = 10 โดยที่ n แทนจำนวนตัวอย่างยุงที่เป็นอิสระทางชีวภาพ) และ LRT ตัวเมีย (n = 30) จากยุงตัวผู้บริสุทธิ์อายุ 4 วัน และยุงตัวเมียบริสุทธิ์หรือยุงตัวเมียที่ถูกบังคับให้ผสมพันธุ์ (<10 วันหลังการผสมพันธุ์) โดยเติมสารละลายสกัดโปรตีน (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× protease inhibitor cocktail (Roche)) ลงไปแยกกัน จากนั้นนำตัวอย่างมาบดให้เป็นเนื้อเดียวกันทันทีหลังจากแยกชิ้นส่วนด้วยเครื่องบดลูกปัด (ลูกปัดแก้วขนาด 2 มม., 2,400 รอบต่อนาที, 90 วินาที) กำจัดเศษที่ไม่ละลายน้ำออกโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 g ที่อุณหภูมิ 4 °C วัดปริมาณโปรตีนด้วยวิธี Bradford assay (Bio-Rad) จากนั้น นำโปรตีน MAG 20 µg และ LRT 40 µg มาวิเคราะห์ด้วยวิธี Western blot โปรตีน และโปรตีนส่วนเกินที่เหลือ 20 µg ถูกทำให้เสียสภาพและแยกโดยใช้ 10% Bis-Tris NuPAGE โดยใช้บัฟเฟอร์ MOPS โปรตีนถูกถ่ายโอนไปยังเยื่อโพลีไวนิลิดีนฟลูออไรด์โดยใช้ระบบถ่ายโอน iBlot2 (Thermo Fisher) เยื่อถูกล้างสองครั้งใน 1× PBS-T (0.1% Tween-20 ใน PBS) จากนั้นปิดกั้นด้วยบัฟเฟอร์ปิดกั้น Odyssey (Li-Cor) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 22°C เยื่อถูกเขย่าข้ามคืนที่ 4°C ด้วยแอนติบอดีหลักแบบโพลีโคลนอลกระต่ายต่อต้าน EPP ที่กำหนดเอง (1:700 ในบัฟเฟอร์ปิดกั้น) และแอนติบอดีหลักแบบโมโนโคลนอลหนูต่อต้านแอคติน MAC237 (Abeam; 1:4,000) เยื่อถูกล้างด้วย PBS-T จากนั้นบ่มด้วยแอนติบอดีรอง (ลาต่อต้านกระต่าย 800CW และแพะต่อต้านหนู 680LT (Li-Cor)) ทั้งสองชนิด เมมเบรนถูกแยกด้วย PBS-T (1:20,000) ในบัฟเฟอร์ปิดกั้นที่มี SDS 0.01% และ Tween-20 0.2% เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 22 °C จากนั้นล้างเมมเบรนด้วย PBS-T และถ่ายภาพด้วยเครื่องสแกน Odyssey CLx รวบรวมและประมวลผลภาพใน Image Studio (เวอร์ชัน 5.2) ไม่พบแถบเฉพาะที่สอดคล้องกับไอโซฟอร์ม EPP-RA (82 kDa)
บริเวณรหัสพันธุกรรมของ EPP (ในรูปแบบไอโซฟอร์ม AGAP002463-RB ที่มีโดเมนฮิสติดีนฟอสฟาเตส, การค้นหาโดเมนอนุรักษ์ของ NCBI 34) และ EcK2 (AGAP002181) ถูกโคลนลงในพลาสมิด pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma) ไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางข้อมูลเพิ่มเติม 2 มีการแทรกตัวเชื่อม GS4 จำนวน 8 ตัว (เรียงต่อกัน) ก่อนแท็ก 6xHis ที่ปลาย C ของโครงสร้าง pET-21a(+)-EcK2 โปรตีนรีคอมบิแนนท์ถูกผลิตโดยใช้ปฏิกิริยาการสังเคราะห์โปรตีน E. coli แบบไร้เซลล์ NEBExpress (New England BioLabs) โปรตีนรีคอมบิแนนท์ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์ Ni spin ของ NEBExpress (New England BioLabs) โปรตีนควบคุมไดไฮโดรโฟเลตเรดักเทส (DHFR) ถูกผลิตโดยใช้แม่แบบ DNA จากชุดสังเคราะห์โปรตีน E. coli แบบไร้เซลล์ NEBExpress โปรตีนถูกเก็บรักษาไว้ในกลีเซอรอล 50% ใน PBS ที่อุณหภูมิ -20 °C นานสูงสุด 3 เดือน
วัดกิจกรรมของเอนไซม์ฟอสฟาเทสใน EPP และสารสกัดจากเนื้อเยื่อโดยใช้ 4-ไนโตรฟีนิลฟอสเฟต (pNPP; Sigma-Aldrich) บัฟเฟอร์ปฏิกิริยาประกอบด้วย 25 mM Tris, 50 mM กรดอะซิติก, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA และ 1 mM DTT นำเนื้อเยื่อมาบดให้เป็นเนื้อเดียวกันในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา และกำจัดเศษเซลล์ออกโดยการปั่นเหวี่ยง เริ่มปฏิกิริยาโดยการเติมเอนไซม์หรือสารสกัดจากเนื้อเยื่อลงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาที่มี pNPP 2.5 mg ml-1 บ่มส่วนผสมของปฏิกิริยาที่อุณหภูมิห้องในที่มืด และวัดปริมาณ pNP ที่เปลี่ยนจาก pNPP โดยการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 405 nm ในช่วงเวลาต่างๆ
สำหรับการทดสอบกิจกรรม EcK ในหลอดทดลอง โปรตีนจะถูกบ่มกับ 0.2 มก. 20E หรือ 3D20E ในบัฟเฟอร์ 200 ไมโครลิตร (pH 7.5) ที่ประกอบด้วย 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP และ 10 mM MgCl2 เป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 27 °C หยุดปฏิกิริยาโดยการเติมเมทานอล 800 ไมโครลิตร จากนั้นทำให้เย็นลงที่ -20 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 g เป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิ 4 °C จากนั้นนำส่วนของเหลวใสไปวิเคราะห์ด้วย HPLC-MS/MS สำหรับการทำให้โปรตีนในกลุ่มควบคุมไม่ทำงานด้วยความร้อน โปรตีนจะถูกบ่มในกลีเซอรอล 50% ใน PBS เป็นเวลา 20 นาทีที่อุณหภูมิ 95 °C
สำหรับการทดสอบกิจกรรม EPP ในหลอดทดลอง โปรตีนถูกบ่มกับ 3D20E22P (เทียบเท่ากับปริมาณที่พบใน MAG 18 คู่ ซึ่งบริสุทธิ์โดย HPLC-MS/MS) ในบัฟเฟอร์ 100 µl (pH 7.5) ที่ประกอบด้วย Tris 25 mM, กรดอะซิติก 50 mM, Bis-Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 0.1 mM และ DTT 1 mM เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 27 °C หยุดปฏิกิริยาโดยการเติมเมทานอล 400 µl และทำให้เย็นลงที่ -20 °C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นปั่นเหวี่ยงที่ 20,000 g เป็นเวลา 10 นาทีที่ 4 °C วิเคราะห์สารละลายส่วนบนโดย HPLC-MS/MS
ชิ้นส่วน PCR สำหรับ EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) และ EcK2 (556 bp) ได้รับการขยายจาก cDNA ที่เตรียมจากซากยุงไร้หัวเพศผสม ชิ้นส่วน PCR ของตัวควบคุม eGFP (495 bp) ได้รับการขยายจาก pCR2.1-eGFP ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ไพรเมอร์ PCR แสดงอยู่ในตารางข้อมูลเพิ่มเติม 2 ชิ้นส่วน PCR ถูกแทรกระหว่างโปรโมเตอร์ T7 แบบกลับด้านบนพลาสมิด pL4440 พลาสมิดที่สร้างขึ้นได้มาจาก E. coli สายพันธุ์ NEB 5-α ที่มีความสามารถในการรับพลาสมิด (New England Biolabs) และตรวจสอบโดยการจัดลำดับดีเอ็นเอก่อนใช้งาน (ดูข้อมูลเสริม 1 สำหรับลำดับของชิ้นส่วนที่แทรก) ไพรเมอร์ที่ตรงกับโปรโมเตอร์ T7 (ตารางข้อมูลเพิ่มเติม 2) ถูกนำมาใช้เพื่อขยายชิ้นส่วนที่แทรกจากพลาสมิด pL4440 ขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR ได้รับการยืนยันโดยการแยกด้วยเจลอะกาโรส dsRNA ถูกถอดรหัสจากแม่แบบ PCR โดยใช้ชุด Megascript T7 Transcription Kit (Thermo Fisher) และทำให้บริสุทธิ์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยมีการปรับเปลี่ยนตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้
สำหรับการฉีด dsRNA นั้น dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) จำนวน 1,380 ng ถูกฉีดเข้าไปในทรวงอกของตัวผู้หรือตัวเมียที่โตเต็มวัย (Nanoject III, Drummond) ที่ความเข้มข้น 10 ng nl-1 ภายใน 1 วันหลังจากการฟักตัว ระดับการลดการแสดงออกของยีนถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์ตัวอย่างทางชีววิทยาอย่างน้อย 3 ตัวอย่าง โดยการสกัด RNA การสังเคราะห์ cDNA และ RT-qPCR สำหรับการฉีดเอคไดโซน ตัวเมียที่ยังไม่เคยผสมพันธุ์ อายุ 4 วัน หรือ 6 วัน ที่กินเลือดแล้ว ถูกฉีดด้วย 20E หรือ 3D20E (Nanoject III, Drummond) จำนวน 0.13, 0.21 หรือ 0.63 µg ที่ความเข้มข้น 1.3 และ 2.1 ตามลำดับ ขึ้นอยู่กับการออกแบบการทดลอง หรือ 6.3 ng nl-1. ฉีดเอทานอล 10% (ปริมาตร/ปริมาตร) ในน้ำ 100 nl; 3D20E22P ในเอทานอล 10% 100 nl (เทียบเท่ากับ 75% ของปริมาณที่พบใน MAG หนึ่งคู่) ยุงถูกสุ่มจัดสรรให้อยู่ในกลุ่มฉีด
สำหรับการทดสอบการวางไข่ ยุงตัวเมียอายุ 3 วันจะถูกเลี้ยงด้วยเลือดมนุษย์อย่างไม่จำกัดปริมาณ กำจัดยุงที่กินเลือดไม่หมดหรือกินเลือดน้อยออกไป ขึ้นอยู่กับวิธีการทดลอง ยุงตัวเมียจะถูกแยกไว้ในถ้วยวางไข่คนละใบเป็นเวลาสี่คืน โดยอย่างน้อย 48 ชั่วโมงหลังจากการกินเลือด นับจำนวนไข่โดยใช้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ (Stemi 508, Zeiss) สำหรับยุงตัวเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว ไข่ที่ฟักเป็นตัวอ่อนจะถือว่ามีเชื้อ
สำหรับการทดลองผสมพันธุ์ ตัวเมียจะได้รับอนุญาตให้มีเวลาอย่างน้อย 2 วัน ขึ้นอยู่กับการทดลอง เพื่อพัฒนาความต้านทานต่อการผสมพันธุ์ จากนั้นจึงนำตัวผู้สายพันธุ์ป่าที่มีอายุเท่ากันมาใส่ในกรงเดียวกัน สองคืนต่อมา ถุงน้ำเชื้อที่ได้รับการผสมพันธุ์ของตัวเมียจะถูกผ่าแยก และดีเอ็นเอจีโนมจะถูกปลดปล่อยโดยวิธีการแช่แข็ง-ละลาย และการใช้คลื่นเสียงในบัฟเฟอร์ที่มีส่วนประกอบของ 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA และ 25 mM NaCl (pH 8.2) ตัวอย่างจะถูกบ่มด้วย Proteinase K (0.86 µg µl-1) เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 55 °C ตามด้วย 10 นาทีที่อุณหภูมิ 95 °C สารละลายดีเอ็นเอจีโนมดิบจะถูกเจือจาง 10 เท่า และนำไปตรวจหาลำดับโครโมโซม Y ด้วยวิธี qPCR โดยไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางข้อมูลเพิ่มเติมที่ 2 การไม่พบลำดับโครโมโซม Y แสดงว่าไม่มีการผสมพันธุ์เกิดขึ้น
สำหรับการทดสอบการผสมพันธุ์ซ้ำ ตัวเมียที่ถูกบังคับให้ผสมพันธุ์จะถูกตรวจสอบเพื่อหาปลั๊กการผสมพันธุ์เพื่อยืนยันสถานะการผสมพันธุ์ และปล่อยให้เกิดภาวะดื้อต่อการผสมพันธุ์เป็นเวลา 2 วันในกรณีที่ไม่มีตัวผู้ ดังที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 36 จากนั้นจึงนำตัวผู้ที่มีสเปิร์มดัดแปลงพันธุกรรม DsRed เข้าไปในกรงตัวเมีย สองคืนต่อมา ถุงปฏิสนธิจะถูกแยกออกจากตัวเมีย และเตรียมดีเอ็นเอจีโนมตามที่อธิบายไว้ข้างต้นและนำไปตรวจหาทรานส์ยีน DsRed ด้วยวิธี qPCR ไพรเมอร์แสดงอยู่ในตารางข้อมูลเพิ่มเติม 2 การไม่มีทรานส์ยีน DsRed บ่งชี้ว่าไม่มีการผสมพันธุ์ซ้ำเกิดขึ้น
3D20E ถูกสังเคราะห์ขึ้นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 37 โดยสรุปคือ ละลาย 20E (Sigma-Aldrich) 10 มิลลิกรัมในน้ำ 10 มิลลิลิตร จากนั้นเติมแพลทินัมแบล็ก (ในรูปผง Sigma-Aldrich) 30 มิลลิกรัม เป่าก๊าซ O2 เบาๆ เข้าไปในส่วนผสมของปฏิกิริยาอย่างต่อเนื่อง และคนให้เข้ากันที่อุณหภูมิห้อง หลังจาก 6 ชั่วโมง เติมเมทานอล 30 มิลลิลิตรเพื่อหยุดปฏิกิริยา นำส่วนผสมไปปั่นเหวี่ยงเพื่อแยกอนุภาคตัวเร่งปฏิกิริยาออก ระเหยส่วนที่เป็นของเหลวใสให้แห้งในสุญญากาศที่อุณหภูมิห้อง นำผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่แห้งแล้วละลายในเอทานอล 10% และเมทานอลเพื่อฉีดเข้าเครื่องวิเคราะห์ HPLC-MS/MS อัตราการแปลง (จาก 20E เป็น 3D20E) อยู่ที่ประมาณ 97% (รูปที่ 4b) และสเปกตรัม MS ของ 3D20E ที่สังเคราะห์ขึ้นตรงกับที่พบในตัวเมียที่ผสมพันธุ์แล้ว (รูปที่ 4c)
คำอธิบายในกราฟประกอบด้วยรายละเอียดเฉพาะของการทดสอบทางสถิติที่ดำเนินการ ใช้โปรแกรม GraphPad (เวอร์ชัน 9.0) ในการทำการทดสอบ Fisher's exact test, Mantel-Cox test และ Student's t-test ทำการทดสอบ Cochran-Mantel-Haenszel โดยใช้สคริปต์ R ที่กำหนดเอง (มีให้ใช้งานที่ https://github.com/duopeng/mantelhaen.test) ทดสอบการกระจายตัวของข้อมูลว่าเป็นแบบปกติหรือไม่โดยใช้การทดสอบ Shapiro-Wilk ที่ระดับนัยสำคัญ 0.05 หากข้อมูลไม่ผ่านการทดสอบความปกติ จะทำการทดสอบ Mann-Whitney วิเคราะห์ข้อมูลการอยู่รอดโดยใช้การทดสอบ Mantel-Cox ใช้แพ็กเกจ DESeq2 (เวอร์ชัน 1.28.1) ในการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันในระดับ RNA-seq แถบแนวนอนในกราฟแสดงค่ามัธยฐาน ใช้ค่านัยสำคัญ P = 0.05 เป็นเกณฑ์สำหรับทุกการทดสอบ
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อของ Nature Research Report ที่เชื่อมโยงกับบทความนี้
ข้อมูลโปรตีโอมิกส์ MS ได้ถูกฝากไว้ใน ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) ผ่านทาง PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) โดยมีรหัสระบุชุดข้อมูล PXD032157
ชุดข้อมูล RNA-seq ถูกจัดเก็บไว้ใน Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ภายใต้หมายเลขลำดับ GSE198665
สามารถขอรับชุดข้อมูลเพิ่มเติมที่สร้างและ/หรือวิเคราะห์ในระหว่างการศึกษาครั้งนี้ได้จากผู้เขียนที่เกี่ยวข้องเมื่อมีการร้องขออย่างสมเหตุสมผล บทความนี้เป็นแหล่งข้อมูลต้นฉบับ
De Loof, A. Ecdysteroids: สเตียรอยด์เพศของแมลงที่ถูกละเลย? ตัวผู้: กล่องดำ วิทยาศาสตร์แมลง 13, 325–338 (2006)
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone และการพัฒนาของรังไข่ใน Anopheles stephens.J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).