กรดโพรพิโอนิก (PPA) ซึ่งเป็นสารต้านเชื้อราและสารเติมแต่งอาหารทั่วไป พบว่าทำให้เกิดความผิดปกติในการพัฒนาของระบบประสาทในหนูทดลอง ร่วมกับความผิดปกติของระบบทางเดินอาหาร ซึ่งอาจเกิดจากภาวะจุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุล มีการเสนอแนะถึงความเชื่อมโยงระหว่างการได้รับ PPA จากอาหารกับภาวะจุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุล แต่ยังไม่มีการศึกษาโดยตรง ในที่นี้ เราได้ศึกษาการเปลี่ยนแปลงขององค์ประกอบจุลินทรีย์ในลำไส้ที่เกี่ยวข้องกับ PPA ซึ่งอาจนำไปสู่ภาวะจุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุล เราได้ทำการลำดับจีโนมของจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูทดลองที่ได้รับอาหารปกติ (n=9) และหนูทดลองที่ได้รับอาหารเสริม PPA (n=13) โดยใช้เทคนิคการลำดับจีโนมแบบเมตาจีโนมิกส์ระยะยาว เพื่อประเมินความแตกต่างในองค์ประกอบของจุลินทรีย์และวิถีเมตาบอลิซึมของแบคทีเรีย พบว่า PPA ในอาหารมีความสัมพันธ์กับการเพิ่มขึ้นของจำนวนจุลินทรีย์ที่มีนัยสำคัญหลายชนิด รวมถึง Bacteroides, Prevotella และ Ruminococcus ซึ่งก่อนหน้านี้เคยมีส่วนเกี่ยวข้องกับการผลิต PPA มาแล้ว จุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูที่ได้รับสาร PPA ยังมีวิถีการเผาผลาญที่เกี่ยวข้องกับไขมันและการสังเคราะห์ฮอร์โมนสเตียรอยด์มากขึ้น ผลการวิจัยของเราบ่งชี้ว่า PPA สามารถเปลี่ยนแปลงจุลินทรีย์ในลำไส้และวิถีการเผาผลาญที่เกี่ยวข้องได้ การเปลี่ยนแปลงที่สังเกตได้เหล่านี้เน้นย้ำว่าสารกันบูดที่จัดว่าปลอดภัยสำหรับการบริโภคสามารถส่งผลต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้และส่งผลต่อสุขภาพของมนุษย์ได้
จุลินทรีย์ในร่างกายมนุษย์มักถูกเรียกว่า “อวัยวะสุดท้ายของร่างกาย” และมีบทบาทสำคัญต่อสุขภาพของมนุษย์ (Baquero และ Nombela, 2012) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง จุลินทรีย์ในลำไส้ได้รับการยอมรับว่ามีอิทธิพลต่อระบบต่างๆ ในร่างกายและมีบทบาทในหลายๆ หน้าที่สำคัญ แบคทีเรียที่เป็นประโยชน์มีอยู่มากมายในลำไส้ ครอบครองแหล่งที่อยู่อาศัยทางนิเวศวิทยาหลายแห่ง ใช้สารอาหาร และแข่งขันกับเชื้อโรคที่อาจเกิดขึ้น (Jandhyala et al., 2015) ส่วนประกอบของแบคทีเรียที่หลากหลายในจุลินทรีย์ในลำไส้สามารถผลิตสารอาหารที่จำเป็น เช่น วิตามิน และส่งเสริมการย่อยอาหาร (Rowland et al., 2018) นอกจากนี้ยังพบว่าสารเมตาบอไลต์จากแบคทีเรียมีอิทธิพลต่อการพัฒนาเนื้อเยื่อและเสริมสร้างกระบวนการเผาผลาญและภูมิคุ้มกัน (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022) องค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้ของมนุษย์มีความหลากหลายอย่างมากและขึ้นอยู่กับปัจจัยทางพันธุกรรมและสิ่งแวดล้อม เช่น อาหาร เพศ ยา และสถานะสุขภาพ (Kumbhare et al., 2019)
อาหารของมารดาเป็นองค์ประกอบสำคัญในการพัฒนาของทารกในครรภ์และทารกแรกเกิด และเป็นแหล่งของสารประกอบที่อาจมีอิทธิพลต่อการพัฒนา (Bazer et al., 2004; Innis, 2014) สารประกอบที่น่าสนใจอย่างหนึ่งคือ กรดโพรพิโอนิก (PPA) ซึ่งเป็นกรดไขมันสายสั้นที่เป็นผลพลอยได้จากการหมักของแบคทีเรียและเป็นสารเติมแต่งอาหาร (den Besten et al., 2013) PPA มีคุณสมบัติในการต้านแบคทีเรียและเชื้อรา จึงถูกนำมาใช้เป็นสารกันบูดในอาหารและในงานอุตสาหกรรมเพื่อยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อราและแบคทีเรีย (Wemmenhove et al., 2016) PPA มีผลกระทบที่แตกต่างกันในเนื้อเยื่อต่างๆ ในตับ PPA มีฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยส่งผลต่อการแสดงออกของไซโตไคน์ในแมโครฟาจ (Kawasoe et al., 2022) ผลการควบคุมนี้ยังพบในเซลล์ภูมิคุ้มกันอื่นๆ ซึ่งนำไปสู่การลดการอักเสบ (Haase et al., 2021) อย่างไรก็ตาม ผลตรงกันข้ามกลับถูกสังเกตพบในสมอง การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่าการสัมผัสกับ PPA ทำให้เกิดพฤติกรรมคล้ายออทิสติกในหนู (El-Ansary et al., 2012) การศึกษาอื่นๆ แสดงให้เห็นว่า PPA สามารถกระตุ้นให้เกิดกลิโอซิสและกระตุ้นวิถีการอักเสบในสมอง (Abdelli et al., 2019) เนื่องจาก PPA เป็นกรดอ่อน จึงสามารถแพร่ผ่านเยื่อบุลำไส้เข้าสู่กระแสเลือดและข้ามสิ่งกีดขวางต่างๆ ได้ รวมถึงอุปสรรคเลือด-สมองและรก (Stinson et al., 2019) ซึ่งเน้นย้ำถึงความสำคัญของ PPA ในฐานะเมตาโบไลต์ควบคุมที่ผลิตโดยแบคทีเรีย แม้ว่าบทบาทที่เป็นไปได้ของ PPA ในฐานะปัจจัยเสี่ยงต่อออทิสติกกำลังอยู่ระหว่างการตรวจสอบ แต่ผลกระทบต่อบุคคลที่เป็นออทิสติกอาจขยายไปไกลกว่าการกระตุ้นการเปลี่ยนแปลงของเซลล์ประสาท
อาการทางระบบทางเดินอาหาร เช่น ท้องเสียและท้องผูก เป็นเรื่องปกติในผู้ป่วยที่มีความผิดปกติทางพัฒนาการของระบบประสาท (Cao et al., 2021) การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่าจุลินทรีย์ในลำไส้ของผู้ป่วยที่มีภาวะออทิสติกสเปกตรัม (ASD) แตกต่างจากบุคคลที่มีสุขภาพดี ซึ่งบ่งชี้ถึงภาวะจุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุล (Finegold et al., 2010) ในทำนองเดียวกัน ลักษณะของจุลินทรีย์ในลำไส้ของผู้ป่วยที่เป็นโรคเกี่ยวกับลำไส้อักเสบ โรคอ้วน โรคอัลไซเมอร์ ฯลฯ ก็แตกต่างจากบุคคลที่มีสุขภาพดีเช่นกัน (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019) อย่างไรก็ตาม จนถึงปัจจุบัน ยังไม่มีการพิสูจน์ความสัมพันธ์เชิงสาเหตุระหว่างจุลินทรีย์ในลำไส้กับโรคหรืออาการทางระบบประสาท (Yap et al., 2021) แม้ว่าจะมีแบคทีเรียหลายชนิดที่เชื่อว่ามีบทบาทในภาวะโรคเหล่านี้บางอย่างก็ตาม ตัวอย่างเช่น แบคทีเรียสกุล Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio และสกุลอื่นๆ มีปริมาณมากกว่าในจุลินทรีย์ในลำไส้ของผู้ป่วยออทิสติก (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020) ที่น่าสังเกตคือ สมาชิกในบางสกุลเหล่านี้เป็นที่ทราบกันว่ามียีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023) เนื่องจาก PPA มีคุณสมบัติในการต้านจุลินทรีย์ การเพิ่มปริมาณของ PPA อาจเป็นประโยชน์ต่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรียที่ผลิต PPA (Jacobson et al., 2018) ดังนั้น สภาพแวดล้อมที่มี PFA สูงอาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้ รวมถึงเชื้อก่อโรคในระบบทางเดินอาหาร ซึ่งอาจเป็นปัจจัยที่นำไปสู่อาการทางระบบทางเดินอาหารได้
คำถามสำคัญในการวิจัยไมโครไบโอมคือ ความแตกต่างในองค์ประกอบของจุลินทรีย์เป็นสาเหตุหรืออาการของโรคที่ซ่อนอยู่หรือไม่ ขั้นตอนแรกในการไขความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างอาหาร ไมโครไบโอมในลำไส้ และโรคทางระบบประสาท คือการประเมินผลกระทบของอาหารต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์ เพื่อจุดประสงค์นี้ เราใช้การจัดลำดับเมตาจีโนมิกแบบอ่านยาวเพื่อเปรียบเทียบไมโครไบโอมในลำไส้ของลูกหนูที่ได้รับอาหารที่มี PPA สูงหรืออาหารที่มี PPA ต่ำ ลูกหนูได้รับอาหารชนิดเดียวกับแม่ของพวกมัน เราตั้งสมมติฐานว่าอาหารที่มี PPA สูงจะส่งผลให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้และวิถีการทำงานของจุลินทรีย์ โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA และ/หรือการผลิต PPA
การศึกษาครั้งนี้ใช้หนูทรานส์เจนิก FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) ที่แสดงออกโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) มากเกินไปภายใต้การควบคุมของโปรโมเตอร์ GFAP ที่จำเพาะต่อเซลล์เกลีย โดยปฏิบัติตามแนวทางของคณะกรรมการดูแลและใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลฟลอริดา (UCF-IACUC) (หมายเลขใบอนุญาตใช้สัตว์ทดลอง: PROTO202000002) หลังจากหย่านมแล้ว หนูจะถูกเลี้ยงแยกกันในกรง โดยมีหนูเพศผู้และเพศเมีย 1-5 ตัวต่อกรง หนูจะได้รับอาหารอย่างอิสระ โดยมีให้เลือกสองแบบ คือ อาหารควบคุมบริสุทธิ์ (อาหารมาตรฐานแบบเปิดฉลากที่ดัดแปลงแล้ว ไขมัน 16 กิโลแคลอรี%) หรืออาหารเสริมโซเดียมโพรพิโอเนต (อาหารมาตรฐานแบบเปิดฉลากที่ดัดแปลงแล้ว ไขมัน 16 กิโลแคลอรี%) ที่มีโซเดียมโพรพิโอเนต 5,000 ppm ปริมาณโซเดียมโพรพิโอเนตที่ใช้เทียบเท่ากับ 5,000 มก. PFA/กก. น้ำหนักอาหารทั้งหมด นี่คือความเข้มข้นสูงสุดของ PPA ที่ได้รับการอนุมัติให้ใช้เป็นสารกันบูดในอาหาร เพื่อเตรียมการศึกษาครั้งนี้ หนูพ่อแม่พันธุ์ถูกเลี้ยงด้วยอาหารทั้งสองชนิดเป็นเวลา 4 สัปดาห์ก่อนการผสมพันธุ์ และเลี้ยงต่อเนื่องตลอดช่วงตั้งครรภ์ของแม่หนู ลูกหนู [22 ตัว, กลุ่มควบคุม 9 ตัว (ตัวผู้ 6 ตัว, ตัวเมีย 3 ตัว) และกลุ่ม PPA 13 ตัว (ตัวผู้ 4 ตัว, ตัวเมีย 9 ตัว)] ถูกหย่านมแล้วเลี้ยงด้วยอาหารชนิดเดียวกับแม่หนูเป็นเวลา 5 เดือน ลูกหนูถูกฆ่าเมื่ออายุ 5 เดือน และเก็บอุจจาระในลำไส้ โดยเก็บรักษาไว้ในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่อุณหภูมิ -20°C ก่อนนำไปแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่า DNA ของหนูจะหมดไปและสกัดกรดนิวคลีอิกของจุลินทรีย์ได้
ดีเอ็นเอของโฮสต์ถูกกำจัดออกตามโปรโตคอลที่ดัดแปลง (Charalampous et al., 2019) โดยสรุปคือ นำอุจจาระใส่ลงใน InhibitEX 500 µl (Qiagen, Cat#/ID: 19593) และเก็บแช่แข็ง ทำการสกัดอุจจาระไม่เกิน 1-2 ก้อนต่อการสกัดหนึ่งครั้ง จากนั้นบดอุจจาระให้เป็นเนื้อเดียวกันโดยใช้แท่งบดพลาสติกภายในหลอดจนเป็นสารละลายข้น ปั่นเหวี่ยงตัวอย่างที่ 10,000 RCF เป็นเวลา 5 นาที หรือจนกว่าตัวอย่างจะตกตะกอน จากนั้นดูดเอาส่วนของเหลวใสออก และละลายตะกอนใน 1× PBS 250 µl เติมสารละลายซาโปนิน 4.4% (TCI, หมายเลขผลิตภัณฑ์ S0019) 250 µl ลงในตัวอย่างเพื่อเป็นสารชะล้างในการคลายเยื่อหุ้มเซลล์ยูคาริโอต ผสมตัวอย่างเบา ๆ จนเนียน และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที ขั้นตอนต่อไป เพื่อทำลายเซลล์ยูคาริโอติก ให้เติมน้ำปราศจากนิวคลีเอส 350 ไมโครลิตรลงในตัวอย่าง บ่มไว้ 30 วินาที แล้วเติม NaCl 5 M จำนวน 12 ไมโครลิตร จากนั้นนำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ 6000 RCF เป็นเวลา 5 นาที ดูดเอาส่วนของเหลวใสออก และละลายตะกอนใน PBS 1X จำนวน 100 ไมโครลิตร เพื่อกำจัด DNA ของโฮสต์ ให้เติมบัฟเฟอร์ HL-SAN จำนวน 100 ไมโครลิตร (NaCl 12.8568 กรัม, MgCl2 1 M จำนวน 4 มิลลิลิตร, น้ำปราศจากนิวคลีเอส 36 มิลลิลิตร) และเอนไซม์ HL-SAN จำนวน 10 ไมโครลิตร (ArticZymes P/N 70910-202) นำตัวอย่างมาผสมให้เข้ากันอย่างทั่วถึงโดยใช้ปิเปต และบ่มที่อุณหภูมิ 37 °C เป็นเวลา 30 นาที ที่ความเร็ว 800 รอบต่อนาที ในเครื่อง Eppendorf™ ThermoMixer C หลังจากบ่มแล้ว นำไปปั่นเหวี่ยงที่ 6000 RCF เป็นเวลา 3 นาที และล้างสองครั้งด้วยสารละลาย 1X PBS ปริมาณ 800 µl และ 1000 µl สุดท้าย นำตะกอนมาละลายใหม่ในสารละลาย 1X PBS ปริมาณ 100 µl
ทำการแยกดีเอ็นเอของแบคทีเรียทั้งหมดโดยใช้ชุดอุปกรณ์ New England Biolabs Monarch Genomic DNA Purification Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L) โดยปรับเปลี่ยนขั้นตอนการทำงานมาตรฐานที่ให้มากับชุดอุปกรณ์เล็กน้อย บ่มและรักษาอุณหภูมิของน้ำปราศจากนิวคลีเอสไว้ที่ 60°C ก่อนเริ่มกระบวนการชะล้างขั้นสุดท้าย เติม Proteinase K 10 µl และ RNase A 3 µl ลงในแต่ละตัวอย่าง จากนั้นเติม Cell Lysis Buffer 100 µl แล้วผสมเบาๆ นำตัวอย่างไปบ่มในเครื่อง Eppendorf™ ThermoMixer C ที่อุณหภูมิ 56°C และความเร็ว 1400 รอบต่อนาที เป็นเวลาอย่างน้อย 1 ชั่วโมง และไม่เกิน 3 ชั่วโมง นำตัวอย่างที่บ่มแล้วไปปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 RCF เป็นเวลา 3 นาที แล้วถ่ายส่วนของเหลวใสจากแต่ละตัวอย่างไปยังหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ขนาด 1.5 มล. ที่บรรจุสารละลายสำหรับจับยึด 400 µL จากนั้น นำหลอดทดลองไปปั่นด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยงแบบเป็นจังหวะ (pulse vortex) เป็นเวลา 5–10 วินาที โดยเว้นช่วงละ 1 วินาที ถ่ายของเหลวทั้งหมดจากแต่ละตัวอย่าง (ประมาณ 600–700 µL) ไปยังตลับกรองที่วางอยู่ในหลอดเก็บตัวอย่างแบบไหลผ่าน นำหลอดทดลองไปปั่นเหวี่ยงที่ 1,000 RCF เป็นเวลา 3 นาที เพื่อให้ DNA จับตัวในเบื้องต้น จากนั้นปั่นเหวี่ยงอีกครั้งที่ 12,000 RCF เป็นเวลา 1 นาที เพื่อกำจัดของเหลวที่เหลืออยู่ ย้ายคอลัมน์ตัวอย่างไปยังหลอดเก็บตัวอย่างใหม่ แล้วล้างสองครั้ง สำหรับการล้างครั้งแรก ให้เติมบัฟเฟอร์ล้าง 500 µL ลงในแต่ละหลอด พลิกหลอด 3–5 ครั้ง แล้วปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 RCF เป็นเวลา 1 นาที ทิ้งของเหลวจากหลอดเก็บตัวอย่าง และใส่ตลับกรองกลับเข้าไปในหลอดเก็บตัวอย่างเดิม สำหรับการล้างครั้งที่สอง ให้เติมบัฟเฟอร์ล้าง 500 µL ลงในตัวกรองโดยไม่ต้องพลิกหลอด นำตัวอย่างไปปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 RCF เป็นเวลา 1 นาที จากนั้นย้ายแผ่นกรองไปยังหลอด LoBind® ขนาด 1.5 มล. และเติมน้ำปราศจากนิวคลีเอสที่อุ่นไว้ล่วงหน้า 100 µL บ่มแผ่นกรองที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 1 นาที แล้วนำไปปั่นเหวี่ยงที่ 12,000 RCF เป็นเวลา 1 นาที เก็บรักษา DNA ที่ได้ที่อุณหภูมิ -80°C
ปริมาณความเข้มข้นของ DNA ถูกวัดโดยใช้เครื่องวัดฟลูออโรเมตร Qubit™ 4.0 เตรียม DNA โดยใช้ชุดอุปกรณ์ Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (หมายเลขแคตตาล็อก Q33231) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต วัดการกระจายความยาวของชิ้นส่วน DNA โดยใช้เครื่อง Agilent™ 4150 หรือ 4200 TapeStation เตรียม DNA โดยใช้ชุดน้ำยา Agilent™ Genomic DNA Reagents (หมายเลขแคตตาล็อก 5067-5366) และเทป Genomic DNA ScreenTape (หมายเลขแคตตาล็อก 5067-5365) ทำการเตรียมไลบรารีโดยใช้ชุดอุปกรณ์ Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทำการจัดลำดับ DNA โดยใช้เครื่องจัดลำดับ ONT GridION™ Mk1 พร้อมเซลล์ไหล Min106D (R 9.4.1) การตั้งค่าการจัดลำดับดีเอ็นเอมีดังนี้: การระบุเบสที่มีความแม่นยำสูง ค่า q ขั้นต่ำ 9 การตั้งค่าบาร์โค้ด และการตัดแต่งบาร์โค้ด ตัวอย่างถูกจัดลำดับเป็นเวลา 72 ชั่วโมง หลังจากนั้นข้อมูลการระบุเบสจะถูกส่งไปประมวลผลและวิเคราะห์เพิ่มเติม
การประมวลผลข้อมูลชีวสารสนเทศดำเนินการโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Greenman et al., 2024) ไฟล์ FASTQ ที่ได้จากการจัดลำดับดีเอ็นเอถูกแบ่งออกเป็นไดเร็กทอรีสำหรับแต่ละตัวอย่าง ก่อนการวิเคราะห์ข้อมูลชีวสารสนเทศ ข้อมูลจะถูกประมวลผลโดยใช้ไปป์ไลน์ดังต่อไปนี้: ขั้นแรก ไฟล์ FASTQ ของตัวอย่างจะถูกรวมเข้าเป็นไฟล์ FASTQ เดียว จากนั้น อ่านข้อมูลที่มีความยาวสั้นกว่า 1000 bp จะถูกกรองออกโดยใช้ Filtlong v. 0.2.1 โดยเปลี่ยนพารามิเตอร์เพียงอย่างเดียวคือ –min_length 1000 (Wick, 2024) ก่อนการกรองเพิ่มเติม คุณภาพของข้อมูลจะถูกตรวจสอบโดยใช้ NanoPlot v. 1.41.3 ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: –fastq –plots dot –N50 -o(De Coster และ Rademakers, 2023) อ่านข้อมูลถูกจัดเรียงกับจีโนมอ้างอิงของหนู GRCm39 (GCF_000001635.27) โดยใช้ minimap2 เวอร์ชัน 2.24-r1122 เพื่อกำจัดข้อมูลที่ปนเปื้อนจากโฮสต์ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -L -ax map-ont(Lee, 2018) ไฟล์การจัดเรียงลำดับที่สร้างขึ้นถูกแปลงเป็นรูปแบบ BAM โดยใช้ samtools view -b (Danecek et al., 2021) ใน samtools เวอร์ชัน 1.16.1 จากนั้นจึงระบุอ่านที่ไม่ตรงกันโดยใช้ samtools view -b -f 4 ซึ่งบ่งชี้ว่าอ่านเหล่านี้ไม่ได้เป็นส่วนหนึ่งของจีโนมโฮสต์ อ่านที่ไม่ตรงกันถูกแปลงกลับเป็นรูปแบบ FASTQ โดยใช้ samtools bam2fq ด้วยพารามิเตอร์เริ่มต้น NanoPlot ถูกเรียกใช้ซ้ำกับอ่านที่กรองเพิ่มเติมโดยใช้การตั้งค่าที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หลังจากกรองแล้ว ข้อมูลเมตาจีโนมิกส์ถูกประกอบโดยใช้ metaflye เวอร์ชัน 2.8.2-b1689 ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: –nano-raw–meta (Kolmogorov et al., 2020) ปล่อยพารามิเตอร์ที่เหลือไว้ที่ค่าเริ่มต้น หลังจากประกอบเสร็จแล้ว อ่านที่ผ่านการกรองจะถูกแมปไปยังชุดประกอบโดยใช้ minimap2 และใช้พารามิเตอร์ -ax map-ont เพื่อสร้างไฟล์การจัดเรียงในรูปแบบ SAM ชุดประกอบได้รับการปรับปรุงครั้งแรกโดยใช้ racon v. 1.4.20 ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser et al., 2017) หลังจาก racon เสร็จสิ้นแล้ว ชุดประกอบจะได้รับการปรับปรุงเพิ่มเติมด้วย medaka v. 1.7.2 โดยใช้ medaka_consesus โดยที่พารามิเตอร์ทั้งหมด ยกเว้นพารามิเตอร์ -m ยังคงอยู่ที่ค่าเริ่มต้น พารามิเตอร์ -m ถูกตั้งค่าเป็น r941_min_hac_g507 เพื่อระบุเคมีของเซลล์ไหลและการเรียกเบสที่มีความแม่นยำสูงที่ใช้สำหรับข้อมูลของเรา (nanoporetech/medaka, 2024) ข้อมูลที่ผ่านการกรอง (ต่อไปนี้จะเรียกว่าข้อมูลจุลินทรีย์) และชุดประกอบที่ทำความสะอาดขั้นสุดท้ายถูกนำไปใช้ในการวิเคราะห์ต่อไป
สำหรับการจำแนกทางอนุกรมวิธาน ข้อมูลการอ่านและคอนติ๊กที่ประกอบขึ้นจะถูกจำแนกโดยใช้ Kraken2 เวอร์ชัน 2.1.2 (Wood et al., 2019) สร้างรายงานและไฟล์เอาต์พุตสำหรับข้อมูลการอ่านและการประกอบตามลำดับ ใช้ตัวเลือก –use-names เพื่อวิเคราะห์ข้อมูลการอ่านและการประกอบ ตัวเลือก –gzip-compressed และ –paired จะถูกระบุสำหรับส่วนของข้อมูลการอ่าน ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ของอนุกรมวิธานในเมตาจีโนมถูกประมาณโดยใช้ Bracken เวอร์ชัน 2.8 (Lu et al., 2017) ก่อนอื่นเราสร้างฐานข้อมูล kmer ที่มี 1000 เบสโดยใช้ bracken-build ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -d-k 35 -l 1000 เมื่อสร้างเสร็จแล้ว bracken จะทำงานโดยอิงจากรายงานที่สร้างโดย kraken2 และกรองข้อมูลโดยใช้ตัวเลือกต่อไปนี้: -d -I -O-p 1000 -l

ในจำนวนนี้ จะเลือก P, G หรือ S ขึ้นอยู่กับระดับการจำแนกประเภทที่กำลังวิเคราะห์ เพื่อลดผลกระทบของการจำแนกประเภทที่ผิดพลาด (false positive) จึงได้กำหนดเกณฑ์ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ขั้นต่ำไว้ที่ 1e-4 (1/10,000 reads) ก่อนการวิเคราะห์ทางสถิติ ความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ที่รายงานโดย Bracken (fraction_total_reads) จะถูกแปลงโดยใช้การแปลงค่าลอการิทึมแบบศูนย์กลาง (CLR) (Aitchison, 1982) วิธี CLR ถูกเลือกใช้สำหรับการแปลงข้อมูลเนื่องจากไม่ขึ้นกับขนาดและเพียงพอสำหรับชุดข้อมูลที่ไม่กระจัดกระจาย (Gloor et al., 2017) การแปลง CLR ใช้ลอการิทึมธรรมชาติ ข้อมูลการนับที่รายงานโดย Bracken จะถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้การแสดงออกลอการิทึมสัมพัทธ์ (RLE) (Anders and Huber, 2010) ภาพประกอบสร้างขึ้นโดยใช้โปรแกรม matplotlib เวอร์ชัน 3.7.1, seaborn เวอร์ชัน 3.7.2 และ sequential logarithms (Gloor et al., 2017) เวอร์ชัน 0.12.2 และ stantanotations เวอร์ชัน 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022) อัตราส่วน Bacillus/Bacteroidetes คำนวณสำหรับแต่ละตัวอย่างโดยใช้จำนวนแบคทีเรียที่ปรับค่ามาตรฐานแล้ว ค่าที่รายงานในตารางปัดเศษเป็นทศนิยม 4 ตำแหน่ง ดัชนีความหลากหลายของ Simpson คำนวณโดยใช้สคริปต์ alpha_diversity.py ที่ให้มาในแพ็คเกจ KrakenTools เวอร์ชัน 1.2 (Lu et al., 2022) รายงาน Bracken มีให้ในสคริปต์ และดัชนี Simpson “Si” ใช้สำหรับพารามิเตอร์ -an ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณถูกกำหนดให้เป็นความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ≥ 1 หรือ ≤ -1 ความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ±1 บ่งชี้ว่าปริมาณของตัวอย่างชนิดหนึ่งเพิ่มขึ้น 2.7 เท่า เครื่องหมาย (+/-) แสดงว่ากลุ่มสิ่งมีชีวิตนั้นมีปริมาณมากกว่าในตัวอย่าง PPA และตัวอย่างควบคุม ตามลำดับ การหาความสำคัญทางสถิติใช้การทดสอบ Mann-Whitney U (Virtanen et al., 2020) โดยใช้โปรแกรม Statsmodels เวอร์ชัน 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010) และใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg ในการแก้ไขการทดสอบหลายครั้ง ค่า p ที่ปรับแล้ว ≤ 0.05 ถูกใช้เป็นเกณฑ์ในการพิจารณาความสำคัญทางสถิติ
การระบุตำแหน่งยีนและการประมาณความอุดมสมบูรณ์สัมพัทธ์ดำเนินการโดยใช้โปรโตคอลที่ดัดแปลงมาจากโปรโตคอลที่อธิบายโดย Maranga et al. (Maranga et al., 2023) ขั้นแรก คอนติ๊กที่มีความยาวน้อยกว่า 500 bp จะถูกลบออกจากชุดประกอบทั้งหมดโดยใช้ SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016) จากนั้นชุดประกอบที่เลือกไว้จะถูกรวมเข้าด้วยกันเป็นแพนเมตาจีโนม กรอบการอ่านแบบเปิด (ORF) ถูกระบุโดยใช้ Prodigal v. 1.0.1 (เวอร์ชันคู่ขนานของ Prodigal v. 2.6.3) ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024) จากนั้นไฟล์นิวคลีโอไทด์ที่ได้จะถูกกรองโดยใช้ Python เพื่อลบยีนที่ไม่สมบูรณ์ทั้งหมดออก จากนั้นใช้ CD-HIT เวอร์ชัน 4.8.1 ในการจัดกลุ่มยีนด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012) แคตตาล็อกยีนที่ไม่ซ้ำกันที่สร้างขึ้นถูกนำมาใช้เพื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์ของยีนและการระบุคำอธิบายประกอบ ความอุดมสมบูรณ์ของยีนสัมพัทธ์ถูกประเมินโดยใช้ KMA เวอร์ชัน 1.4.9 (Clausen et al., 2018) ขั้นแรก สร้างไฟล์ดัชนีโดยใช้ดัชนี KMA ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -i -Oจากนั้น โดยใช้ดัชนีที่สร้างขึ้นพร้อมกับข้อมูลการอ่านจุลินทรีย์สำหรับแต่ละตัวอย่างตามที่อธิบายไว้ในส่วน Bioinformatics Pipeline จึงทำการรัน KMA ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24 จากนั้น จำนวนยีนถูกทำให้เป็นมาตรฐานโดยใช้ CLR และใช้คลาสการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) ของ Sci-kit learn (Pedregosa et al., 2011) การระบุคำอธิบายประกอบยีนที่คาดการณ์ไว้ดำเนินการกับแคตตาล็อกยีนที่ไม่ซ้ำกันโดยใช้สคริปต์ emapper.py ของ eggNOG เวอร์ชัน 2.1.12 และฐานข้อมูล eggNOG เวอร์ชัน 5.0.2 ด้วยพารามิเตอร์ต่อไปนี้: –itype CDS –cpu 24 -i– แคตตาล็อกข้อมูล–go_evidence เอาต์พุตที่ไม่ใช่อิเล็กทรอนิกส์– ไดเร็กทอรีเอาต์พุต–target_orthologs all –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021) ผลลัพธ์ KMA ถูกคัดกรองเพื่อเลือกยีนที่มีความครอบคลุมของเทมเพลตและความเหมือนของเทมเพลตเพียงพอ (≥ 90%) และความอุดมสมบูรณ์ (ความลึก ≥ 3) ผลลัพธ์ความลึกของ KMA ถูกแปลงโดยใช้ CLR ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น จากนั้นผลลัพธ์ KMA จะถูกเปรียบเทียบกับรหัสคอนติกจากผลลัพธ์การระบุหน้าที่และการจำแนกประเภทโดยใช้แหล่งคอนติกสำหรับแต่ละยีน เช่นเดียวกับกลุ่มสิ่งมีชีวิต ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของยีนถูกกำหนดให้เป็นยีนที่มีความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ≥ 1 หรือ ≤ -1 โดยมีเครื่องหมาย (+/-) บ่งชี้ว่ายีนนั้นมีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าในตัวอย่าง PPA หรือตัวอย่างควบคุมตามลำดับ
ยีนถูกจัดกลุ่มครั้งแรกตามตัวระบุออร์โธล็อก (KO) ของ Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ที่กำหนดโดย eggNOG เพื่อเปรียบเทียบความอุดมสมบูรณ์ของวิถีการทำงานของยีน ยีนที่ไม่มีน็อคเอาท์หรือยีนที่มีน็อคเอาท์หลายตัวถูกลบออกก่อนการวิเคราะห์ จากนั้นจึงคำนวณความอุดมสมบูรณ์เฉลี่ยของ KO แต่ละตัวต่อตัวอย่าง และทำการวิเคราะห์ทางสถิติ ยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA ถูกกำหนดให้เป็นยีนใดๆ ที่ได้รับแถว ko00640 ในคอลัมน์ KEGG_Pathway ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทในการเผาผลาญโพรพิโอเนตตาม KEGG ยีนที่ระบุว่าเกี่ยวข้องกับการผลิต PPA แสดงอยู่ในตารางเสริม 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017) มีการทดสอบการเรียงสับเปลี่ยนเพื่อระบุยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญและการผลิต PPA ที่มีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในแต่ละประเภทตัวอย่าง มีการทำการเรียงสับเปลี่ยน 1,000 ครั้งสำหรับแต่ละยีนที่วิเคราะห์ ใช้ค่า p-value ที่ 0.05 เป็นเกณฑ์ในการพิจารณาความสำคัญทางสถิติ มีการกำหนดคำอธิบายหน้าที่ให้กับยีนแต่ละตัวภายในคลัสเตอร์โดยอิงจากคำอธิบายของยีนตัวแทนภายในคลัสเตอร์นั้น สามารถระบุกลุ่มสิ่งมีชีวิตที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA และ/หรือการผลิต PPA ได้โดยการจับคู่รหัสคอนติกในไฟล์เอาต์พุตของ Kraken2 กับรหัสคอนติกเดียวกันที่เก็บรักษาไว้ระหว่างการกำหนดคำอธิบายหน้าที่โดยใช้ eggNOG ทำการทดสอบความมีนัยสำคัญทางสถิติโดยใช้การทดสอบ Mann-Whitney U ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ทำการแก้ไขสำหรับการทดสอบหลายครั้งโดยใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg ใช้ค่า p ≤ 0.05 เป็นเกณฑ์ในการพิจารณาความมีนัยสำคัญทางสถิติ
ความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูถูกประเมินโดยใช้ดัชนีความหลากหลายของซิมป์สัน ไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มที่ได้รับ PPA ในแง่ของความหลากหลายของสกุลและชนิด (ค่า p สำหรับสกุล: 0.18, ค่า p สำหรับชนิด: 0.16) (รูปที่ 1) จากนั้นจึงเปรียบเทียบองค์ประกอบของจุลินทรีย์โดยใช้การวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) รูปที่ 2 แสดงการจัดกลุ่มตัวอย่างตามไฟลัม ซึ่งบ่งชี้ว่ามีความแตกต่างในองค์ประกอบของชนิดจุลินทรีย์ระหว่างกลุ่มที่ได้รับ PPA และกลุ่มควบคุม การจัดกลุ่มนี้เด่นชัดน้อยกว่าในระดับสกุล ซึ่งแสดงให้เห็นว่า PPA ส่งผลกระทบต่อแบคทีเรียบางชนิด (รูปเพิ่มเติมที่ 1)
รูปที่ 1. ความหลากหลายอัลฟาของสกุลและองค์ประกอบของสปีชีส์ในไมโครไบโอมในลำไส้ของหนู แผนภาพกล่องแสดงดัชนีความหลากหลายของซิมป์สันของสกุล (A) และสปีชีส์ (B) ในตัวอย่าง PPA และตัวอย่างควบคุม การหาความสำคัญทางสถิติใช้การทดสอบ Mann-Whitney U และทำการแก้ไขหลายรายการโดยใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg ns หมายถึงค่า p ไม่มีความสำคัญทางสถิติ (p>0.05)
รูปที่ 2 ผลการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักขององค์ประกอบจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนูในระดับสายพันธุ์ แผนภาพการวิเคราะห์องค์ประกอบหลักแสดงการกระจายของตัวอย่างตามองค์ประกอบหลักสองตัวแรก สีแสดงประเภทของตัวอย่าง: หนูที่ได้รับสาร PPA เป็นสีม่วง และหนูควบคุมเป็นสีเหลือง องค์ประกอบหลักที่ 1 และ 2 ถูกพล็อตบนแกน x และแกน y ตามลำดับ และแสดงเป็นอัตราส่วนความแปรปรวนที่อธิบายได้
จากการใช้ข้อมูลการนับที่แปลงด้วย RLE พบว่าค่ามัธยฐานของอัตราส่วน Bacteroidetes/Bacilli ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในหนูทดลองกลุ่มควบคุมและกลุ่ม PPA (กลุ่มควบคุม: 9.66, กลุ่ม PPA: 3.02; ค่า p = 0.0011) ความแตกต่างนี้เกิดจากปริมาณของ Bacteroidetes ที่สูงกว่าในหนูทดลองกลุ่ม PPA เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม แม้ว่าความแตกต่างจะไม่ signifikan (ค่าเฉลี่ย CLR ของกลุ่มควบคุม: 5.51, ค่าเฉลี่ย CLR ของกลุ่ม PPA: 6.62; ค่า p = 0.054) ในขณะที่ปริมาณของ Bacteroidetes นั้นใกล้เคียงกัน (ค่าเฉลี่ย CLR ของกลุ่มควบคุม: 7.76, ค่าเฉลี่ย CLR ของกลุ่ม PPA: 7.60; ค่า p = 0.18)
การวิเคราะห์ความอุดมสมบูรณ์ของสมาชิกทางอนุกรมวิธานของจุลินทรีย์ในลำไส้เผยให้เห็นว่า 1 ไฟลัมและ 77 สปีชีส์มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่าง PPA และตัวอย่างควบคุม (ตารางเสริม 2) ความอุดมสมบูรณ์ของ 59 สปีชีส์ในตัวอย่าง PPA สูงกว่าในตัวอย่างควบคุมอย่างมีนัยสำคัญ ในขณะที่ความอุดมสมบูรณ์ของเพียง 16 สปีชีส์ในตัวอย่างควบคุมสูงกว่าในตัวอย่าง PPA (รูปที่ 3)
รูปที่ 3 ความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันของกลุ่มจุลินทรีย์ในไมโครไบโอมในลำไส้ของหนู PPA และหนูควบคุม แผนภูมิภูเขาไฟแสดงความแตกต่างในความอุดมสมบูรณ์ของสกุล (A) หรือสปีชีส์ (B) ระหว่างตัวอย่าง PPA และตัวอย่างควบคุม จุดสีเทาแสดงว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ของกลุ่มจุลินทรีย์ จุดสีแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ (ค่า p ≤ 0.05) กลุ่มจุลินทรีย์ 20 อันดับแรกที่มีความแตกต่างของความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดระหว่างตัวอย่างทั้งสองประเภทแสดงด้วยสีแดงและสีฟ้าอ่อน (ตัวอย่างควบคุมและตัวอย่าง PPA) ตามลำดับ จุดสีเหลืองและสีม่วงมีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าในตัวอย่างควบคุมหรือตัวอย่าง PPA อย่างน้อย 2.7 เท่าเมื่อเทียบกับตัวอย่างควบคุม จุดสีดำแสดงถึงกลุ่มจุลินทรีย์ที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ระหว่าง -1 ถึง 1 ค่า p คำนวณโดยใช้การทดสอบ Mann-Whitney U และแก้ไขสำหรับการทดสอบหลายครั้งโดยใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg ความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ที่เป็นตัวหนาแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์
หลังจากวิเคราะห์องค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้แล้ว เราได้ทำการวิเคราะห์หน้าที่ของไมโครไบโอม หลังจากกรองยีนคุณภาพต่ำออกไปแล้ว พบว่ามียีนที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 378,355 ยีนในทุกตัวอย่าง ความอุดมสมบูรณ์ที่แปลงแล้วของยีนเหล่านี้ถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (PCA) และผลลัพธ์แสดงให้เห็นถึงการจัดกลุ่มตัวอย่างประเภทต่างๆ ในระดับสูงโดยอิงจากโปรไฟล์หน้าที่ของพวกมัน (รูปที่ 4)
รูปที่ 4 ผลลัพธ์ PCA โดยใช้ข้อมูลเชิงหน้าที่ของจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนู แผนภาพ PCA แสดงการกระจายตัวของตัวอย่างตามส่วนประกอบหลักสองส่วนแรก สีแสดงประเภทของตัวอย่าง: หนูที่ได้รับสาร PPA เป็นสีม่วง และหนูควบคุมเป็นสีเหลือง ส่วนประกอบหลักที่ 1 และ 2 ถูกพล็อตบนแกน x และแกน y ตามลำดับ และแสดงเป็นอัตราส่วนความแปรปรวนที่อธิบายได้
ต่อไปเราได้ตรวจสอบความอุดมสมบูรณ์ของ KEGG knockouts ในตัวอย่างประเภทต่างๆ พบว่ามี knockouts ที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 3648 รายการ โดย 196 รายการมีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างควบคุม และ 106 รายการมีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าในตัวอย่าง PPA (รูปที่ 5) ตรวจพบยีนทั้งหมด 145 ยีนในตัวอย่างควบคุม และ 61 ยีนในตัวอย่าง PPA ที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ วิถีการทำงานที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญไขมันและอะมิโนซูการ์มีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง PPA (ตารางเสริม 3) วิถีการทำงานที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญไนโตรเจนและระบบส่งต่อกำมะถันมีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างควบคุม (ตารางเสริม 3) ความอุดมสมบูรณ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญอะมิโนซูการ์/นิวคลีโอไทด์ (ko:K21279) และการเผาผลาญอิโนซิทอลฟอสเฟต (ko:K07291) สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง PPA (รูปที่ 5) ตัวอย่างควบคุมมีจำนวนยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญเบนโซเอต (ko:K22270) การเผาผลาญไนโตรเจน (ko:K00368) และไกลโคไลซิส/กลูโคเนโอเจเนซิส (ko:K00131) มากกว่าอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 5)
รูปที่ 5. ความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันของ KO ในไมโครไบโอมในลำไส้ของหนู PPA และหนูควบคุม แผนภาพภูเขาไฟแสดงความแตกต่างในความอุดมสมบูรณ์ของกลุ่มฟังก์ชัน (KO) จุดสีเทาแสดงถึง KO ที่ความอุดมสมบูรณ์ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่าง (ค่า p > 0.05) จุดสีแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ (ค่า p ≤ 0.05) KO 20 กลุ่มที่มีความแตกต่างของความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดระหว่างตัวอย่างแสดงด้วยสีแดงและสีฟ้าอ่อน ซึ่งสอดคล้องกับตัวอย่างควบคุมและตัวอย่าง PPA ตามลำดับ จุดสีเหลืองและสีม่วงแสดงถึง KO ที่มีความอุดมสมบูรณ์มากกว่าอย่างน้อย 2.7 เท่าในตัวอย่างควบคุมและตัวอย่าง PPA ตามลำดับ จุดสีดำแสดงถึง KO ที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ระหว่าง -1 ถึง 1 ค่า p คำนวณโดยใช้การทดสอบ Mann-Whitney U และปรับสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการโดยใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg NaN แสดงว่า KO นั้นไม่ได้อยู่ในวิถีใน KEGG ค่าความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ที่เป็นตัวหนาแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณ สำหรับข้อมูลโดยละเอียดเกี่ยวกับเส้นทางที่ KO ที่ระบุไว้เป็นส่วนหนึ่ง โปรดดูตารางเสริมที่ 3
ในบรรดายีนที่ได้รับการระบุคำอธิบายประกอบ พบว่า 1601 ยีนมีปริมาณแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท (p ≤ 0.05) โดยแต่ละยีนมีปริมาณมากกว่าอย่างน้อย 2.7 เท่า ในจำนวนนี้ 4 ยีนมีปริมาณมากกว่าในตัวอย่างควบคุม และ 1597 ยีนมีปริมาณมากกว่าในตัวอย่าง PPA เนื่องจาก PPA มีคุณสมบัติในการต้านจุลชีพ เราจึงตรวจสอบปริมาณของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญและการผลิต PPA ระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท ในบรรดายีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA จำนวน 1332 ยีน พบว่า 27 ยีนมีปริมาณมากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างควบคุม และ 12 ยีนมีปริมาณมากกว่าในตัวอย่าง PPA ในบรรดายีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PPA จำนวน 223 ยีน พบว่า 1 ยีนมีปริมาณมากกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง PPA รูปที่ 6A แสดงให้เห็นถึงปริมาณที่สูงขึ้นของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA โดยมีปริมาณสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างควบคุมและมีขนาดผลกระทบใหญ่ ในขณะที่รูปที่ 6B เน้นยีนแต่ละตัวที่มีปริมาณสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญที่พบในตัวอย่าง PPA
รูปที่ 6 ความอุดมสมบูรณ์ที่แตกต่างกันของยีนที่เกี่ยวข้องกับ PPA ในไมโครไบโอมในลำไส้ของหนู แผนภาพภูเขาไฟแสดงความแตกต่างในความอุดมสมบูรณ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA (A) และการผลิต PPA (B) จุดสีเทาแสดงถึงยีนที่มีความอุดมสมบูรณ์ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างประเภทต่างๆ (ค่า p > 0.05) จุดสีแสดงถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในความอุดมสมบูรณ์ (ค่า p ≤ 0.05) ยีน 20 ตัวที่มีความแตกต่างของความอุดมสมบูรณ์มากที่สุดแสดงด้วยสีแดงและสีฟ้าอ่อน (ตัวอย่างควบคุมและตัวอย่าง PPA) ตามลำดับ ความอุดมสมบูรณ์ของจุดสีเหลืองและสีม่วงมีมากกว่าในตัวอย่างควบคุมและตัวอย่าง PPA อย่างน้อย 2.7 เท่า จุดสีดำแสดงถึงยีนที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ โดยมีความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ระหว่าง -1 ถึง 1 ค่า p ถูกคำนวณโดยใช้การทดสอบ Mann-Whitney U และแก้ไขสำหรับการเปรียบเทียบหลายรายการโดยใช้ขั้นตอน Benjamini-Hochberg ยีนต่างๆ สอดคล้องกับยีนตัวแทนในแคตตาล็อกยีนที่ไม่ซ้ำซ้อน ชื่อยีนประกอบด้วยสัญลักษณ์ KEGG ที่บ่งบอกถึงยีน KO ความแตกต่างของค่าเฉลี่ย CLR ที่เป็นตัวหนาแสดงถึงปริมาณที่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญ เครื่องหมายขีด (-) แสดงว่าไม่มีสัญลักษณ์สำหรับยีนนั้นในฐานข้อมูล KEGG
กลุ่มสิ่งมีชีวิตที่มีจีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญและ/หรือการผลิต PPA ถูกระบุโดยการจับคู่เอกลักษณ์ทางอนุกรมวิธานของคอนติ๊กกับรหัสคอนติ๊กของจีน ในระดับสกุล พบว่า 130 สกุลมีจีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA และ 61 สกุลมีจีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PPA (ตารางเสริม 4) อย่างไรก็ตาม ไม่มีสกุลใดแสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณ (p > 0.05)
ในระดับสายพันธุ์ พบว่าแบคทีเรีย 144 สายพันธุ์มียีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA และแบคทีเรีย 68 สายพันธุ์มียีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PPA (ตารางเสริม 5) ในบรรดาแบคทีเรียที่เผาผลาญ PPA พบว่าแบคทีเรีย 8 ชนิดแสดงให้เห็นถึงปริมาณที่เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท และทั้งหมดแสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในผลกระทบ (ตารางเสริม 6) แบคทีเรียที่เผาผลาญ PPA ที่ระบุได้ทั้งหมดซึ่งมีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณนั้น มีปริมาณมากกว่าในตัวอย่าง PPA การจำแนกประเภทในระดับสายพันธุ์เผยให้เห็นตัวแทนของสกุลที่ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท รวมถึงแบคทีเรีย Bacteroides และ Ruminococcus หลายชนิด รวมถึง Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus และ Alcaligenes polymorpha ในบรรดาแบคทีเรียที่ผลิต PPA พบว่าแบคทีเรีย 4 ชนิดแสดงให้เห็นถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท สายพันธุ์ที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณ ได้แก่ Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis และ Ruminococcus bovis
ในการศึกษาครั้งนี้ เราได้ตรวจสอบผลกระทบของการสัมผัส PPA ต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ของหนู PPA สามารถกระตุ้นการตอบสนองที่แตกต่างกันในแบคทีเรีย เนื่องจาก PPA ถูกผลิตโดยแบคทีเรียบางชนิด ใช้เป็นแหล่งอาหารโดยแบคทีเรียชนิดอื่น หรือมีฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์ ดังนั้น การเติม PPA เข้าสู่สภาพแวดล้อมในลำไส้ผ่านการเสริมอาหารอาจมีผลกระทบที่แตกต่างกันไป ขึ้นอยู่กับความทนทาน ความไว และความสามารถในการใช้ PPA เป็นแหล่งสารอาหาร แบคทีเรียชนิดที่ไวต่อ PPA อาจถูกกำจัดและแทนที่ด้วยแบคทีเรียชนิดที่ทนต่อ PPA มากกว่า หรือสามารถใช้ PPA เป็นแหล่งอาหารได้ ซึ่งนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้ ผลการศึกษาของเราพบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในองค์ประกอบของจุลินทรีย์ แต่ไม่มีผลกระทบต่อความหลากหลายของจุลินทรีย์โดยรวม ผลกระทบที่ใหญ่ที่สุดพบในระดับสายพันธุ์ โดยมีมากกว่า 70 สายพันธุ์ที่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณระหว่างตัวอย่าง PPA และตัวอย่างควบคุม (ตารางเสริม 2) การประเมินองค์ประกอบของตัวอย่างที่สัมผัสกับ PPA เพิ่มเติมเผยให้เห็นความหลากหลายของชนิดจุลินทรีย์ที่มากกว่าเมื่อเทียบกับตัวอย่างที่ไม่สัมผัส ซึ่งบ่งชี้ว่า PPA อาจส่งเสริมลักษณะการเจริญเติบโตของแบคทีเรียและจำกัดจำนวนประชากรแบคทีเรียที่สามารถอยู่รอดได้ในสภาพแวดล้อมที่มี PPA สูง ดังนั้น PPA อาจกระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างเลือกสรรมากกว่าที่จะก่อให้เกิดการเปลี่ยนแปลงอย่างกว้างขวางต่อความหลากหลายของจุลินทรีย์ในลำไส้
ก่อนหน้านี้มีการแสดงให้เห็นแล้วว่าสารกันบูดในอาหาร เช่น PPA สามารถเปลี่ยนแปลงปริมาณของส่วนประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้ได้โดยไม่ส่งผลกระทบต่อความหลากหลายโดยรวม (Nagpal et al., 2021) ในการศึกษาครั้งนี้ เราสังเกตเห็นความแตกต่างที่เด่นชัดที่สุดระหว่างสายพันธุ์ Bacteroidetes ภายในไฟลัม Bacteroidetes (เดิมชื่อ Bacteroidetes) ซึ่งพบว่ามีปริมาณเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับ PPA การเพิ่มขึ้นของปริมาณสายพันธุ์ Bacteroides เกี่ยวข้องกับการย่อยสลายเมือกที่เพิ่มขึ้น ซึ่งอาจเพิ่มความเสี่ยงต่อการติดเชื้อและส่งเสริมการอักเสบ (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019) จากการศึกษาหนึ่งพบว่า หนูตัวผู้แรกเกิดที่ได้รับการรักษาด้วยแบคทีเรีย Bacteroides fragilis แสดงพฤติกรรมทางสังคมที่คล้ายคลึงกับภาวะออทิสติกสเปกตรัม (ASD) (Carmel et al., 2023) และการศึกษาอื่นๆ แสดงให้เห็นว่าแบคทีเรียสกุล Bacteroides สามารถเปลี่ยนแปลงการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันและนำไปสู่โรคกล้ามเนื้อหัวใจอักเสบจากภูมิคุ้มกันบกพร่อง (Gil-Cruz et al., 2019) นอกจากนี้ ยังพบว่าแบคทีเรียในสกุล Ruminococcus, Prevotella และ Parabacteroides มีจำนวนเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับสาร PPA (Coretti et al., 2018) แบคทีเรียสกุล Ruminococcus บางชนิดมีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ เช่น โรคโครห์น ผ่านการผลิตไซโตไคน์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบ (Henke et al., 2019) ในขณะที่แบคทีเรียสกุล Prevotella เช่น Prevotella humani มีความเกี่ยวข้องกับโรคเมตาบอลิซึม เช่น ความดันโลหิตสูงและความไวต่ออินซูลิน (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017) สุดท้าย เราพบว่าอัตราส่วนของแบคทีเรียกลุ่ม Bacteroidetes (เดิมเรียกว่า Firmicutes) ต่อ Bacteroidetes โดยรวมนั้นต่ำกว่าอย่างมีนัยสำคัญในหนูที่ได้รับสาร PPA เมื่อเทียบกับหนูควบคุม เนื่องจากความอุดมสมบูรณ์โดยรวมของแบคทีเรียกลุ่ม Bacteroidetes สูงกว่า อัตราส่วนนี้เคยแสดงให้เห็นแล้วว่าเป็นตัวบ่งชี้ที่สำคัญของภาวะสมดุลในลำไส้ และความผิดปกติของอัตราส่วนนี้มีความเกี่ยวข้องกับโรคต่างๆ (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023) รวมถึงโรคอักเสบในลำไส้ (Stojanov et al., 2020) โดยรวมแล้ว สปีชีส์ในไฟลัม Bacteroidetes ดูเหมือนจะได้รับผลกระทบมากที่สุดจาก PPA ในอาหารที่สูงขึ้น นี่อาจเป็นเพราะความทนทานต่อ PPA ที่สูงกว่า หรือความสามารถในการใช้ PPA เป็นแหล่งพลังงาน ซึ่งแสดงให้เห็นแล้วว่าเป็นความจริงสำหรับอย่างน้อยหนึ่งสปีชีส์ คือ Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022) อีกทางหนึ่ง การได้รับ PPA จากแม่ อาจส่งเสริมพัฒนาการของทารกในครรภ์โดยทำให้ลำไส้ของลูกหนูมีความไวต่อการตั้งรกรากของ Bacteroidetes มากขึ้น อย่างไรก็ตาม การออกแบบการศึกษาของเราไม่อนุญาตให้ประเมินเช่นนั้น
การประเมินเนื้อหาเมตาจีโนมิกส์เผยให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญและการผลิต PPA โดยหนูที่สัมผัส PPA มีปริมาณยีนที่รับผิดชอบต่อการผลิต PPA สูงกว่า ในขณะที่หนูที่ไม่สัมผัส PPA มีปริมาณยีนที่รับผิดชอบต่อการเผาผลาญ PAA สูงกว่า (รูปที่ 6) ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าผลกระทบของ PPA ต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์อาจไม่ได้เกิดจากการใช้ PPA เพียงอย่างเดียว มิเช่นนั้นปริมาณยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA ควรจะมีปริมาณสูงกว่าในไมโครไบโอมในลำไส้ของหนูที่สัมผัส PPA คำอธิบายหนึ่งคือ PPA ควบคุมปริมาณแบคทีเรียเป็นหลักผ่านฤทธิ์ต้านจุลินทรีย์มากกว่าการที่แบคทีเรียใช้เป็นสารอาหาร การศึกษาในอดีตแสดงให้เห็นว่า PPA ยับยั้งการเจริญเติบโตของ Salmonella Typhimurium ในลักษณะที่ขึ้นอยู่กับปริมาณ (Jacobson et al., 2018) การสัมผัสกับ PPA ในความเข้มข้นสูงอาจคัดเลือกแบคทีเรียที่ทนต่อคุณสมบัติต้านจุลินทรีย์และอาจไม่สามารถเผาผลาญหรือผลิต PPA ได้ ตัวอย่างเช่น พบว่าแบคทีเรียสกุล Parabacteroides หลายชนิดมีปริมาณสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง PPA แต่ไม่พบยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญหรือการผลิต PPA (ตารางเสริม 2, 4 และ 5) ยิ่งไปกว่านั้น การผลิต PPA ซึ่งเป็นผลพลอยได้จากการหมักนั้นพบได้ทั่วไปในแบคทีเรียหลายชนิด (Gonzalez-Garcia et al., 2017) ความหลากหลายของแบคทีเรียที่สูงขึ้นอาจเป็นสาเหตุที่ทำให้พบยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA ในตัวอย่างควบคุมมากขึ้น (Averina et al., 2020) นอกจากนี้ มีเพียง 27 ยีน (2.14%) จาก 1332 ยีนเท่านั้นที่คาดการณ์ว่าเป็นยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA โดยเฉพาะ ยีนหลายตัวที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA ยังเกี่ยวข้องกับวิถีการเผาผลาญอื่นๆ ด้วย สิ่งนี้แสดงให้เห็นเพิ่มเติมว่าปริมาณของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA นั้นสูงกว่าในตัวอย่างควบคุม ยีนเหล่านี้อาจทำงานในวิถีการเผาผลาญที่ไม่ส่งผลให้เกิดการใช้หรือการสร้าง PPA เป็นผลพลอยได้ ในกรณีนี้ มีเพียงยีนเดียวที่เกี่ยวข้องกับการสร้าง PPA ที่แสดงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณระหว่างตัวอย่างแต่ละประเภท ตรงกันข้ามกับยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA ยีนบ่งชี้สำหรับการผลิต PPA ถูกเลือกเนื่องจากมีส่วนเกี่ยวข้องโดยตรงในวิถีการผลิต PPA ของแบคทีเรีย ในหนูที่สัมผัสกับ PPA พบว่าทุกสายพันธุ์มีปริมาณและความสามารถในการผลิต PPA เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสนับสนุนการคาดการณ์ว่า PPA จะคัดเลือกผู้ผลิต PPA และดังนั้นจึงคาดการณ์ได้ว่าความสามารถในการผลิต PPA จะเพิ่มขึ้น อย่างไรก็ตาม ความอุดมสมบูรณ์ของยีนไม่จำเป็นต้องสัมพันธ์กับการแสดงออกของยีน ดังนั้นแม้ว่าความอุดมสมบูรณ์ของยีนที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ PPA จะสูงกว่าในตัวอย่างควบคุม อัตราการแสดงออกอาจแตกต่างกัน (Shi et al., 2014) เพื่อยืนยันความสัมพันธ์ระหว่างความชุกของยีนที่ผลิต PPA และการผลิต PPA จำเป็นต้องมีการศึกษาการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับการผลิต PPA
การวิเคราะห์หน้าที่ของเมตาจีโนมของ PPA และกลุ่มควบคุมเผยให้เห็นความแตกต่างบางประการ การวิเคราะห์ PCA ของเนื้อหายีนเผยให้เห็นกลุ่มที่แยกจากกันระหว่างตัวอย่าง PPA และกลุ่มควบคุม (รูปที่ 5) การจัดกลุ่มภายในตัวอย่างแสดงให้เห็นว่าเนื้อหายีนของกลุ่มควบคุมมีความหลากหลายมากกว่า ในขณะที่ตัวอย่าง PPA รวมกลุ่มกัน การจัดกลุ่มตามเนื้อหายีนเทียบได้กับการจัดกลุ่มตามองค์ประกอบของสปีชีส์ ดังนั้น ความแตกต่างในความอุดมสมบูรณ์ของวิถีการเผาผลาญจึงสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลงในความอุดมสมบูรณ์ของสปีชีส์และสายพันธุ์เฉพาะภายในวิถีการเผาผลาญเหล่านั้น ในตัวอย่าง PPA วิถีการเผาผลาญสองวิถีที่มีความอุดมสมบูรณ์สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญเกี่ยวข้องกับการเผาผลาญน้ำตาลอะมิโน/น้ำตาลนิวคลีโอไทด์ (ko:K21279) และวิถีการเผาผลาญไขมันหลายวิถี (ko:K00647, ko:K03801; ตารางเสริม 3) ยีนที่เกี่ยวข้องกับ ko:K21279 เป็นที่ทราบกันว่าเกี่ยวข้องกับสกุล Bacteroides ซึ่งเป็นหนึ่งในสกุลที่มีจำนวนสปีชีส์สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่าง PPA เอนไซม์นี้สามารถหลีกเลี่ยงการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันได้โดยการแสดงออกของแคปซูลโพลีแซ็กคาไรด์ (Wang et al., 2008) ซึ่งอาจเป็นสาเหตุของการเพิ่มขึ้นของแบคทีเรียกลุ่ม Bacteroidetes ที่พบในหนูที่สัมผัสกับ PPA สิ่งนี้สอดคล้องกับการสังเคราะห์กรดไขมันที่เพิ่มขึ้นที่พบในไมโครไบโอมของ PPA แบคทีเรียใช้เส้นทาง FASIIko:K00647 (fabB) ในการผลิตกรดไขมัน ซึ่งอาจส่งผลต่อเส้นทางการเผาผลาญของโฮสต์ (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020) และการเปลี่ยนแปลงในการเผาผลาญไขมันอาจมีบทบาทในการพัฒนาของระบบประสาท (Yu et al., 2020) อีกเส้นทางหนึ่งที่แสดงให้เห็นถึงความอุดมสมบูรณ์ที่เพิ่มขึ้นในตัวอย่าง PPA คือการสังเคราะห์ฮอร์โมนสเตียรอยด์ (ko:K12343) มีหลักฐานเพิ่มมากขึ้นที่แสดงให้เห็นถึงความสัมพันธ์แบบผกผันระหว่างความสามารถของจุลินทรีย์ในลำไส้ในการส่งผลต่อระดับฮอร์โมนและการได้รับอิทธิพลจากฮอร์โมน โดยที่ระดับสเตียรอยด์ที่สูงขึ้นอาจส่งผลกระทบต่อสุขภาพในระยะยาว (Tetel et al., 2018)
การศึกษาครั้งนี้มีข้อจำกัดและข้อควรพิจารณาอยู่หลายประการ ข้อแตกต่างที่สำคัญคือ เราไม่ได้ทำการประเมินทางสรีรวิทยาของสัตว์ทดลอง ดังนั้นจึงไม่สามารถสรุปได้โดยตรงว่าการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้มีความสัมพันธ์กับโรคใดหรือไม่ ข้อควรพิจารณาอีกประการหนึ่งคือ หนูทดลองในงานวิจัยนี้ได้รับอาหารชนิดเดียวกับแม่ของพวกมัน งานวิจัยในอนาคตอาจตรวจสอบว่าการเปลี่ยนจากอาหารที่มี PPA สูงไปเป็นอาหารที่ปราศจาก PPA จะช่วยปรับปรุงผลกระทบต่อจุลินทรีย์ในลำไส้ได้หรือไม่ ข้อจำกัดประการหนึ่งของการศึกษาของเรา เช่นเดียวกับงานวิจัยอื่นๆ อีกมากมาย คือ ขนาดของกลุ่มตัวอย่างที่จำกัด แม้ว่าจะสามารถสรุปผลได้อย่างถูกต้อง แต่ขนาดของกลุ่มตัวอย่างที่ใหญ่กว่าจะให้พลังทางสถิติที่มากขึ้นเมื่อวิเคราะห์ผลลัพธ์ เรายังระมัดระวังในการสรุปความสัมพันธ์ระหว่างการเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์ในลำไส้กับโรคใดๆ (Yap et al., 2021) ปัจจัยรบกวนต่างๆ เช่น อายุ เพศ และอาหาร สามารถส่งผลต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์ได้อย่างมีนัยสำคัญ ปัจจัยเหล่านี้อาจอธิบายความไม่สอดคล้องกันที่พบในงานวิจัยเกี่ยวกับความสัมพันธ์ของจุลินทรีย์ในลำไส้กับโรคที่ซับซ้อน (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023) ตัวอย่างเช่น พบว่าสมาชิกของสกุล Bacteroidetes มีจำนวนเพิ่มขึ้นหรือลดลงในสัตว์และมนุษย์ที่เป็นโรคออทิสติก (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017) ในทำนองเดียวกัน การศึกษาองค์ประกอบของลำไส้ในผู้ป่วยโรคอักเสบในลำไส้พบว่ามีทั้งจำนวนเพิ่มขึ้นและลดลงในกลุ่มจุลินทรีย์เดียวกัน (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023) เพื่อจำกัดผลกระทบของอคติทางเพศ เราพยายามให้แน่ใจว่ามีการเป็นตัวแทนของทั้งสองเพศอย่างเท่าเทียมกัน เพื่อให้ความแตกต่างส่วนใหญ่เกิดจากอาหาร ความท้าทายอย่างหนึ่งของการระบุหน้าที่คือการกำจัดลำดับยีนที่ซ้ำซ้อน วิธีการจัดกลุ่มยีนของเราต้องการความเหมือนของลำดับ 95% และความคล้ายคลึงของความยาว 85% รวมถึงความครอบคลุมของการจัดเรียงลำดับ 90% เพื่อกำจัดการจัดกลุ่มที่ผิดพลาด อย่างไรก็ตาม ในบางกรณี เราสังเกตเห็น COG ที่มีคำอธิบายประกอบเดียวกัน (เช่น MUT) (รูปที่ 6) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อพิจารณาว่าออร์โธล็อกเหล่านี้แตกต่างกันหรือไม่ เกี่ยวข้องกับสกุลเฉพาะหรือไม่ หรือเป็นข้อจำกัดของวิธีการจัดกลุ่มยีน อีกข้อจำกัดหนึ่งของคำอธิบายประกอบเชิงฟังก์ชันคือการจำแนกประเภทที่อาจผิดพลาด ยีนแบคทีเรีย mmdA เป็นเอนไซม์ที่รู้จักกันดีซึ่งเกี่ยวข้องกับการสังเคราะห์โพรพิโอเนต แต่ KEGG ไม่ได้เชื่อมโยงกับวิถีการเผาผลาญโพรพิโอเนต ในทางตรงกันข้าม ออร์โธล็อก scpB และ mmcD มีความสัมพันธ์กัน จำนวนยีนจำนวนมากที่ไม่มีการกำหนดน็อคเอาต์อาจส่งผลให้ไม่สามารถระบุยีนที่เกี่ยวข้องกับ PPA เมื่อประเมินความอุดมสมบูรณ์ของยีน การศึกษาในอนาคตจะได้รับประโยชน์จากการวิเคราะห์เมตาแทรนสคริปโตม ซึ่งสามารถให้ความเข้าใจที่ลึกซึ้งยิ่งขึ้นเกี่ยวกับลักษณะการทำงานของจุลินทรีย์ในลำไส้และเชื่อมโยงการแสดงออกของยีนกับผลกระทบที่อาจเกิดขึ้นในภายหลัง สำหรับการศึกษาที่เกี่ยวข้องกับความผิดปกติทางระบบประสาทหรือโรคอักเสบในลำไส้โดยเฉพาะ จำเป็นต้องมีการประเมินทางสรีรวิทยาและพฤติกรรมของสัตว์เพื่อเชื่อมโยงการเปลี่ยนแปลงในองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้กับความผิดปกติเหล่านี้ นอกจากนี้ การศึกษาเพิ่มเติมโดยการปลูกถ่ายจุลินทรีย์ในลำไส้ไปยังหนูที่ปราศจากเชื้อโรคก็จะเป็นประโยชน์ในการพิจารณาว่าจุลินทรีย์ในลำไส้เป็นตัวขับเคลื่อนหรือเป็นลักษณะเฉพาะของโรคหรือไม่
โดยสรุป เราได้แสดงให้เห็นว่า PPA ในอาหารเป็นปัจจัยหนึ่งที่เปลี่ยนแปลงองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้ PPA เป็นสารกันบูดที่ได้รับการอนุมัติจาก FDA ซึ่งพบได้ทั่วไปในอาหารหลายชนิด และหากได้รับในระยะยาว อาจทำให้จุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุล เราพบการเปลี่ยนแปลงในปริมาณของแบคทีเรียหลายชนิด ซึ่งบ่งชี้ว่า PPA สามารถส่งผลต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์ในลำไส้ การเปลี่ยนแปลงของจุลินทรีย์อาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงระดับของกระบวนการเผาผลาญบางอย่าง ซึ่งอาจนำไปสู่การเปลี่ยนแปลงทางสรีรวิทยาที่เกี่ยวข้องกับสุขภาพของโฮสต์ จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบว่าผลกระทบของ PPA ในอาหารต่อองค์ประกอบของจุลินทรีย์อาจนำไปสู่ภาวะจุลินทรีย์ในลำไส้เสียสมดุลหรือโรคอื่นๆ หรือไม่ การศึกษานี้เป็นพื้นฐานสำหรับการศึกษาในอนาคตเกี่ยวกับผลกระทบของ PPA ต่อองค์ประกอบของลำไส้ต่อสุขภาพของมนุษย์
ชุดข้อมูลที่นำเสนอในงานวิจัยนี้มีอยู่ในคลังข้อมูลออนไลน์ ชื่อคลังข้อมูลและหมายเลขการเข้าถึงคือ: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431
การศึกษาในสัตว์ทดลองนี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการดูแลและใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยเซ็นทรัลฟลอริดา (UCF-IACUC) (หมายเลขใบอนุญาตใช้สัตว์ทดลอง: PROTO202000002) การศึกษานี้เป็นไปตามกฎหมาย ข้อบังคับ และข้อกำหนดของสถาบันในท้องถิ่น
NG: การวางแนวคิด, การจัดการข้อมูล, การวิเคราะห์เชิงลึก, การตรวจสอบ, ระเบียบวิธีวิจัย, ซอฟต์แวร์, การแสดงผลข้อมูล, การเขียน (ฉบับร่าง), การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) LA: การวางแนวคิด, การจัดการข้อมูล, ระเบียบวิธีวิจัย, ทรัพยากร, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) SH: การวิเคราะห์เชิงลึก, ซอฟต์แวร์, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) SA: การตรวจสอบ, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) หัวหน้ากรรมการตัดสิน: การตรวจสอบ, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) SN: การวางแนวคิด, การบริหารโครงการ, ทรัพยากร, การกำกับดูแล, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข) TA: การวางแนวคิด, การบริหารโครงการ, การกำกับดูแล, การเขียน (ตรวจทานและแก้ไข)
ผู้เขียนได้แจ้งว่าไม่ได้รับการสนับสนุนทางการเงินใดๆ สำหรับการวิจัย การเขียน และ/หรือการตีพิมพ์บทความนี้
ผู้เขียนขอประกาศว่าการวิจัยนี้ดำเนินการโดยปราศจากความสัมพันธ์ทางการค้าหรือทางการเงินใดๆ ที่อาจถือได้ว่าเป็นความขัดแย้งทางผลประโยชน์ (ไม่เกี่ยวข้อง)
ความคิดเห็นทั้งหมดที่แสดงในบทความนี้เป็นเพียงความคิดเห็นของผู้เขียนเท่านั้น และไม่จำเป็นต้องสะท้อนถึงมุมมองของสถาบัน ผู้จัดพิมพ์ บรรณาธิการ หรือผู้ตรวจสอบบทความ ผลิตภัณฑ์ใด ๆ ที่ได้รับการประเมินในบทความนี้ หรือข้อกล่าวอ้างใด ๆ ที่ผู้ผลิตกล่าวอ้างนั้น ไม่ได้รับการรับประกันหรือรับรองโดยผู้จัดพิมพ์
เอกสารประกอบเพิ่มเติมสำหรับบทความนี้สามารถดูได้ทางออนไลน์ที่: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Abdelli LS, Samsam A, Nasser SA (2019). กรดโพรพิโอนิกชักนำให้เกิดภาวะกลิโอซิสและการอักเสบของระบบประสาทโดยการควบคุมวิถี PTEN/AKT ในกลุ่มอาการออทิสติก Scientific reports 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Aitchison, J. (1982). การวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลองค์ประกอบ JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ahn J, Kwon H, Kim YJ (2023). อัตราส่วน Firmicutes/Bacteroidetes เป็นปัจจัยเสี่ยงต่อมะเร็งเต้านม วารสารเวชศาสตร์คลินิก, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Anders S., Huber W. (2010). การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันจากข้อมูลการนับลำดับ. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Angelis, MD, Piccolo, M., Vannini, L., Siragusa, S., Giacomo, AD, Serrazanetti, DI และคณะ (2013). จุลินทรีย์ในอุจจาระและเมตาโบไลต์ในเด็กออทิสติกและความผิดปกติทางพัฒนาการแบบไม่ระบุประเภท PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Averina OV, Kovtun AS, Polyakova SI, Savilova AM, Rebrikov DV, Danilenko VN (2020). ลักษณะทางประสาทและเมตาบอลิซึมของแบคทีเรียในจุลินทรีย์ในลำไส้ของเด็กเล็กที่มีภาวะออทิสติกสเปกตรัม วารสารจุลชีววิทยาทางการแพทย์ 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Baquero F., Nombela K. (2012). ไมโครไบโอมในฐานะอวัยวะของมนุษย์ วารสารจุลชีววิทยาและการติดเชื้อทางคลินิก 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Baur T., Dürre P. (2023). ข้อมูลเชิงลึกใหม่เกี่ยวกับสรีรวิทยาของแบคทีเรียที่ผลิตกรดโพรพิโอนิก: Anaerotignum propionicum และ Anaerotignum neopropionicum (เดิมชื่อ Clostridium propionicum และ Clostridium neopropionicum) Microorganisms 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
บาเซอร์ เอฟดับบลิว, สเปนเซอร์ เตเต้, อู๋ จี, คัดด์ ทีเอ, ไมนิงเงอร์ เอสเจ (2004) โภชนาการของมารดาและพัฒนาการของทารกในครรภ์ เจ นัท. 134, 2169–2172. ดอย: 10.1093/jn/134.9.2169
เบนจามินี, วาย. และ ฮอคเบิร์ก, เจ. (1995). การควบคุมอัตราผลบวกเท็จ: แนวทางปฏิบัติที่มีประสิทธิภาพสำหรับการทดสอบหลายครั้ง JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x