สารเมตาบอไลต์ที่ปรับเปลี่ยนระบบภูมิคุ้มกันเป็นคุณลักษณะสำคัญของสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) แต่โดยส่วนใหญ่แล้วยังไม่ทราบตัวตนของสารเหล่านี้ ในที่นี้ เราได้วิเคราะห์เนื้องอกและเซลล์ T จากเนื้องอกและน้ำในช่องท้องของผู้ป่วยที่เป็นมะเร็งรังไข่ชนิดซีรัสเกรดสูง (HGSC) เพื่อเปิดเผยเมตาบอไลต์ของส่วนประกอบต่างๆ ของ TME เหล่านี้ น้ำในช่องท้องและเซลล์เนื้องอกมีความแตกต่างของเมตาบอไลต์อย่างมาก เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำในช่องท้อง เซลล์ T ที่แทรกซึมอยู่ในเนื้องอกมี 1-เมทิลนิโคตินาไมด์ (MNA) สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ แม้ว่าระดับของ MNA ในเซลล์ T จะสูงขึ้น แต่การแสดงออกของเอนไซม์นิโคตินาไมด์ เอ็น-เมทิลทรานสเฟอเรส (เอนไซม์ที่เร่งปฏิกิริยาการถ่ายโอนหมู่เมทิลจากเอส-อะดีโนซิลเมไทโอนีนไปยังนิโคตินาไมด์) นั้นจำกัดอยู่เฉพาะในไฟโบรบลาสต์และเซลล์เนื้องอกเท่านั้น ในเชิงหน้าที่ MNA กระตุ้นให้เซลล์ T หลั่งไซโตไคน์ที่ส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอก คือ ทูมอร์เนโครซิสแฟคเตอร์อัลฟา ดังนั้น MNA ที่ได้จาก TME จึงมีส่วนช่วยในการควบคุมภูมิคุ้มกันของเซลล์ T และเป็นเป้าหมายที่มีศักยภาพสำหรับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันเพื่อรักษามะเร็งในมนุษย์
เมตาโบไลต์ที่ได้จากเนื้องอกสามารถมีผลยับยั้งภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกอย่างมาก และมีหลักฐานเพิ่มมากขึ้นเรื่อยๆ ที่แสดงให้เห็นว่าพวกมันยังสามารถทำหน้าที่เป็นแรงขับเคลื่อนสำคัญสำหรับการลุกลามของโรคได้อีกด้วย (1) นอกเหนือจากผลกระทบของ Warburg แล้ว งานวิจัยล่าสุดได้เริ่มศึกษาลักษณะสถานะการเผาผลาญของเซลล์เนื้องอกและความสัมพันธ์กับสถานะภูมิคุ้มกันของสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) การศึกษาในแบบจำลองหนูและเซลล์ T ของมนุษย์แสดงให้เห็นว่าการเผาผลาญกลูตามีน (2) การเผาผลาญออกซิเดชัน (3) และการเผาผลาญกลูโคส (4) สามารถทำงานได้อย่างอิสระในกลุ่มย่อยของเซลล์ภูมิคุ้มกันต่างๆ เมตาโบไลต์หลายชนิดในเส้นทางเหล่านี้ยับยั้งการทำงานต่อต้านเนื้องอกของเซลล์ T ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าการปิดกั้นโคเอนไซม์เตตระไฮโดรไบโอเทอริน (BH4) สามารถทำลายการแพร่กระจายของเซลล์ T และการเพิ่มขึ้นของ BH4 ในร่างกายสามารถเพิ่มการตอบสนองภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอกที่เกิดจาก CD4 และ CD8 ได้ นอกจากนี้ ผลการกดภูมิคุ้มกันของคีนูเรนีนสามารถบรรเทาได้ด้วยการให้ BH4 (5) ในกลิโอบลาสโตมากลายพันธุ์ไอโซซิเตรตดีไฮโดรจีเนส (IDH) การหลั่งของเอนันติโอเมตาโบลิก (R)-2-ไฮดรอกซีกลูตาเรต (R-2-HG) ยับยั้งการกระตุ้น การแพร่กระจาย และการทำลายเซลล์ T (6) เมื่อเร็วๆ นี้ พบว่าเมทิลไกลออกซาล ซึ่งเป็นผลพลอยได้จากไกลโคไลซิส ถูกผลิตโดยเซลล์กดภูมิคุ้มกันที่มีต้นกำเนิดจากไมอีลอยด์ และการถ่ายโอนเมทิลไกลออกซาลไปยังเซลล์ T สามารถยับยั้งการทำงานของเซลล์ T เอฟเฟกเตอร์ได้ ในการรักษา การทำให้เมทิลไกลออกซาลเป็นกลางสามารถเอาชนะการทำงานของเซลล์กดภูมิคุ้มกันที่ได้จากไมอีลอยด์ (MDSC) และเสริมฤทธิ์กันในการบำบัดด้วยการปิดกั้นจุดตรวจสอบในแบบจำลองหนู (7) การศึกษาเหล่านี้เน้นย้ำถึงบทบาทสำคัญของเมตาโบไลต์ที่ได้จาก TME ในการควบคุมการทำงานและกิจกรรมของเซลล์ T
การทำงานผิดปกติของเซลล์ T ได้รับการรายงานอย่างกว้างขวางในมะเร็งรังไข่ (8) ซึ่งส่วนหนึ่งเป็นผลมาจากลักษณะการเผาผลาญที่เกิดขึ้นในภาวะขาดออกซิเจนและหลอดเลือดของเนื้องอกที่ผิดปกติ (9) ซึ่งส่งผลให้กลูโคสและทริปโตเฟนถูกเปลี่ยนเป็นผลิตภัณฑ์พลอยได้ เช่น กรดแลคติกและคีนูเรนีน แลคเตทนอกเซลล์ที่มากเกินไปจะลดการผลิตอินเตอร์เฟรอน-γ (IFN-γ) และกระตุ้นการแยกตัวของกลุ่มย่อยที่กดการทำงานของไขกระดูก (10, 11) การบริโภคทริปโตเฟนจะยับยั้งการเพิ่มจำนวนของเซลล์ T โดยตรงและยับยั้งการส่งสัญญาณของตัวรับเซลล์ T (12-14) แม้จะมีข้อสังเกตเหล่านี้ งานวิจัยจำนวนมากเกี่ยวกับการเผาผลาญของระบบภูมิคุ้มกันได้ดำเนินการในวัฒนธรรมเซลล์ T ในหลอดทดลองโดยใช้สื่อที่ได้รับการปรับให้เหมาะสม หรือจำกัดอยู่เฉพาะแบบจำลองหนูที่คล้ายคลึงกันในร่างกาย ซึ่งทั้งสองอย่างนี้ไม่ได้สะท้อนถึงความหลากหลายของมะเร็งในมนุษย์และสภาพแวดล้อมระดับมหภาคและจุลภาคทางสรีรวิทยาอย่างเต็มที่
ลักษณะทั่วไปของมะเร็งรังไข่คือการแพร่กระจายในช่องท้องและการเกิดน้ำในช่องท้อง การสะสมของของเหลวในช่องท้องมีความสัมพันธ์กับโรคที่ลุกลามและพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (15) จากรายงานพบว่าช่องว่างเฉพาะนี้มีภาวะขาดออกซิเจน มีระดับของปัจจัยการเจริญเติบโตของหลอดเลือด (VEGF) และอินโดลามีน 2,3-ไดออกซิเจเนส (IDO) สูง และมีเซลล์ T ควบคุมและเซลล์ยับยั้งไมอีลอยด์แทรกซึมอยู่ (15-18) สภาพแวดล้อมทางเมตาบอลิซึมของน้ำในช่องท้องอาจแตกต่างจากของเนื้องอกเอง ดังนั้นการปรับเปลี่ยนโปรแกรมของเซลล์ T ในช่องท้องจึงยังไม่ชัดเจน นอกจากนี้ ความแตกต่างที่สำคัญและความไม่สม่ำเสมอระหว่างน้ำในช่องท้องและสารเมตาบอไลต์ที่มีอยู่ในสภาพแวดล้อมของเนื้องอกอาจขัดขวางการแทรกซึมของเซลล์ภูมิคุ้มกันและหน้าที่ของเซลล์เหล่านั้นต่อเนื้องอก และจำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติม
เพื่อแก้ปัญหาเหล่านี้ เราได้ออกแบบวิธีการแยกเซลล์ที่มีความไวสูงและการวิเคราะห์ด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวควบคู่กับแมสสเปกโทรเมตรี (LC-MS/MS) เพื่อศึกษาเซลล์ประเภทต่างๆ (รวมถึงเซลล์ T CD4+ และ CD8+) ตลอดจนเมตาบอไลต์ภายในและระหว่างเนื้องอก ซึ่งครอบคลุมเซลล์ในน้ำในช่องท้องและสภาพแวดล้อมของเนื้องอกเดียวกันของผู้ป่วย เราใช้วิธีนี้ร่วมกับการวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมตรีแบบหลายมิติและการจัดลำดับ RNA ระดับเซลล์เดี่ยว (scRNA-seq) เพื่อให้ได้ภาพที่มีความละเอียดสูงของสถานะเมตาบอลิซึมของประชากรหลักเหล่านี้ วิธีนี้เผยให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของระดับ 1-เมทิลนิโคตินาไมด์ (MNA) ในเซลล์ T ของเนื้องอก และการทดลองในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่าผลการปรับภูมิคุ้มกันของ MNA ต่อการทำงานของเซลล์ T นั้นเป็นสิ่งที่ไม่เคยทราบมาก่อน โดยทั่วไป วิธีนี้เผยให้เห็นปฏิสัมพันธ์ทางเมตาบอลิซึมระหว่างเนื้องอกและเซลล์ภูมิคุ้มกัน และให้ข้อมูลเชิงลึกที่ไม่เหมือนใครเกี่ยวกับเมตาบอไลต์ที่ควบคุมภูมิคุ้มกัน ซึ่งอาจเป็นประโยชน์สำหรับโอกาสในการรักษาด้วยภูมิคุ้มกันบำบัดมะเร็งรังไข่โดยใช้เซลล์ T
เราใช้โฟลว์ไซโตเมทรีแบบหลายมิติเพื่อวัดปริมาณการดูดซึมกลูโคสพร้อมกัน [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) และกิจกรรมของไมโทคอนเดรีย [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) เป็นเครื่องหมายทั่วไปที่ใช้แยกแยะเซลล์ภูมิคุ้มกันและเซลล์มะเร็ง (ตาราง S2 และรูป S1A) การวิเคราะห์นี้แสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ T เซลล์น้ำในช่องท้องและเซลล์มะเร็งมีการดูดซึมกลูโคสในระดับที่สูงกว่า แต่มีความแตกต่างในกิจกรรมของไมโทคอนเดรียน้อยกว่า การดูดซึมกลูโคสโดยเฉลี่ยของเซลล์มะเร็ง [CD45-EpCAM (EpCAM)+] สูงกว่าเซลล์ T ถึง 3-4 เท่า และการดูดซึมกลูโคสโดยเฉลี่ยของเซลล์ T ชนิด CD4+ สูงกว่าเซลล์ T ชนิด CD8+ ถึง 1.2 เท่า ซึ่งแสดงให้เห็นว่าลิมโฟไซต์ที่แทรกซึมอยู่ในเนื้องอก (TIL) มีความต้องการทางเมตาบอลิซึมที่แตกต่างกัน แม้จะอยู่ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของเนื้องอก (TME) เดียวกัน (รูปที่ 1A) ในทางตรงกันข้าม กิจกรรมของไมโทคอนเดรียในเซลล์มะเร็งนั้นคล้ายคลึงกับเซลล์ T ชนิด CD4+ และกิจกรรมของไมโทคอนเดรียของเซลล์ทั้งสองชนิดสูงกว่าเซลล์ T ชนิด CD8+ (รูปที่ 1B) โดยทั่วไป ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงระดับเมตาบอลิซึม กิจกรรมเมตาบอลิซึมของเซลล์มะเร็งสูงกว่าเซลล์ T ชนิด CD4+ และกิจกรรมเมตาบอลิซึมของเซลล์ T ชนิด CD4+ สูงกว่าเซลล์ T ชนิด CD8+ แม้จะมีผลกระทบเหล่านี้ในเซลล์แต่ละชนิด แต่ก็ไม่มีความแตกต่างที่สม่ำเสมอในสถานะเมตาบอลิซึมของเซลล์ T ชนิด CD4+ และ CD8+ หรือสัดส่วนสัมพัทธ์ของเซลล์เหล่านี้ในน้ำในช่องท้องเมื่อเทียบกับเนื้องอก (รูปที่ 1C) ในทางตรงกันข้าม ในส่วนของเซลล์ CD45 สัดส่วนของเซลล์ EpCAM+ ในเนื้องอกเพิ่มขึ้นเมื่อเทียบกับของเหลวในช่องท้อง (รูปที่ 1D) เรายังสังเกตเห็นความแตกต่างทางเมตาบอลิซึมที่ชัดเจนระหว่างส่วนประกอบของเซลล์ EpCAM+ และ EpCAM- เซลล์ EpCAM+ (เนื้องอก) มีการดูดซึมกลูโคสและกิจกรรมของไมโทคอนเดรียสูงกว่าเซลล์ EpCAM- ซึ่งสูงกว่ากิจกรรมเมตาบอลิซึมของไฟโบรบลาสต์ในเซลล์เนื้องอกใน TME มาก (รูปที่ 1, E และ F)
(A และ B) ความเข้มของฟลูออเรสเซนซ์เฉลี่ย (MFI) ของการดูดซึมกลูโคส (2-NBDG) (A) และกิจกรรมของไมโทคอนเดรียของเซลล์ T CD4+ (MitoTracker สีแดงเข้ม) (B) กราฟตัวอย่าง (ซ้าย) และข้อมูลในตาราง (ขวา) ของเซลล์ T CD8+ และเซลล์เนื้องอก EpCAM+ CD45- จากน้ำในช่องท้องและเนื้องอก (C) อัตราส่วนของเซลล์ CD4+ และ CD8+ (ของเซลล์ T CD3+) ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอก (D) สัดส่วนของเซลล์เนื้องอก EpCAM+ ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอก (CD45−) (E และ F) การดูดซึมกลูโคส (2-NBDG) ของเซลล์เนื้องอก EpCAM+ CD45- และเซลล์เมทริกซ์ EpCAM-CD45- (E) และกิจกรรมของไมโทคอนเดรีย (MitoTracker สีแดงเข้ม) (F) กราฟตัวอย่าง (ซ้าย) และข้อมูลในตาราง (ขวา) ของเซลล์ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอก (G) กราฟแสดงการแสดงออกของ CD25, CD137 และ PD1 โดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี (H และ I) การแสดงออกของ CD25, CD137 และ PD1 บนเซลล์ T CD4+ (H) และเซลล์ T CD8+ (I) (J และ K) ฟีโนไทป์ของเซลล์ Naive, Central Memory (Tcm), Effector (Teff) และ Effector Memory (Tem) โดยพิจารณาจากการแสดงออกของ CCR7 และ CD45RO ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และข้อมูลในตาราง (ขวา) ของเซลล์ T CD4+ (J) และเซลล์ T CD8+ (K) ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอก ค่า P ถูกกำหนดโดยการทดสอบ t แบบจับคู่ (*P<0.05, **P<0.01 และ ***P<0.001) เส้นแสดงถึงผู้ป่วยที่จับคู่กัน (n = 6) FMO คือค่าฟลูออเรสเซนซ์ลบหนึ่ง; MFI คือค่ามัธยฐานของความเข้มฟลูออเรสเซนซ์
การวิเคราะห์เพิ่มเติมเผยให้เห็นความแตกต่างที่สำคัญอื่นๆ ระหว่างสถานะฟีโนไทป์ของเซลล์ T ที่มีความละเอียดสูง เซลล์ที่ถูกกระตุ้น (รูปที่ 1, G ถึง I) และเซลล์หน่วยความจำแบบออกฤทธิ์ (รูปที่ 1, J และ K) ในเนื้องอกมีความถี่มากกว่าในน้ำในช่องท้อง (สัดส่วนของเซลล์ T CD3+) ในทำนองเดียวกัน การวิเคราะห์ฟีโนไทป์โดยการแสดงออกของเครื่องหมายการกระตุ้น (CD25 และ CD137) และเครื่องหมายการลดลง [โปรตีนการตายของเซลล์แบบโปรแกรม 1 (PD1)] แสดงให้เห็นว่าแม้ลักษณะการเผาผลาญของประชากรเหล่านี้จะแตกต่างกัน (รูปที่ S1, B ถึง E) แต่ก็ไม่พบความแตกต่างในการเผาผลาญที่สำคัญอย่างสม่ำเสมอระหว่างกลุ่มย่อยของเซลล์ที่ไม่เคยสัมผัสกับแอนติเจน เซลล์แบบออกฤทธิ์ หรือเซลล์หน่วยความจำ (รูปที่ S1, F ถึง I) ผลลัพธ์เหล่านี้ได้รับการยืนยันโดยใช้วิธีการเรียนรู้ของเครื่องจักรเพื่อกำหนดฟีโนไทป์ของเซลล์โดยอัตโนมัติ (21) ซึ่งเผยให้เห็นเพิ่มเติมถึงการมีอยู่ของเซลล์ไขกระดูกจำนวนมาก (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) ในน้ำในช่องท้องของผู้ป่วย (รูปที่ S2A) ในบรรดาเซลล์ทุกประเภทที่ระบุได้ เซลล์กลุ่มไมอีลอยด์นี้แสดงให้เห็นการดูดซึมกลูโคสและกิจกรรมของไมโทคอนเดรียสูงที่สุด (รูปที่ S2, B ถึง G) ผลลัพธ์เหล่านี้เน้นให้เห็นถึงความแตกต่างทางเมตาบอลิซึมที่ชัดเจนระหว่างเซลล์หลายประเภทที่พบในน้ำในช่องท้องและเนื้องอกในผู้ป่วย HGSC
ความท้าทายหลักในการทำความเข้าใจลักษณะเมตาโบโนมิกของ TIL คือความจำเป็นในการแยกตัวอย่างเซลล์ T ที่มีความบริสุทธิ์ คุณภาพ และปริมาณที่เพียงพอจากเนื้องอก การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าวิธีการคัดแยกและการเพิ่มความเข้มข้นด้วยลูกปัดโดยอาศัยโฟลว์ไซโตเมทรีอาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงในโปรไฟล์เมตาโบไลต์ของเซลล์ (22-24) เพื่อเอาชนะปัญหานี้ เราได้ปรับวิธีการเพิ่มความเข้มข้นด้วยลูกปัดให้เหมาะสมเพื่อแยก TIL จากมะเร็งรังไข่ของมนุษย์ที่ถูกตัดออกทางศัลยกรรมก่อนการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS (ดูวัสดุและวิธีการ; รูปที่ 2A) เพื่อประเมินผลกระทบโดยรวมของโปรโตคอลนี้ต่อการเปลี่ยนแปลงของเมตาโบไลต์ เราได้เปรียบเทียบโปรไฟล์เมตาโบไลต์ของเซลล์ T ที่ถูกกระตุ้นโดยผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีหลังจากขั้นตอนการแยกด้วยลูกปัดข้างต้นกับเซลล์ที่ไม่ได้แยกด้วยลูกปัดแต่เก็บไว้ในน้ำแข็ง การวิเคราะห์การควบคุมคุณภาพนี้พบว่ามีความสัมพันธ์สูงระหว่างสองสภาวะนี้ (r = 0.77) และความสามารถในการทำซ้ำทางเทคนิคของกลุ่มเมตาโบไลต์ 86 ชนิดมีความสามารถในการทำซ้ำสูง (รูปที่ 2B) ดังนั้น วิธีการเหล่านี้จึงสามารถทำการวิเคราะห์เมตาโบไลต์ได้อย่างแม่นยำในเซลล์ที่กำลังได้รับการคัดเลือกตามประเภทเซลล์ จึงเป็นแพลตฟอร์มความละเอียดสูงแรกสำหรับการระบุเมตาโบไลต์เฉพาะใน HGSC ซึ่งจะช่วยให้ผู้คนเข้าใจโปรแกรมการเผาผลาญทางเพศที่เฉพาะเจาะจงของเซลล์ได้ลึกซึ้งยิ่งขึ้น
(A) แผนภาพแสดงขั้นตอนการเพิ่มความเข้มข้นของอนุภาคแม่เหล็ก ก่อนการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS เซลล์จะผ่านกระบวนการเพิ่มความเข้มข้นของอนุภาคแม่เหล็ก 3 รอบติดต่อกัน หรือเก็บไว้ในน้ำแข็ง (B) ผลของวิธีการเพิ่มความเข้มข้นต่อปริมาณของสารเมตาบอไลต์ ค่าเฉลี่ยของการวัด 3 ครั้งสำหรับแต่ละวิธีการเพิ่มความเข้มข้น ± ค่าความคลาดเคลื่อนมาตรฐาน (SE) เส้นสีเทาแสดงถึงความสัมพันธ์แบบ 1:1 ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ภายในกลุ่ม (ICC) ของการวัดซ้ำแสดงในป้ายกำกับแกน NAD คือ นิโคตินาไมด์ อะดีนีน ไดนิวคลีโอไทด์ (C) แผนภาพแสดงขั้นตอนการทำงานของการวิเคราะห์สารเมตาบอไลต์ของผู้ป่วย เก็บตัวอย่างน้ำในช่องท้องหรือเนื้องอกจากผู้ป่วยและแช่แข็ง ตัวอย่างส่วนน้อยจะถูกวิเคราะห์ด้วยโฟลว์ไซโตเมตรี ในขณะที่ตัวอย่างที่เหลือจะผ่านกระบวนการเพิ่มความเข้มข้น 3 รอบสำหรับเซลล์ CD4+, CD8+ และ CD45- จากนั้นจึงวิเคราะห์เศษส่วนของเซลล์เหล่านี้โดยใช้ LC-MS/MS (D) แผนภูมิความร้อนแสดงปริมาณสารเมตาบอไลต์ที่ได้มาตรฐาน เดนโดแกรมแสดงถึงการจัดกลุ่มแบบวอร์ดของระยะทางแบบยูคลิดระหว่างตัวอย่าง (E) การวิเคราะห์ส่วนประกอบหลัก (PCA) ของแผนที่เมตาโบไลต์ของตัวอย่าง แสดงตัวอย่างที่ทำซ้ำ 3 ครั้งของแต่ละตัวอย่าง โดยตัวอย่างจากผู้ป่วยคนเดียวกันจะเชื่อมต่อกันด้วยเส้น (F) PCA ของโปรไฟล์เมตาโบไลต์ของตัวอย่างโดยพิจารณาจากผู้ป่วย (เช่น การใช้ความซ้ำซ้อนบางส่วน) ประเภทของตัวอย่างถูกจำกัดโดยขอบเขตนูน PC1 คือส่วนประกอบหลักที่ 1 PC2 คือส่วนประกอบหลักที่ 2
ถัดมา เราได้ประยุกต์ใช้วิธีการเพิ่มความเข้มข้นนี้เพื่อวิเคราะห์เมตาโบไลต์ 99 ชนิดในกลุ่มเซลล์ CD4+, CD8+ และ CD45- ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอกของผู้ป่วย HGSC จำนวน 6 ราย (รูปที่ 2C, รูปที่ S3A และตารางที่ S3 และ S4) กลุ่มเซลล์ที่สนใจคิดเป็น 2% ถึง 70% ของตัวอย่างเซลล์ที่มีชีวิตขนาดใหญ่ดั้งเดิม และสัดส่วนของเซลล์จะแตกต่างกันอย่างมากในแต่ละผู้ป่วย หลังจากแยกเม็ดบีดแล้ว กลุ่มเซลล์ที่สนใจ (CD4+, CD8+ หรือ CD45-) ที่เพิ่มความเข้มข้นแล้วคิดเป็นมากกว่า 85% ของเซลล์ที่มีชีวิตทั้งหมดในตัวอย่างโดยเฉลี่ย วิธีการเพิ่มความเข้มข้นนี้ช่วยให้เราสามารถวิเคราะห์กลุ่มเซลล์จากกระบวนการเผาผลาญของเนื้อเยื่อเนื้องอกของมนุษย์ ซึ่งเป็นไปไม่ได้ที่จะทำจากตัวอย่างขนาดใหญ่ การใช้โปรโตคอลนี้ เราพบว่า l-kynurenine และ adenosine ซึ่งเป็นเมตาโบไลต์ที่กดภูมิคุ้มกันที่รู้จักกันดีสองชนิดนี้ มีระดับสูงขึ้นในเซลล์ T ของเนื้องอกหรือเซลล์เนื้องอก (รูปที่ S3, B และ C) ดังนั้น ผลลัพธ์เหล่านี้จึงแสดงให้เห็นถึงความแม่นยำและความสามารถของเทคโนโลยีการแยกเซลล์และการวิเคราะห์มวลสารของเราในการค้นหาสารเมตาบอไลต์ที่มีความสำคัญทางชีวภาพในเนื้อเยื่อของผู้ป่วย
การวิเคราะห์ของเรายังเผยให้เห็นการแยกประเภทเซลล์ตามกระบวนการเมตาบอลิซึมอย่างชัดเจนทั้งภายในและระหว่างผู้ป่วย (รูปที่ 2D และรูปที่ S4A) โดยเฉพาะอย่างยิ่ง เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยรายอื่น ผู้ป่วยหมายเลข 70 แสดงลักษณะเมตาบอลิซึมที่แตกต่างออกไป (รูปที่ 2E และรูปที่ S4B) ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจมีความแตกต่างกันอย่างมากในกระบวนการเมตาบอลิซึมระหว่างผู้ป่วย เป็นที่น่าสังเกตว่า เมื่อเปรียบเทียบกับผู้ป่วยรายอื่น (1.2 ถึง 2 ลิตร; ตารางที่ S1) ปริมาณน้ำในช่องท้องที่เก็บได้ทั้งหมดในผู้ป่วยหมายเลข 70 (80 มล.) นั้นมีปริมาณน้อยกว่า การควบคุมความแตกต่างระหว่างผู้ป่วยในระหว่างการวิเคราะห์องค์ประกอบหลัก (เช่น การใช้การวิเคราะห์ความซ้ำซ้อนบางส่วน) แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงที่สอดคล้องกันระหว่างประเภทเซลล์ และประเภทเซลล์และ/หรือสภาพแวดล้อมจุลภาคจะถูกจัดกลุ่มอย่างชัดเจนตามโปรไฟล์ของสารเมตาบอไลต์ (รูปที่ 2F) การวิเคราะห์สารเมตาบอไลต์แต่ละตัวเน้นย้ำถึงผลกระทบเหล่านี้และเผยให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างประเภทเซลล์และสภาพแวดล้อมจุลภาค เป็นที่น่าสังเกตว่าความแตกต่างที่เด่นชัดที่สุดคือ MNA ซึ่งมักพบมากในเซลล์ CD45- และในเซลล์ CD4+ และ CD8+ ที่แทรกซึมเข้าไปในเนื้องอก (รูปที่ 3A) สำหรับเซลล์ CD4+ ผลกระทบนี้ชัดเจนที่สุด และ MNA ในเซลล์ CD8+ ก็ดูเหมือนจะได้รับผลกระทบจากสภาพแวดล้อมอย่างมากเช่นกัน อย่างไรก็ตาม เรื่องนี้ไม่สำคัญ เนื่องจากสามารถประเมินคะแนน CD8+ ของเนื้องอกได้เพียง 3 ใน 6 ของผู้ป่วยเท่านั้น นอกจาก MNA แล้ว ในเซลล์ชนิดต่างๆ ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอก สารเมตาบอไลต์อื่นๆ ที่ยังไม่ได้รับการศึกษาอย่างละเอียดใน TIL ก็มีความเข้มข้นแตกต่างกันเช่นกัน (รูปที่ S3 และ S4) ดังนั้น ข้อมูลเหล่านี้จึงเผยให้เห็นชุดของสารเมตาบอไลต์ที่มีฤทธิ์ในการปรับภูมิคุ้มกันที่น่าสนใจสำหรับการวิจัยเพิ่มเติม
(A) ปริมาณ MNA ที่ได้รับการปรับค่ามาตรฐานในเซลล์ CD4+, CD8+ และ CD45- จากน้ำในช่องท้องและเนื้องอก แผนภาพกล่องแสดงค่ามัธยฐาน (เส้น), ช่วงควาร์ไทล์ (บานพับของกรอบ) และช่วงข้อมูล สูงสุด 1.5 เท่าของช่วงควาร์ไทล์ (หนวดของกรอบ) ตามที่อธิบายไว้ในวัสดุและวิธีการของผู้ป่วย ให้ใช้ค่า limma ของผู้ป่วยเพื่อกำหนดค่า P (*P<0.05 และ **P<0.01) (B) แผนภาพโครงร่างของการเผาผลาญ MNA (60) สารเมตาบอไลต์: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, นิโคตินาไมด์โมโนนิวคลีโอไทด์ เอนไซม์ (สีเขียว): NNMT, นิโคตินาไมด์ N-เมทิลทรานสเฟอเรส; SIRT, เซอร์ทูอินส์; NAMPT, นิโคตินาไมด์ฟอสโฟริโบซิลทรานสเฟอเรส; AOX1, อัลดีไฮด์ออกซิเดส 1; NRK, นิโคตินาไมด์ไรโบไซด์ไคเนส; NMNAT, นิโคตินาไมด์โมโนนิวคลีโอไทด์อะดีนิเลตทรานสเฟอเรส; Pnp1, พิวรีนนิวคลีโอไซด์ฟอสโฟริเลส (C) t-SNE ของ scRNA-seq ของน้ำในช่องท้อง (สีเทา) และเนื้องอก (สีแดง; n = 3 ผู้ป่วย) (D) การแสดงออกของ NNMT ในประชากรเซลล์ต่างๆ ที่ระบุโดยใช้ scRNA-seq (E) การแสดงออกของ NNMT และ AOX1 ใน SK-OV-3, เซลล์ไตตัวอ่อนมนุษย์ (HEK) 293T, เซลล์ T และเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA การแสดงออกที่พับแล้วแสดงเทียบกับ SK-OV-3 (F) รูปแบบการแสดงออกด้วย SEM แสดงไว้ (n = 6 ผู้บริจาคสุขภาพดี) ค่า Ct ที่มากกว่า 35 ถือว่าตรวจไม่พบ (UD) (F) การแสดงออกของ SLC22A1 และ SLC22A2 ใน SK-OV-3, HEK293T, เซลล์ T และเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA 8 mM รูปแบบการแสดงออกที่พับแล้วแสดงไว้โดยเทียบกับ SK-OV-3 รูปแบบการแสดงออกด้วย SEM แสดงไว้ (n = 6 ผู้บริจาคสุขภาพดี) ค่า Ct ที่มากกว่า 35 ถือว่าตรวจไม่พบ (UD) (G) ปริมาณ MNA ในเซลล์ T ที่ถูกกระตุ้นของผู้บริจาคสุขภาพดีหลังจากบ่มด้วย MNA เป็นเวลา 72 ชั่วโมง รูปแบบการแสดงออกด้วย SEM แสดงไว้ (n = 4 ผู้บริจาคสุขภาพดี)
MNA ถูกสร้างขึ้นโดยการถ่ายโอนหมู่เมทิลจาก S-adenosyl-1-methionine (SAM) ไปยังนิโคตินาไมด์ (NA) โดยนิโคตินาไมด์ N-เมทิลทรานสเฟอเรส (NNMT; รูปที่ 3B) NNMT มีการแสดงออกมากเกินไปในมะเร็งหลายชนิดในมนุษย์และเกี่ยวข้องกับการเพิ่มจำนวน การรุกราน และการแพร่กระจาย (25-27) เพื่อให้เข้าใจแหล่งที่มาของ MNA ในเซลล์ T ใน TME ได้ดียิ่งขึ้น เราจึงใช้ scRNA-seq เพื่อศึกษาลักษณะการแสดงออกของ NNMT ในเซลล์ประเภทต่างๆ ในน้ำในช่องท้องและเนื้องอกของผู้ป่วย HGSC สามราย (ตาราง S5) การวิเคราะห์เซลล์ประมาณ 6,500 เซลล์แสดงให้เห็นว่าในน้ำในช่องท้องและสภาพแวดล้อมของเนื้องอก การแสดงออกของ NNMT ถูกจำกัดอยู่ในกลุ่มเซลล์ไฟโบรบลาสต์และเซลล์เนื้องอกที่คาดการณ์ไว้ (รูปที่ 3, C และ D) เป็นที่น่าสังเกตว่าไม่มีการแสดงออกของ NNMT ที่ชัดเจนในประชากรใดๆ ที่แสดงออก PTPRC (CD45 +) (รูปที่ 3D และรูปที่ S5A) ซึ่งบ่งชี้ว่า MNA ที่ตรวจพบในสเปกตรัมของเมตาโบไลต์ได้ถูกนำเข้าสู่เซลล์ T แล้ว การแสดงออกของอัลดีไฮด์ออกซิเดส 1 (AOX1) ที่แปลง MNA เป็น 1-เมทิล-2-ไพริดอน-5-คาร์บอกซาไมด์ (2-PYR) หรือ 1-เมทิล-4-ไพริดอน-5-คาร์บอกซาไมด์ (4-PYR); รูปที่ 3B) ก็จำกัดอยู่เฉพาะในประชากรของไฟโบรบลาสต์ที่แสดงออก COL1A1 (รูปที่ S5A) ซึ่งทั้งหมดนี้บ่งชี้ว่าเซลล์ T ขาดความสามารถในการเผาผลาญ MNA แบบดั้งเดิม รูปแบบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ MNA เหล่านี้ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ชุดข้อมูลเซลล์อิสระชุดที่สองจากน้ำในช่องท้องของผู้ป่วย HGSC (รูปที่ S5B; n = 6) (16) นอกจากนี้ การวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่พอลิเมอเรสเชิงปริมาณ (qPCR) ของเซลล์ T จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีซึ่งได้รับการรักษาด้วย MNA แสดงให้เห็นว่า เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์เนื้องอกรังไข่ SK-OV-3 ที่ใช้เป็นกลุ่มควบคุม พบว่า NNMT หรือ AOX1 แทบจะไม่มีการแสดงออกเลย (รูปที่ 3E) ผลลัพธ์ที่ไม่คาดคิดเหล่านี้บ่งชี้ว่า MNA อาจถูกหลั่งออกมาจากไฟโบรบลาสต์หรือเนื้องอกไปยังเซลล์ T ที่อยู่ใกล้เคียงใน TME
แม้ว่าผู้สมัครจะรวมถึงตระกูลตัวขนส่งแคตไอออนอินทรีย์ 1 ถึง 3 (OCT1, OCT2 และ OCT3) ที่เข้ารหัสโดยตระกูลตัวขนส่งที่ละลายได้ 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 และ SLC22A3) แต่ตัวขนส่งที่มีศักยภาพของ MNA ยังไม่ได้รับการกำหนด (28) การตรวจ QPCR ของ mRNA จากเซลล์ T ของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีแสดงให้เห็นระดับการแสดงออกของ SLC22A1 ที่ต่ำ แต่ตรวจไม่พบระดับของ SLC22A2 ซึ่งยืนยันว่าเคยมีการรายงานไว้ในวรรณกรรมมาก่อนแล้ว (รูปที่ 3F) (29) ในทางตรงกันข้าม เซลล์มะเร็งรังไข่ SK-OV-3 แสดงระดับสูงของตัวขนส่งทั้งสองชนิด (รูปที่ 3F)
เพื่อทดสอบความเป็นไปได้ที่เซลล์ T จะสามารถดูดซับ MNA จากภายนอกได้ จึงนำเซลล์ T จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีมาเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 72 ชั่วโมงในสภาวะที่มี MNA ความเข้มข้นต่าง ๆ กัน ในกรณีที่ไม่มี MNA จากภายนอก จะไม่สามารถตรวจพบปริมาณ MNA ในเซลล์ได้ (รูปที่ 3G) อย่างไรก็ตาม เซลล์ T ที่ถูกกระตุ้นและได้รับการรักษาด้วย MNA จากภายนอก แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นของปริมาณ MNA ในเซลล์แบบขึ้นอยู่กับปริมาณ MNA ที่เพิ่มขึ้น จนถึง 6 mM MNA (รูปที่ 3G) ผลลัพธ์นี้บ่งชี้ว่า แม้จะมีการแสดงออกของตัวขนส่งในระดับต่ำและขาดเอนไซม์หลักที่รับผิดชอบต่อการเผาผลาญ MNA ภายในเซลล์ แต่ TIL ก็ยังสามารถดูดซับ MNA ได้
สเปกตรัมของสารเมตาบอไลต์ในเซลล์ T ของผู้ป่วยและการทดลองการดูดซึม MNA ในหลอดทดลองเพิ่มความเป็นไปได้ที่ไฟโบรบลาสต์ที่เกี่ยวข้องกับมะเร็ง (CAF) จะหลั่ง MNA และเซลล์เนื้องอกอาจควบคุมฟีโนไทป์และหน้าที่ของ TIL เพื่อตรวจสอบผลของ MNA ต่อเซลล์ T เซลล์ T จากผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีถูกกระตุ้นในหลอดทดลองโดยมีหรือไม่มี MNA และประเมินการเพิ่มจำนวนและการผลิตไซโตไคน์ หลังจากเติม MNA ในปริมาณสูงสุดเป็นเวลา 7 วัน จำนวนการเพิ่มจำนวนของประชากรลดลงเล็กน้อย ในขณะที่ความแข็งแรงยังคงอยู่ที่ทุกปริมาณ (รูปที่ 4A) นอกจากนี้ การรักษาด้วย MNA จากภายนอกส่งผลให้สัดส่วนของเซลล์ T CD4+ และ CD8+ ที่แสดงออกถึงปัจจัยเนื้องอกเนโครซิสอัลฟา (TNFα) เพิ่มขึ้น (รูปที่ 4B) ในทางตรงกันข้าม การผลิต IFN-γ ภายในเซลล์ลดลงอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ T ชนิด CD4+ แต่ไม่ลดลงในเซลล์ T ชนิด CD8+ และไม่มีการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในอินเตอร์ลิวคิน 2 (IL-2; รูปที่ 4, C และ D) ดังนั้น การตรวจวิเคราะห์ด้วยวิธี ELISA ของสารละลายส่วนบนจากเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA เหล่านี้ แสดงให้เห็นว่า TNFα เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ IFN-γ ลดลง และไม่มีการเปลี่ยนแปลงใน IL-2 (รูปที่ 4, E ถึง G) การลดลงของ IFN-γ บ่งชี้ว่า MNA อาจมีบทบาทในการยับยั้งฤทธิ์ต้านมะเร็งของเซลล์ T เพื่อจำลองผลของ MNA ต่อการทำลายเซลล์เป้าหมายโดยเซลล์ T เซลล์ T ที่มีตัวรับแอนติเจนแบบไคเมอริก (FRα-CAR-T) ที่กำหนดเป้าหมายไปที่ตัวรับโฟเลต α และเซลล์ CAR-T (GFP) ที่ควบคุมโดยโปรตีนเรืองแสงสีเขียว (GFP) -CAR-T ถูกผลิตขึ้นจากเซลล์เม็ดเลือดขาวส่วนปลาย (PBMC) ของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี เซลล์ CAR-T ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในที่ที่มี MNA จากนั้นจึงนำไปเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์มะเร็งรังไข่ SK-OV-3 ของมนุษย์ที่แสดงตัวรับโฟเลต α ในอัตราส่วนตัวทำลายต่อเป้าหมาย 10:1 การรักษาด้วย MNA ส่งผลให้กิจกรรมการทำลายของเซลล์ FRα-CAR-T ลดลงอย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งคล้ายกับเซลล์ FRα-CAR-T ที่ได้รับการรักษาด้วยอะดีโนซีน (รูปที่ 4H)
(A) จำนวนเซลล์ที่มีชีวิตทั้งหมดและการเพิ่มจำนวนประชากร (PD) โดยตรงจากการเพาะเลี้ยงในวันที่ 7 กราฟแท่งแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM) ของผู้บริจาคสุขภาพดี 6 ราย แสดงข้อมูลจากการทดลองอิสระอย่างน้อย n = 3 ครั้ง (B ถึง D) ใช้ CD3/CD28 และ IL-2 ในการกระตุ้นเซลล์ T ที่ความเข้มข้นของ MNA ที่เหมาะสมเป็นเวลา 7 วัน ก่อนการวิเคราะห์ เซลล์ได้รับการกระตุ้นด้วย PMA/ionomycin ร่วมกับ GolgiStop เป็นเวลา 4 ชั่วโมง การแสดงออกของ TNFα (B) ในเซลล์ T ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และข้อมูลตาราง (ขวา) ของการแสดงออกของ TNFα ในเซลล์ที่มีชีวิต การแสดงออกของ IFN-γ (C) และ IL-2 (D) ในเซลล์ T การแสดงออกของไซโตไคน์วัดโดยใช้โฟลว์ไซโตเมทรี กราฟแท่งแสดงค่าเฉลี่ย (n = 6 ผู้บริจาคสุขภาพดี) ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SEM) ใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและการวัดซ้ำ (*P<0.05 และ **P<0.01) เพื่อกำหนดค่า P แสดงข้อมูลจากการทดลองอิสระอย่างน้อย n = 3 ครั้ง (E ถึง G) ใช้ CD3/CD28 และ IL-2 ในการกระตุ้นเซลล์ T ที่ความเข้มข้นของ MNA ตามลำดับเป็นเวลา 7 วัน เก็บตัวอย่างสารละลายก่อนและหลังการกระตุ้นด้วย PMA/ionomycin เป็นเวลา 4 ชั่วโมง วัดความเข้มข้นของ TNFα (E), IFN-γ (F) และ IL-2 (G) โดยวิธี ELISA กราฟแท่งแสดงค่าเฉลี่ย (n = 5 ผู้บริจาคสุขภาพดี) ± SEM ค่า P ถูกกำหนดโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียวและการวัดซ้ำ (*P<0.05) เส้นประแสดงขีดจำกัดการตรวจจับ (H) การทดสอบการสลายเซลล์ เซลล์ FRα-CAR-T หรือ GFP-CAR-T ถูกปรับด้วยอะดีโนซีน (250 μM) หรือ MNA (10 mM) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง หรือปล่อยไว้โดยไม่ได้รับการรักษา (Ctrl) วัดเปอร์เซ็นต์การฆ่าเซลล์ SK-OV-3 ค่า P ถูกกำหนดโดยการทดสอบ t ของ Welch (*P<0.5 และ **P<0.01)
เพื่อให้เข้าใจกลไกการควบคุมการแสดงออกของ TNFα ที่ขึ้นอยู่กับ MNA การเปลี่ยนแปลงของ mRNA ของ TNFα ในเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA จึงได้รับการประเมิน (รูปที่ 5A) เซลล์ T ของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดีที่ได้รับการรักษาด้วย MNA แสดงให้เห็นระดับการถอดรหัสของ TNFα เพิ่มขึ้นสองเท่า ซึ่งบ่งชี้ว่า MNA ขึ้นอยู่กับการควบคุมการถอดรหัสของ TNFα เพื่อตรวจสอบกลไกการควบคุมที่เป็นไปได้นี้ ปัจจัยการถอดรหัสที่ทราบกันดีสองตัวที่ควบคุม TNFα ได้แก่ activated T cell nuclear factor (NFAT) และ specific protein 1 (Sp1) ได้รับการประเมินในการตอบสนองต่อการจับของ MNA กับโปรโมเตอร์ TNFα ที่อยู่ใกล้เคียง (30) โปรโมเตอร์ TNFα มีไซต์การจับของ NFAT ที่ระบุ 6 ไซต์และไซต์การจับของ Sp1 2 ไซต์ ซึ่งทับซ้อนกันที่ไซต์หนึ่ง [-55 คู่เบส (bp) จาก 5'cap] (30) การตกตะกอนภูมิคุ้มกันของโครมาติน (ChIP) แสดงให้เห็นว่าเมื่อได้รับการรักษาด้วย MNA การจับของ Sp1 กับโปรโมเตอร์ TNFα เพิ่มขึ้นสามเท่า การรวมตัวของ NFAT ก็เพิ่มขึ้นและเข้าใกล้ระดับความสำคัญ (รูปที่ 5B) ข้อมูลเหล่านี้บ่งชี้ว่า MNA ควบคุมการแสดงออกของ TNFα ผ่านการถอดรหัส Sp1 และในระดับที่น้อยกว่าคือการแสดงออกของ NFAT
(A) เมื่อเปรียบเทียบกับเซลล์ T ที่เพาะเลี้ยงโดยปราศจาก MNA การเปลี่ยนแปลงของการแสดงออกของ TNFα ในเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA แสดงรูปแบบการแสดงออกพร้อมค่า SEM (n = 5 ผู้บริจาคสุขภาพดี) แสดงข้อมูลจากการทดลองอิสระอย่างน้อย n = 3 ครั้ง (B) โปรโมเตอร์ TNFα ของเซลล์ T ที่ได้รับการรักษาด้วยหรือไม่มี MNA 8 mM หลังจากรวม NFAT และ Sp1 เข้ากับ (Ctrl) และกระตุ้นด้วย PMA/ionomycin เป็นเวลา 4 ชั่วโมง อิมมูโนโกลบูลิน G (IgG) และ H3 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบและเชิงบวกสำหรับการตกตะกอนภูมิคุ้มกันตามลำดับ การหาปริมาณ ChIP แสดงให้เห็นว่าการจับกันของ Sp1 และ NFAT กับโปรโมเตอร์ TNFα ในเซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย MNA เพิ่มขึ้นหลายเท่าเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม แสดงข้อมูลจากการทดลองอิสระอย่างน้อย n = 3 ครั้ง ค่า P กำหนดโดยการทดสอบ t หลายครั้ง (*** P <0.01) (C) เมื่อเปรียบเทียบกับน้ำในช่องท้องของ HGSC เซลล์ T (ที่ไม่เป็นพิษต่อเซลล์) แสดงการแสดงออกของ TNF ที่เพิ่มขึ้นในเนื้องอก สีต่างๆ แทนผู้ป่วยที่แตกต่างกัน เซลล์ที่แสดงได้ถูกสุ่มตัวอย่างมา 300 เซลล์และปรับตำแหน่งเล็กน้อยเพื่อจำกัดการวาดทับซ้อน (** Padj = 0.0076) (D) แบบจำลอง MNA ที่เสนอสำหรับมะเร็งรังไข่ MNA ถูกผลิตขึ้นในเซลล์เนื้องอกและไฟโบรบลาสต์ใน TME และถูกดูดซึมโดยเซลล์ T MNA เพิ่มการจับกันของ Sp1 กับโปรโมเตอร์ TNFα ส่งผลให้การถอดรหัส TNFα และการผลิตไซโตไคน์ TNFα เพิ่มขึ้น MNA ยังทำให้ IFN-γ ลดลง การยับยั้งการทำงานของเซลล์ T นำไปสู่ความสามารถในการฆ่าที่ลดลงและการเติบโตของเนื้องอกที่เร็วขึ้น
จากรายงานพบว่า TNFα มีฤทธิ์ต้านมะเร็งทั้งด้านหน้าและด้านหลัง แต่มีบทบาทที่รู้จักกันดีในการส่งเสริมการเจริญเติบโตและการแพร่กระจายของมะเร็งรังไข่ (31-33) จากรายงานพบว่าความเข้มข้นของ TNFα ในน้ำในช่องท้องและเนื้อเยื่อเนื้องอกในผู้ป่วยมะเร็งรังไข่สูงกว่าในเนื้อเยื่อปกติ (34-36) ในแง่ของกลไก TNFα สามารถควบคุมการกระตุ้น การทำงาน และการเพิ่มจำนวนของเซลล์เม็ดเลือดขาว และเปลี่ยนแปลงฟีโนไทป์ของเซลล์มะเร็ง (37, 38) สอดคล้องกับผลการวิจัยเหล่านี้ การวิเคราะห์การแสดงออกของยีนที่แตกต่างกันแสดงให้เห็นว่า TNF มีการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเซลล์ T ในเนื้อเยื่อเนื้องอกเมื่อเทียบกับน้ำในช่องท้อง (รูปที่ 5C) การเพิ่มขึ้นของการแสดงออกของ TNF ปรากฏให้เห็นเฉพาะในประชากรเซลล์ T ที่มีฟีโนไทป์ที่ไม่เป็นพิษต่อเซลล์ (รูปที่ S5A) โดยสรุป ข้อมูลเหล่านี้สนับสนุนมุมมองที่ว่า MNA มีผลกดภูมิคุ้มกันและส่งเสริมการเจริญเติบโตของเนื้องอกใน HGSC
การติดฉลากด้วยฟลูออเรสเซนต์โดยอาศัยโฟลว์ไซโตเมทรีได้กลายเป็นวิธีการหลักในการศึกษาการเผาผลาญของ TIL การศึกษาเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเมื่อเปรียบเทียบกับลิมโฟไซต์ในเลือดส่วนปลายหรือเซลล์ T จากอวัยวะน้ำเหลืองทุติยภูมิ TIL ของหนูและมนุษย์มีแนวโน้มที่จะดูดซึมกลูโคสได้สูงกว่า (4, 39) และมีการสูญเสียการทำงานของไมโทคอนเดรียอย่างค่อยเป็นค่อยไป (19, 40) แม้ว่าเราจะสังเกตเห็นผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกันในการศึกษานี้ แต่การพัฒนาที่สำคัญคือการเปรียบเทียบการเผาผลาญของเซลล์มะเร็งและ TIL จากเนื้อเยื่อเนื้องอกที่ถูกตัดออกเดียวกัน สอดคล้องกับรายงานก่อนหน้านี้บางส่วน เซลล์มะเร็ง (CD45-EpCAM +) จากน้ำในช่องท้องและเนื้องอกมีการดูดซึมกลูโคสสูงกว่าเซลล์ T CD8 + และ CD4 + ซึ่งสนับสนุนว่าการดูดซึมกลูโคสสูงของเซลล์มะเร็งสามารถเปรียบเทียบกับเซลล์ T ได้ แนวคิดของการแข่งขันของเซลล์ T ใน TME อย่างไรก็ตาม กิจกรรมของไมโทคอนเดรียของเซลล์มะเร็งสูงกว่าเซลล์ T CD8 + แต่กิจกรรมของไมโทคอนเดรียคล้ายคลึงกับเซลล์ T CD4 + ผลลัพธ์เหล่านี้ตอกย้ำแนวคิดที่กำลังเกิดขึ้นว่าการเผาผลาญออกซิเดชันมีความสำคัญต่อเซลล์มะเร็ง (41, 42) นอกจากนี้ยังชี้ให้เห็นว่าเซลล์ CD8+ T อาจมีความไวต่อการทำงานผิดปกติจากออกซิเดชันมากกว่าเซลล์ CD4+ T หรือเซลล์ CD4+ T อาจใช้แหล่งคาร์บอนอื่นที่ไม่ใช่กลูโคสเพื่อรักษาการทำงานของไมโทคอนเดรีย (43, 44) ควรสังเกตว่าเราไม่พบความแตกต่างในการดูดซึมกลูโคสหรือการทำงานของไมโทคอนเดรียระหว่างเซลล์ CD4+ T effector, เซลล์ T effector memory และเซลล์ T central memory ในของเหลวในช่องท้อง ในทำนองเดียวกัน สถานะการแยกแยะของเซลล์ CD8+ T ในเนื้องอกไม่มีส่วนเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงในการดูดซึมกลูโคส ซึ่งเน้นให้เห็นถึงความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างเซลล์ T ที่เพาะเลี้ยงในหลอดทดลองและ TIL ของมนุษย์ในร่างกาย (22) การสังเกตเหล่านี้ได้รับการยืนยันโดยการใช้การจัดสรรประชากรเซลล์อัตโนมัติที่ไม่ลำเอียง ซึ่งเผยให้เห็นเพิ่มเติมว่าเซลล์ CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ที่มีการดูดซึมกลูโคสและกิจกรรมไมโทคอนเดรียสูงกว่าเซลล์เนื้องอกนั้นแพร่หลาย แต่มีประชากรเซลล์ที่มีการเผาผลาญพลังงานสูง ประชากรนี้อาจเป็นตัวแทนของประชากรย่อยของเซลล์กดภูมิคุ้มกันไมอีลอยด์หรือเซลล์เดนดริติกพลาสมอยด์ที่ระบุในการวิเคราะห์ scRNA-seq แม้ว่าทั้งสองอย่างนี้จะได้รับการรายงานในเนื้องอกรังไข่ของมนุษย์ [45] แต่ก็ยังต้องการการศึกษาเพิ่มเติมเพื่ออธิบายประชากรย่อยไมอีลอยด์นี้
แม้ว่าวิธีการที่ใช้โฟลว์ไซโตเมทรีจะสามารถชี้แจงความแตกต่างทั่วไปในการเผาผลาญกลูโคสและออกซิเดชันระหว่างเซลล์ประเภทต่างๆ ได้ แต่เมตาโบไลต์ที่ผลิตโดยกลูโคสหรือแหล่งคาร์บอนอื่นๆ สำหรับการเผาผลาญไมโทคอนเดรียใน TME ยังไม่ได้รับการระบุอย่างแม่นยำ การกำหนดว่ามีหรือไม่มีเมตาโบไลต์ในกลุ่มย่อย TIL ที่กำหนดนั้นจำเป็นต้องมีการทำให้บริสุทธิ์ของประชากรเซลล์จากเนื้อเยื่อที่ตัดออก ดังนั้น วิธีการเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ของเราที่รวมกับแมสสเปกโทรเมตรีสามารถให้ข้อมูลเชิงลึกเกี่ยวกับเมตาโบไลต์ที่เพิ่มความเข้มข้นแตกต่างกันในเซลล์ T และประชากรเซลล์เนื้องอกในตัวอย่างผู้ป่วยที่ตรงกัน แม้ว่าวิธีนี้จะมีข้อดีเหนือกว่าการคัดแยกเซลล์ที่กระตุ้นด้วยฟลูออเรสเซนซ์ แต่ไลบรารีเมตาโบไลต์บางส่วนอาจได้รับผลกระทบเนื่องจากความเสถียรโดยธรรมชาติและ/หรืออัตราการหมุนเวียนที่รวดเร็ว (22) อย่างไรก็ตาม วิธีของเราสามารถระบุเมตาโบไลต์ที่กดภูมิคุ้มกันที่ได้รับการยอมรับสองชนิด ได้แก่ อะดีโนซีนและคีนูเรนีน เนื่องจากมีความแตกต่างกันอย่างมากระหว่างตัวอย่างประเภทต่างๆ
การวิเคราะห์เมตาโบโนมิกส์ของเนื้องอกและชนิดย่อยของ TIL ให้ข้อมูลเชิงลึกเพิ่มเติมเกี่ยวกับบทบาทของเมตาโบไลต์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคของรังไข่ ประการแรก การใช้โฟลว์ไซโตเมทรี เราพบว่าไม่มีความแตกต่างในกิจกรรมของไมโทคอนเดรียระหว่างเนื้องอกและเซลล์ T CD4+ อย่างไรก็ตาม การวิเคราะห์ LC-MS/MS เผยให้เห็นการเปลี่ยนแปลงอย่างมีนัยสำคัญในปริมาณของเมตาโบไลต์ในกลุ่มประชากรเหล่านี้ ซึ่งบ่งชี้ว่าข้อสรุปเกี่ยวกับการเผาผลาญของ TIL และกิจกรรมการเผาผลาญโดยรวมนั้นต้องได้รับการตีความอย่างระมัดระวัง ประการที่สอง MNA เป็นเมตาโบไลต์ที่มีความแตกต่างมากที่สุดระหว่างเซลล์ CD45 และเซลล์ T ในน้ำในช่องท้อง ไม่ใช่ในเนื้องอก ดังนั้น การแบ่งส่วนและตำแหน่งของเนื้องอกอาจมีผลกระทบที่แตกต่างกันต่อการเผาผลาญของ TIL ซึ่งเน้นให้เห็นถึงความไม่สม่ำเสมอที่อาจเกิดขึ้นในสภาพแวดล้อมจุลภาคที่กำหนด ประการที่สาม การแสดงออกของเอนไซม์ NNMT ที่ผลิต MNA นั้นจำกัดอยู่เฉพาะใน CAF เป็นหลัก ซึ่งเป็นเซลล์เนื้องอกในระดับที่น้อยกว่า แต่ตรวจพบระดับ MNA ได้ในเซลล์ T ที่ได้จากเนื้องอก การแสดงออกของ NNMT ที่มากเกินไปใน CAF รังไข่เป็นที่ทราบกันดีว่ามีผลส่งเสริมการเกิดมะเร็ง ส่วนหนึ่งเนื่องมาจากการส่งเสริมการเผาผลาญของ CAF การบุกรุกของเนื้องอก และการแพร่กระจาย (27) แม้ว่าระดับโดยรวมของ TIL จะอยู่ในระดับปานกลาง แต่การแสดงออกของ NNMT ใน CAF มีความสัมพันธ์อย่างใกล้ชิดกับชนิดย่อยเมเซนไคมอลของ Cancer Genome Atlas (TCGA) ซึ่งเกี่ยวข้องกับพยากรณ์โรคที่ไม่ดี (27, 46, 47) สุดท้าย การแสดงออกของเอนไซม์ AOX1 ที่รับผิดชอบในการย่อยสลาย MNA ก็จำกัดอยู่เฉพาะในประชากร CAF ซึ่งบ่งชี้ว่าเซลล์ T ขาดความสามารถในการเผาผลาญ MNA ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนแนวคิดที่ว่า แม้ว่าจะต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบการค้นพบนี้ แต่ระดับ MNA ที่สูงในเซลล์ T อาจบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของสภาพแวดล้อมจุลภาค CAF ที่กดภูมิคุ้มกัน
เนื่องจากระดับการแสดงออกของตัวขนส่ง MNA ต่ำ และระดับของโปรตีนสำคัญที่เกี่ยวข้องกับการเผาผลาญ MNA ตรวจไม่พบ การมีอยู่ของ MNA ในเซลล์ T จึงเป็นเรื่องที่ไม่คาดคิด ทั้ง NNMT และ AOX1 ตรวจไม่พบโดยการวิเคราะห์ scRNA-seq และ targeted qPCR ในกลุ่มตัวอย่างอิสระสองกลุ่ม ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่า MNA ไม่ได้ถูกสังเคราะห์โดยเซลล์ T แต่ถูกดูดซึมมาจาก TME ที่อยู่รอบๆ การทดลองในหลอดทดลองแสดงให้เห็นว่าเซลล์ T มีแนวโน้มที่จะสะสม MNA จากภายนอก
การศึกษาในหลอดทดลองของเราแสดงให้เห็นว่า MNA จากภายนอกกระตุ้นการแสดงออกของ TNFα ในเซลล์ T และเพิ่มการจับกันของ Sp1 กับโปรโมเตอร์ของ TNFα แม้ว่า TNFα จะมีทั้งฤทธิ์ต้านมะเร็งและฤทธิ์ยับยั้งมะเร็ง แต่ในมะเร็งรังไข่ TNFα สามารถส่งเสริมการเจริญเติบโตของมะเร็งรังไข่ได้ (31-33) การทำให้ TNFα เป็นกลางในวัฒนธรรมเซลล์มะเร็งรังไข่หรือการกำจัดสัญญาณ TNFα ในแบบจำลองหนูสามารถปรับปรุงการผลิตไซโตไคน์อักเสบที่เกิดจาก TNFα และยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้องอกได้ (32, 35) ดังนั้น ในกรณีนี้ MNA ที่ได้จาก TME สามารถทำหน้าที่เป็นเมตาโบไลต์ที่ก่อให้เกิดการอักเสบผ่านกลไกที่ขึ้นอยู่กับ TNFα ผ่านวงจรออโตครีน ซึ่งจะส่งเสริมการเกิดและการแพร่กระจายของมะเร็งรังไข่ (31) จากความเป็นไปได้นี้ การปิดกั้น TNFα จึงกำลังได้รับการศึกษาในฐานะตัวแทนการรักษาที่มีศักยภาพสำหรับมะเร็งรังไข่ (37, 48, 49) นอกจากนี้ MNA ยังลดความสามารถในการทำลายเซลล์มะเร็งรังไข่ของเซลล์ CAR-T ซึ่งเป็นหลักฐานเพิ่มเติมเกี่ยวกับการกดภูมิคุ้มกันโดย MNA โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นถึงแบบจำลองที่เนื้องอกและเซลล์ CAF หลั่ง MNA เข้าสู่ TME ภายนอกเซลล์ ผ่าน (i) การกระตุ้นการเจริญเติบโตของมะเร็งรังไข่โดย TNF และ (ii) การยับยั้งกิจกรรมการทำลายเซลล์ของ T โดย MNA ซึ่งอาจมีผลต่อเนื้องอกสองทาง (รูปที่ 5D)
โดยสรุปแล้ว การศึกษาครั้งนี้ได้ใช้การผสมผสานระหว่างการเพิ่มจำนวนเซลล์อย่างรวดเร็ว การลำดับดีเอ็นเอระดับเซลล์เดี่ยว และการวิเคราะห์เมตาโบลิซึม เพื่อเปิดเผยความแตกต่างอย่างมากของอิมมูโนเมตาโบลิซึมระหว่างเซลล์เนื้องอกและเซลล์น้ำในช่องท้องของผู้ป่วย HGSC การวิเคราะห์อย่างครอบคลุมนี้แสดงให้เห็นว่ามีความแตกต่างในการดูดซึมกลูโคสและกิจกรรมของไมโทคอนเดรียระหว่างเซลล์ T และระบุว่า MNA เป็นเมตาโบไลต์ควบคุมภูมิคุ้มกันที่ไม่ขึ้นกับเซลล์ ข้อมูลเหล่านี้มีผลกระทบต่อวิธีที่ TME ส่งผลต่อเมตาโบลิซึมของเซลล์ T ในมะเร็งของมนุษย์ แม้ว่าจะมีการรายงานการแข่งขันโดยตรงเพื่อแย่งชิงสารอาหารระหว่างเซลล์ T และเซลล์มะเร็งแล้ว แต่เมตาโบไลต์ยังสามารถทำหน้าที่เป็นตัวควบคุมทางอ้อมเพื่อส่งเสริมการลุกลามของเนื้องอกและอาจยับยั้งการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันภายในร่างกายได้ การอธิบายบทบาทหน้าที่ของเมตาโบไลต์ควบคุมเหล่านี้เพิ่มเติมอาจเปิดโอกาสให้เกิดกลยุทธ์ทางเลือกใหม่ในการเสริมสร้างการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันต่อต้านเนื้องอก
ตัวอย่างเนื้อเยื่อผู้ป่วยและข้อมูลทางคลินิกได้มาจากคลังเก็บเนื้อเยื่อมะเร็ง BC ที่ได้รับการรับรองโดยเครือข่ายคลังเก็บเนื้อเยื่อของแคนาดา ตามระเบียบที่ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมการวิจัยมะเร็ง BC และมหาวิทยาลัยบริติชโคลัมเบีย (H07-00463) ตัวอย่างเนื้อเยื่อและข้อมูลทางคลินิกของผู้ป่วยทั้งหมดได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรหรือสละสิทธิ์ในการให้ความยินยอมอย่างเป็นทางการ ตัวอย่างถูกจัดเก็บไว้ใน BioBank ที่ได้รับการรับรอง (BRC-00290) ลักษณะเฉพาะของผู้ป่วยโดยละเอียดแสดงอยู่ในตาราง S1 และ S5 สำหรับการแช่แข็ง ตัวอย่างเนื้องอกของผู้ป่วยจะถูกแยกส่วนด้วยกลไก จากนั้นจึงกรองผ่านตัวกรองขนาด 100 ไมครอนเพื่อให้ได้สารละลายเซลล์เดี่ยว น้ำในช่องท้องของผู้ป่วยถูกปั่นเหวี่ยงที่ 1500 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C เพื่อแยกเซลล์และกำจัดส่วนที่เป็นของเหลว เซลล์ที่ได้จากเนื้องอกและน้ำในช่องท้องถูกแช่แข็งในสารละลายซีรั่ม AB ของมนุษย์ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 50% (Sigma-Aldrich), RPMI-1640 40% (Thermo Fisher Scientific) และไดเมทิลซัลฟอกไซด์ 10% เซลล์แขวนลอยที่แช่แข็งไว้เหล่านี้ถูกละลายและนำไปใช้สำหรับการวิเคราะห์เมตาโบลิซึมและการตรวจวัดเมตาโบไลต์ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง
อาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์ประกอบด้วย RPMI 1640: AimV ที่กรองด้วยตัวกรองขนาด 0.22 μm ในอัตราส่วน 50:50 โดยมีส่วนประกอบดังนี้: RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) เสริมด้วยซีรั่ม AB ของมนุษย์ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 10% (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific), สารละลายเพนิซิลลินสเตรปโตมัยซิน (PenStrep) 1 เท่า (Thermo Fisher Scientific) และ 50 μM-mercaptoethanol ส่วน AimV (Invitrogen) เสริมด้วย 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) และ 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) บัฟเฟอร์สำหรับย้อมสีด้วยเครื่องตรวจวัดการไหลของเซลล์ประกอบด้วยสารละลายฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (PBS; Invitrogen) ที่กรองด้วยตัวกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร เสริมด้วยซีรั่มมนุษย์ AB ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 3% (Sigma) ส่วนบัฟเฟอร์สำหรับเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ประกอบด้วย PBS ที่กรองด้วยตัวกรองขนาด 0.22 ไมโครเมตร และเสริมด้วยซีรั่มมนุษย์ AB ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 0.5% (Sigma-Aldrich)
ในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์ที่อุณหภูมิ 37°C เซลล์ถูกย้อมด้วย MT DR ความเข้มข้น 10 nM และ 2-NBDG ความเข้มข้น 100 μM เป็นเวลา 30 นาที จากนั้น เซลล์ถูกย้อมด้วยสีย้อมตรวจสอบความมีชีวิต eF506 ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 15 นาที นำเซลล์มาแขวนลอยใน FC Block (eBioscience) และ Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) เจือจางในบัฟเฟอร์สำหรับย้อมด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ย้อมเซลล์ด้วยชุดแอนติบอดี (ตาราง S2) ในบัฟเฟอร์สำหรับย้อมด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 20 นาที นำเซลล์มาแขวนลอยในบัฟเฟอร์สำหรับย้อมด้วยเครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (Cytek Aurora; การกำหนดค่า 3L-16V-14B-8R) ก่อนทำการวิเคราะห์ ใช้ SpectroFlo และ FlowJo V10 ในการวิเคราะห์ข้อมูลจำนวนเซลล์ และใช้ GraphPad Prism 8 ในการสร้างข้อมูล ค่าความเข้มแสงฟลูออเรสเซนต์มัธยฐาน (MFI) ของ 2-NBDG และ MT DR ถูกปรับให้เป็นค่าลอการิทึมปกติ จากนั้นจึงใช้การทดสอบ t แบบจับคู่สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติเพื่อพิจารณาผู้ป่วยที่จับคู่กัน ลบกลุ่มประชากรที่มีจำนวนเหตุการณ์น้อยกว่า 40 ออกจากการวิเคราะห์ และใส่ค่า MFI เป็น 1 สำหรับค่าลบใดๆ ก่อนทำการวิเคราะห์ทางสถิติและการแสดงข้อมูล
เพื่อเสริมกลยุทธ์การคัดกรองด้วยตนเองของแผงกระบวนการข้างต้น เราใช้คำอธิบายประกอบแบบเต็มรูปแบบโดยต้นไม้จำกัดรูปร่าง (FAUST) (21) เพื่อกำหนดเซลล์ให้กับประชากรโดยอัตโนมัติหลังจากกำจัดเซลล์ที่ตายแล้วใน FlowJo เราจัดการเอาต์พุตด้วยตนเองเพื่อรวมประชากรที่ดูเหมือนจะจัดสรรผิดพลาด (รวมเซลล์เนื้องอก PD1+ กับ PD1-) และประชากรที่คงไว้ แต่ละตัวอย่างมีเซลล์โดยเฉลี่ยมากกว่า 2% รวมเป็น 11 ประชากร
การแยกเซลล์เม็ดเลือดขาวชนิด PBMC ออกจากผลิตภัณฑ์การแยกเม็ดเลือดขาวโดยใช้การแยกด้วยความหนาแน่นแบบ Ficoll (STEMCELL Technologies) ถูกนำมาใช้ เซลล์ CD8+ T ถูกแยกออกจาก PBMC โดยใช้ CD8 MicroBeads (Miltenyi) และขยายจำนวนในอาหารเลี้ยงเซลล์ครบถ้วนโดยใช้ TransAct (Miltenyi) เป็นเวลา 2 สัปดาห์ตามคำแนะนำของผู้ผลิต เซลล์ถูกทิ้งไว้เป็นเวลา 5 วันในอาหารเลี้ยงเซลล์ครบถ้วนที่มี IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) จากนั้นจึงกระตุ้นซ้ำด้วย TransAct ในวันที่ 7 ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ใช้ human CD45 MicroBeads (Miltenyi) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ในสามรอบติดต่อกัน เซลล์ถูกแบ่งส่วนสำหรับการวิเคราะห์ด้วย flow cytometry (ดังที่อธิบายไว้ข้างต้น) และเซลล์หนึ่งล้านเซลล์ถูกแบ่งออกเป็นสามส่วนสำหรับการวิเคราะห์ด้วย LC-MS/MS ตัวอย่างถูกประมวลผลด้วย LC-MS/MS ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง เราประมาณค่าเมตาโบไลต์ที่หายไปโดยใช้หมายเลขไอออน 1,000 ตัวอย่างแต่ละตัวอย่างจะถูกปรับค่าให้เป็นมาตรฐานโดยใช้จำนวนไอออนทั้งหมด (TIC) แปลงเป็นค่าลอการิทึม และปรับค่าให้เป็นมาตรฐานโดยอัตโนมัติใน MetaboAnalystR ก่อนทำการวิเคราะห์
นำเซลล์แขวนลอยเดี่ยวของแต่ละผู้ป่วยมาละลายและกรองผ่านตัวกรองขนาด 40 μm ลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ที่สมบูรณ์ (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต จะทำการคัดเลือกเชิงบวกติดต่อกันสามรอบโดยใช้การแยกด้วยลูกปัดแม่เหล็กโดยใช้ MicroBeads (Miltenyi) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ CD8+, CD4+ และ CD45- ในตัวอย่าง (บนน้ำแข็ง) โดยสรุปคือ เซลล์จะถูกแขวนลอยในบัฟเฟอร์เพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) และนับจำนวน เซลล์จะถูกบ่มกับลูกปัด CD8 ของมนุษย์ ลูกปัด CD4 ของมนุษย์ หรือลูกปัด CD45 ของมนุษย์ (Miltenyi) ที่อุณหภูมิ 4°C เป็นเวลา 15 นาที แล้วล้างด้วยบัฟเฟอร์เพิ่มความเข้มข้นของเซลล์ ตัวอย่างจะถูกส่งผ่านคอลัมน์ LS (Miltenyi) และเก็บส่วนที่เป็นบวกและลบ เพื่อลดระยะเวลาและเพิ่มประสิทธิภาพการกู้คืนเซลล์ให้สูงสุด ส่วน CD8 จะถูกนำไปใช้สำหรับการเพิ่มความเข้มข้นของ CD4+ รอบที่สอง และส่วน CD4 จะถูกนำไปใช้สำหรับการเพิ่มความเข้มข้นของ CD45 ในขั้นตอนต่อไป ควรเก็บสารละลายไว้ในน้ำแข็งตลอดกระบวนการแยกสาร
เพื่อเตรียมตัวอย่างสำหรับการวิเคราะห์เมตาโบไลต์ เซลล์จะถูกล้างหนึ่งครั้งด้วยสารละลายเกลือเย็นจัด จากนั้นเติมเมทานอล 80% ปริมาณ 1 มิลลิลิตรลงในแต่ละตัวอย่าง แล้วเขย่าให้เข้ากันและแช่แข็งอย่างรวดเร็วในไนโตรเจนเหลว ตัวอย่างจะถูกนำไปผ่านกระบวนการแช่แข็งและละลายซ้ำ 3 รอบ และปั่นเหวี่ยงที่ 14,000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 15 นาที ที่อุณหภูมิ 4°C สารละลายส่วนบนที่มีเมตาโบไลต์จะถูกระเหยจนแห้ง เมตาโบไลต์จะถูกละลายใหม่ในกรดฟอร์มิก 0.03% ปริมาณ 50 ไมโครลิตร เขย่าให้เข้ากัน แล้วปั่นเหวี่ยงเพื่อกำจัดเศษตะกอน
สกัดเมตาโบไลต์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ถ่ายเทสารละลายส่วนบนลงในขวดโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงสำหรับการวิจัยเมตาโบโลมิกส์ ใช้โปรโตคอลการรักษาแบบสุ่มเพื่อบำบัดแต่ละตัวอย่างด้วยจำนวนเซลล์ที่ใกล้เคียงกันเพื่อป้องกันผลกระทบจากชุดการทดลอง เราได้ทำการประเมินเชิงคุณภาพของเมตาโบไลต์โดยรวมที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้บนเครื่องสเปกโทรเมตรมวลควอดรูโพลสามตัว AB SCIEX QTRAP 5500 (50) การวิเคราะห์โครมาโทกราฟีและการรวมพื้นที่ยอดพีคดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ MultiQuant เวอร์ชัน 2.1 (Applied Biosystems SCIEX)
ใช้การนับไอออน 1000 เพื่อประมาณค่าเมตาโบไลต์ที่หายไป และใช้ TIC ของแต่ละตัวอย่างในการคำนวณพื้นที่ยอดพีคปกติของเมตาโบไลต์ที่ตรวจพบแต่ละตัวเพื่อแก้ไขการเปลี่ยนแปลงที่เกิดจากการวิเคราะห์ด้วยเครื่องมือจากการประมวลผลตัวอย่าง หลังจาก TIC ถูกทำให้เป็นปกติแล้ว จะใช้ MetaboAnalystR(51) (พารามิเตอร์เริ่มต้น) สำหรับการแปลงลอการิทึมและการปรับขนาดเส้นปกติอัตโนมัติ เราใช้ PCA ร่วมกับแพ็กเกจ vegan ใน R เพื่อทำการวิเคราะห์เชิงสำรวจความแตกต่างของเมตาโบโลมระหว่างประเภทตัวอย่าง และใช้การวิเคราะห์ความซ้ำซ้อนบางส่วนเพื่อวิเคราะห์ผู้ป่วย ใช้ Ward method เพื่อสร้างแผนภูมิเดนโดแกรมแผนที่ความร้อนเพื่อจัดกลุ่มระยะทางแบบยูคลิดระหว่างตัวอย่าง เราใช้ limma (52) กับความอุดมสมบูรณ์ของเมตาโบไลต์มาตรฐานเพื่อระบุเมตาโบไลต์ที่มีความอุดมสมบูรณ์แตกต่างกันทั่วทั้งประเภทเซลล์และสภาพแวดล้อมจุลภาค เพื่อให้ง่ายต่อการอธิบาย เราใช้พารามิเตอร์ค่าเฉลี่ยกลุ่มเพื่อระบุแบบจำลอง และพิจารณาประเภทเซลล์ในสภาพแวดล้อมจุลภาคเป็นแต่ละกลุ่ม (n = 6 กลุ่ม) สำหรับการทดสอบนัยสำคัญ เราได้ทำการวัดซ้ำ 3 ครั้งสำหรับเมตาโบไลต์แต่ละชนิด เพื่อหลีกเลี่ยงการทำซ้ำที่ผิดพลาด ผู้ป่วยถูกรวมไว้เป็นอุปสรรคในการออกแบบ limma เพื่อตรวจสอบความแตกต่างของเมตาโบไลต์ระหว่างผู้ป่วยที่แตกต่างกัน เราได้ปรับแบบจำลอง limma โดยรวมผู้ป่วยไว้ในลักษณะคงที่ เราได้รายงานนัยสำคัญของความแตกต่างที่กำหนดไว้ล่วงหน้าระหว่างชนิดของเซลล์และสภาพแวดล้อมจุลภาคของ Padj <0.05 (การแก้ไข Benjamini-Hochberg)
หลังจากเพิ่มจำนวนเซลล์ที่มีชีวิตโดยใช้ชุดกำจัดเซลล์ตาย Miltenyi (>80% เซลล์มีชีวิต) แล้ว จึงทำการลำดับจีโนมของเซลล์เดี่ยวในตัวอย่างน้ำในช่องท้องและตัวอย่างเนื้องอกที่แช่แข็งทั้งหมดโดยใช้โปรโตคอลการแสดงออกของยีน 10x 5′ มีการวิเคราะห์ 5 กรณีที่มีเนื้องอกและน้ำในช่องท้องที่ตรงกัน แม้ว่าเซลล์เนื้องอกหนึ่งตัวอย่างจะมีชีวิตน้อยมากจนไม่สามารถนำมาวิเคราะห์ได้ เพื่อให้ได้ผู้ป่วยหลายราย เราจึงรวมตัวอย่างของผู้ป่วยแต่ละรายไว้ในเลนของตัวควบคุมโครเมียม 10x และวิเคราะห์น้ำในช่องท้องและบริเวณเนื้องอกแยกกัน หลังจากทำการลำดับจีโนมแล้ว [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; โดยเฉลี่ยแล้วมีการอ่าน 73,488 และ 41,378 ครั้งต่อเซลล์สำหรับเนื้องอกและน้ำในช่องท้องตามลำดับ เราใช้ CellSNP และ Vireo (53) (โดยอิงจาก CellSNP เป็น SNP ของมนุษย์ทั่วไป (VCF) ที่จัดหาโดย GRCh38 จะถูกกำหนดรหัสผู้บริจาค เราใช้ SNPRelate เพื่ออนุมานรหัสที่ใกล้ที่สุด (IBS) ของสถานะจีโนไทป์ของผู้ป่วย (IBS) โดยไม่รวมเซลล์ที่ไม่ได้กำหนดและเซลล์ที่ระบุว่าเป็นคู่และผู้บริจาคที่ตรงกันระหว่างตัวอย่างน้ำในช่องท้องและเนื้องอก (54) จากงานนี้ เราเก็บสามกรณีที่มีการแสดงเซลล์จำนวนมากในเนื้องอกและน้ำในช่องท้องสำหรับการวิเคราะห์ขั้นต่อไป หลังจากดำเนินการขั้นตอนการกรองมวลในบรรจุภัณฑ์ BioConductor scater (55) และ scran (56) แล้ว จะได้เซลล์ 6975 เซลล์ (2792 และ 4183 เซลล์จากเนื้องอกและน้ำในช่องท้องตามลำดับ) สำหรับการวิเคราะห์ เราใช้การจัดกลุ่ม Louvain ของ igraph (57) ของเครือข่ายเพื่อนบ้านที่ใกล้ที่สุดร่วมกัน (SNN) อิงตามระยะทาง Jaccard เพื่อจัดกลุ่มเซลล์ตามการแสดงออก กลุ่มต่างๆ ได้รับการระบุด้วยตนเองเป็นประเภทเซลล์ที่คาดการณ์ไว้โดยอิงจากการแสดงออกของยีนเครื่องหมายและแสดงภาพด้วย t-SNE เซลล์ T ที่เป็นพิษต่อเซลล์ถูกกำหนดโดยการแสดงออกของ CD8A และ GZMA โดยไม่รวมกลุ่มย่อยที่มีการแสดงออกของโปรตีนไรโบโซมต่ำ เราเข้าถึงข้อมูลที่เผยแพร่ของ Izar et al. (16) รวมถึงการฝัง t-SNE ของพวกเขา ซึ่งสามารถควบคุมการทับซ้อนของการแสดงออกระหว่างเครื่องหมายเซลล์ภูมิคุ้มกันและการแสดงออกของ NNMT ได้
PBMC ถูกแยกออกจากผลิตภัณฑ์แยกเม็ดเลือดขาว (STEMCELL Technologies) โดยวิธีการแยกด้วยความหนาแน่นแบบ Ficoll gradient เซลล์ CD3+ ถูกแยกออกจาก PBMC โดยใช้ลูกปัด CD3 (Miltenyi) ในสภาวะที่มีหรือไม่มี MNA เซลล์ CD3+ ถูกกระตุ้นด้วย CD3 ที่ยึดติดกับแผ่นเพาะเลี้ยง (5 μg/ml), CD28 ที่ละลายได้ (3 μg/ml) และ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) ในวันสุดท้ายของการขยายจำนวนเซลล์ ความมีชีวิต (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) และการเพิ่มจำนวน (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) ถูกประเมินโดยใช้เครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (flow cytometry) ประเมินการทำงานของตัวกระตุ้นโดยการกระตุ้นเซลล์ด้วย PMA (20 ng/ml) และไอโอโนไมซิน (1 μg/ml) โดยใช้ GolgiStop เป็นเวลา 4 ชั่วโมง และตรวจสอบ CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) และ TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD) กระตุ้นเซลล์ qPCR และ ChIP ด้วย PMA (20 ng/ml) และไอโอโนไมซิน (1 μg/ml) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง เก็บสารละลายส่วนบนของ ELISA ก่อนและหลังการกระตุ้นด้วย PMA (20 ng/ml) และไอโอโนไมซิน (1 μg/ml) เป็นเวลา 4 ชั่วโมง
ปฏิบัติตามขั้นตอนของผู้ผลิตเพื่อแยก RNA โดยใช้ RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) ใช้ QIAshredder (QIAGEN) เพื่อทำให้ตัวอย่างเป็นเนื้อเดียวกัน ใช้ชุด High-capacity RNA to cDNA kit (Thermo Fisher Scientific) เพื่อสังเคราะห์ดีเอ็นเอเสริม (cDNA) ใช้ TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) เพื่อหาปริมาณการแสดงออกของยีน (ตามขั้นตอนของผู้ผลิต) โดยใช้โพรบต่อไปนี้: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] และ Hs01010726_m1 (SLC22A2) ตัวอย่างถูกนำไปวิเคราะห์ด้วยระบบ PCR แบบเรียลไทม์ StepOnePlus (Applied Biosystems) ในแผ่นปฏิกิริยาแบบ 96 หลุม MicroAmp fast optical (Applied Biosystems) โดยใช้ฟิล์ม MicroAmp optical ค่า Ct ใดๆ ที่เกิน 35 ถือว่าสูงกว่าเกณฑ์การตรวจจับและจะถูกทำเครื่องหมายว่าตรวจไม่พบ
ดำเนินการ ChIP ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (58) โดยสรุป เซลล์ได้รับการบำบัดด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ (ความเข้มข้นสุดท้าย 1.42%) และบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที ใช้บัฟเฟอร์บวมเสริม (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl และ 0.1% NP-40) บนน้ำแข็งเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นแขวนลอยใหม่ในบัฟเฟอร์อิมมูโนพรีซิปิเทชันตามที่อธิบายไว้ (58) จากนั้นตัวอย่างจะถูกทำให้แตกตัวด้วยคลื่นเสียงโดยใช้รอบต่อไปนี้: 10 รอบ (20 พัลส์ 1 วินาที) และเวลาคงที่ 40 วินาที บ่มอิมมูโนโกลบูลิน G เกรด ChIP (Cell Signaling Technology; 1 μl), ฮิสโตน H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) และ SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) กับตัวอย่างที่ 4°C เขย่าข้ามคืน นำตัวอย่างไปบ่มกับลูกปัดโปรตีนเอ (Thermo Fisher Scientific) ที่อุณหภูมิ 4°C พร้อมเขย่าเบาๆ เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นใช้ลูกปัดชีเล็กซ์ (Bio-Rad) เพื่อเพิ่มความเข้มข้นของ DNA และใช้โปรตีเนสเค (Thermo Fisher) เพื่อย่อยโปรตีน ตรวจจับโปรโมเตอร์ TNFα ด้วย PCR: ไพรเมอร์ไปข้างหน้า GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ไพรเมอร์ย้อนกลับ GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (ผลิตภัณฑ์ขนาด 207 bp) ภาพถูกสร้างขึ้นโดย Image Lab (Bio-Rad) และวิเคราะห์เชิงปริมาณโดยใช้ซอฟต์แวร์ ImageJ
เก็บสารละลายส่วนบนของเซลล์เพาะเลี้ยงตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ทำการวิเคราะห์ตามขั้นตอนของผู้ผลิตชุดตรวจ ELISA สำหรับ TNFα ของมนุษย์ (Invitrogen), ชุดตรวจ ELISA สำหรับ IL-2 ของมนุษย์ (Invitrogen) และชุดตรวจ ELISA สำหรับ IFN-γ ของมนุษย์ (Abcam) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต เจือจางสารละลายส่วนบนในอัตราส่วน 1:100 เพื่อตรวจหา TNFα และ IL-2 และ 1:3 เพื่อตรวจหา IFN-γ ใช้เครื่องอ่านแบบหลายฉลาก EnVision 2104 (PerkinElmer) ในการวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 nm
PBMC ถูกแยกออกจากผลิตภัณฑ์แยกเม็ดเลือดขาว (STEMCELL Technologies) โดยวิธีการแยกด้วยความหนาแน่นแบบ Ficoll gradient เซลล์ CD3+ ถูกแยกออกจาก PBMC โดยใช้ลูกปัด CD3 (Miltenyi) ในสภาวะที่มีหรือไม่มี MNA เซลล์ CD3+ ถูกกระตุ้นด้วย CD3 ที่ยึดติดกับแผ่นเพาะเลี้ยง (5 μg/ml), CD28 ที่ละลายได้ (3 μg/ml) และ IL-2 (300 U/ml; Proleukin) เป็นเวลา 3 วัน หลังจาก 3 วัน เซลล์ถูกเก็บรวบรวมและล้างด้วยสารละลายเกลือ 0.9% จากนั้นนำตะกอนไปแช่แข็งอย่างรวดเร็ว นับจำนวนเซลล์โดยใช้เครื่องวิเคราะห์การไหลของเซลล์ (Cytek Aurora; การกำหนดค่า 3L-16V-14B-8R) โดยใช้ 123count eBeads
สกัดสารเมตาบอไลต์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น สารสกัดแห้งถูกละลายใหม่ที่ความเข้มข้น 4000 เซลล์เทียบเท่า/μl วิเคราะห์ตัวอย่างโดยใช้โครมาโทกราฟีแบบเฟสผกผัน (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) และคอลัมน์ CORTECS T3 (2.1×150 มม., ขนาดอนุภาค 1.6 μm, ขนาดรูพรุน 120 Å; #186008500, Waters) เครื่องแมสสเปกโทรเมตรีแบบโพลาไรซ์ (6470, Agilent) ซึ่งการแตกตัวเป็นไอออนด้วยไฟฟ้าสถิตทำงานในโหมดบวก เฟสเคลื่อนที่ A คือกรดฟอร์มิก 0.1% (ใน H2O) เฟสเคลื่อนที่ B คืออะซีโตไนไตรล์ 90% และกรดฟอร์มิก 0.1% การไล่ระดับ LC คือ 0 ถึง 2 นาทีสำหรับ 100% A, 2 ถึง 7.1 นาทีสำหรับ 99% B และ 7.1 ถึง 8 นาทีสำหรับ 99% B จากนั้นปรับสมดุลคอลัมน์อีกครั้งด้วยเฟสเคลื่อนที่ A ที่อัตราการไหล 0.6 มล./นาที เป็นเวลา 3 นาที อัตราการไหลคือ 0.4 มล./นาที และห้องคอลัมน์ถูกทำให้ร้อนถึง 50°C ใช้สารเคมีมาตรฐานบริสุทธิ์ของ MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) เพื่อกำหนดเวลาการคงตัว (RT) และการเปลี่ยนแปลง (RT = 0.882 นาที, การเปลี่ยนแปลงที่ 1 = 137→94.1, การเปลี่ยนแปลงที่ 2 = 137→92, การเปลี่ยนแปลงที่ 3 = 137→78) เมื่อการเปลี่ยนแปลงทั้งสามครั้งเกิดขึ้นที่เวลาการคงตัวที่ถูกต้อง การเปลี่ยนแปลงที่ 1 จะถูกใช้สำหรับการหาปริมาณเพื่อให้แน่ใจถึงความจำเพาะ เส้นกราฟมาตรฐานของ MNA (บริษัท Toronto Research Chemical Company) สร้างขึ้นโดยการเจือจางสารละลายสต็อก (1 มก./มล.) จำนวน 6 ครั้ง เพื่อให้ได้สารมาตรฐานที่มีความเข้มข้น 0.1, 1.0, 10 และ 100 นาโนกรัม/มล. และ 1.0 และ 10 ไมโครกรัม/มล. ตามลำดับ ขีดจำกัดการตรวจวัดคือ 1 นาโนกรัม/มล. และการตอบสนองเชิงเส้นอยู่ระหว่าง 10 นาโนกรัม/มล. ถึง 10 ไมโครกรัม/มล. การฉีดตัวอย่างและสารมาตรฐานปริมาณ 2 ไมโครลิตรแต่ละครั้งใช้สำหรับการวิเคราะห์ LC/MS และมีการทดสอบตัวอย่างควบคุมคุณภาพแบบผสมทุกๆ 8 ครั้ง เพื่อให้มั่นใจในความเสถียรของแพลตฟอร์มการวิเคราะห์ การตอบสนองของ MNA ในตัวอย่างเซลล์ที่ได้รับการบำบัดด้วย MNA ทั้งหมดอยู่ในช่วงเชิงเส้นของการทดสอบ การวิเคราะห์ข้อมูลทำโดยใช้ซอฟต์แวร์วิเคราะห์เชิงปริมาณ MassHunter (เวอร์ชัน 9.0, Agilent)
โครงสร้าง αFR-CAR รุ่นที่สองนำมาจาก Song et al. (59) โดยสรุป โครงสร้างนี้ประกอบด้วยเนื้อหาดังต่อไปนี้: ลำดับนำ CD8a, ชิ้นส่วนตัวแปรโซ่เดี่ยวเฉพาะ αFR ของมนุษย์, บานพับและบริเวณทรานส์เมมเบรนของ CD8a, โดเมนภายในเซลล์ CD27 และโดเมนภายในเซลล์ CD3z ลำดับ CAR ที่สมบูรณ์ได้รับการสังเคราะห์โดย GenScript จากนั้นจึงโคลนลงในเวกเตอร์การแสดงออกของไวรัสเลนติรุ่นที่สองเหนือคาสเซ็ตการแสดงออกของ GFP ที่ใช้ในการประเมินประสิทธิภาพการถ่ายทอด
ไวรัสเลนติถูกผลิตขึ้นโดยการทรานสเฟคเซลล์ HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC)] ที่เลี้ยงใน Dulbecco's modified Eagle medium ที่มีซีรั่มจากลูกวัว (FBS) 10% และ PenStrep 1% โดยใช้เวกเตอร์ CAR-GFP และพลาสมิดบรรจุภัณฑ์ (psPAX2 และ pMD2.G, Addgene) โดยใช้ลิโปเฟคชั่นอะมีน (Sigma-Aldrich) เก็บสารละลายที่มีไวรัสหลังจากทรานสเฟค 48 และ 72 ชั่วโมง กรอง และทำให้เข้มข้นโดยการปั่นเหวี่ยงความเร็วสูง เก็บสารละลายไวรัสที่เข้มข้นไว้ที่อุณหภูมิ -80°C จนกว่าจะทำการทรานสดักชั่น
PBMC ถูกแยกออกจากผลิตภัณฑ์การแยกเม็ดเลือดขาวของผู้บริจาคที่มีสุขภาพดี (STEMCELL Technologies) โดยใช้การปั่นแยกความหนาแน่นแบบไล่ระดับ Ficoll ใช้ไมโครบีด CD8 แบบคัดเลือกเชิงบวก (Miltenyi) เพื่อแยกเซลล์ CD8+ ออกจาก PBMC กระตุ้นเซลล์ T ด้วย TransAct (Miltenyi) และในอาหารเลี้ยงเซลล์ TexMACS [Miltenyi; เสริมด้วยซีรั่มมนุษย์ที่ผ่านการให้ความร้อนเพื่อยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ 3%, PenStrep 1% และ IL-2 (300 U/ml)] ยี่สิบสี่ชั่วโมงหลังจากการกระตุ้น เซลล์ T จะถูกถ่ายทอดยีนด้วยไวรัสเลนติ (สารละลายไวรัสเข้มข้น 10 μl ต่อเซลล์ 10⁶ เซลล์) 1 ถึง 3 วันหลังจากการถ่ายทอดยีนบน Cytek Aurora (บน FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) ประเมินการแสดงออกของ GFP ในเซลล์เพื่อแสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนอย่างน้อย 30%
เซลล์ CAR-T ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 24 ชั่วโมงใน Immunocult (STEMCELL Technologies; เสริมด้วย PenStrep 1%) ภายใต้สภาวะต่อไปนี้: ไม่ได้รับการรักษา, ได้รับการรักษาด้วยอะดีโนซีน 250 μM หรือ MNA 10 mM หลังจากการเตรียมการ เซลล์ CAR-T ถูกล้างด้วย PBS และรวมกับเซลล์ SK-OV-3 จำนวน 20,000 เซลล์ [ATCC; ในอาหารเลี้ยงเซลล์ McCoy 5A (Sigma-Aldrich) เสริมด้วย FBS 10% และ PenStrep 1% ในอัตราส่วน 1:1] อัตราส่วนของเซลล์ผู้กระทำต่อเซลล์เป้าหมายเท่ากับ 1 ถูกขยายจำนวนเป็นสามชุดในอาหารเลี้ยงเซลล์ Immunocult ที่เสริมด้วยสารต่างๆ เซลล์ SK-OV-3 และเซลล์ SK-OV-3 ที่ถูกทำลายด้วยดิจิทาลิสซาโปนิน (0.5 มก./มล.; Sigma-Aldrich) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบและเชิงบวกตามลำดับ หลังจากเพาะเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 24 ชั่วโมง ได้ทำการเก็บสารละลายส่วนบนและวัดปริมาณแลคเตทดีไฮโดรจีเนส (LDH) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต (ชุดทดสอบ LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega) จากนั้นเจือจางสารละลาย LDH ในอัตราส่วน 1:50 ด้วยบัฟเฟอร์ LDH และคำนวณเปอร์เซ็นต์การฆ่าเชื้อโดยใช้สูตรต่อไปนี้: เปอร์เซ็นต์การฆ่าเชื้อ = เปอร์เซ็นต์การแก้ไข / อัตราการฆ่าเชื้อสูงสุด x 100% โดยที่เปอร์เซ็นต์การแก้ไข = การเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ T เท่านั้น และอัตราการฆ่าเชื้อสูงสุด = กลุ่มควบคุมเชิงบวก - กลุ่มควบคุมเชิงลบ
ตามที่อธิบายไว้ในเนื้อหาหรือส่วนวัสดุและวิธีการ ให้ใช้ GraphPad Prism 8, Microsoft Excel หรือ R v3.6.0 สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ หากมีการเก็บตัวอย่างหลายตัวอย่างจากผู้ป่วยรายเดียวกัน (เช่น น้ำในช่องท้องและเนื้องอก) เราจะใช้การทดสอบ t แบบจับคู่ หรือรวมผู้ป่วยเป็นตัวแปรสุ่มในแบบจำลองเชิงเส้นหรือแบบจำลองทั่วไปตามความเหมาะสม สำหรับการวิเคราะห์เมตาโบลิกส์ จะทำการทดสอบความสำคัญซ้ำ 3 ครั้ง
สำหรับเอกสารประกอบเพิ่มเติมของบทความนี้ โปรดดูที่ http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
บทความนี้เป็นบทความที่เข้าถึงได้โดยเสรี ภายใต้เงื่อนไขของ Creative Commons Attribution-Non-Commercial License ซึ่งอนุญาตให้ใช้งาน แจกจ่าย และทำสำเนาซ้ำในสื่อใดๆ ก็ได้ ตราบใดที่การใช้งานขั้นสุดท้ายไม่ใช่เพื่อผลกำไรทางการค้า และข้อสมมติฐานคือผลงานต้นฉบับถูกต้อง อ้างอิง
หมายเหตุ: เราขอให้คุณระบุที่อยู่อีเมลของคุณก็เพื่อให้ผู้ที่คุณแนะนำไปยังเพจทราบว่าคุณต้องการให้พวกเขาเห็นอีเมลนั้นและไม่ใช่สแปม เราจะไม่เก็บรวบรวมที่อยู่อีเมลใดๆ ทั้งสิ้น
คำถามนี้ใช้เพื่อทดสอบว่าคุณเป็นผู้เยี่ยมชมหรือไม่ และเพื่อป้องกันการส่งสแปมโดยอัตโนมัติ
มาริสา เค. คิลกอร์ (มาริซา เค. คิลเกอร์), ซาราห์ แม็คเฟอร์สัน (ซาราห์ แม็คเฟอร์สัน), ลอเรน จี. ซาคาเรียส (ลอเรน จี. ซาคาเรียส), อบิเกล เอลี อาริส จี. วัตสัน (เอช. วัตสัน), จอห์น สแต็กก์ (จอห์น สแต็กก์), แบรด เอช. เนลสัน (แบรด เอช. เนลสัน), ราล์ฟ เจ. เดอ เบลลาร์ดินี (ราล์ฟ เจ. เดอเบอร์าร์ดินิส), รัสเซลล์ จี. โจนส์ (รัสเซลล์ จี. โจนส์) ฟินีแอส ที. แฮมิลตัน (Phineas T. Hamilton)
MNA มีส่วนช่วยในการกดภูมิคุ้มกันของเซลล์ T และเป็นเป้าหมายที่มีศักยภาพสำหรับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันเพื่อรักษาโรคมะเร็งในมนุษย์
มาริสา เค. คิลกอร์ (มาริซา เค. คิลเกอร์), ซาราห์ แม็คเฟอร์สัน (ซาราห์ แม็คเฟอร์สัน), ลอเรน จี. ซาคาเรียส (ลอเรน จี. ซาคาเรียส), อบิเกล เอลี อาริส จี. วัตสัน (เอช. วัตสัน), จอห์น สแต็กก์ (จอห์น สแต็กก์), แบรด เอช. เนลสัน (แบรด เอช. เนลสัน), ราล์ฟ เจ. เดอ เบลลาร์ดินี (ราล์ฟ เจ. เดอเบอร์าร์ดินิส), รัสเซลล์ จี. โจนส์ (รัสเซลล์ จี. โจนส์) ฟินีแอส ที. แฮมิลตัน (Phineas T. Hamilton)
MNA มีส่วนช่วยในการกดภูมิคุ้มกันของเซลล์ T และเป็นเป้าหมายที่มีศักยภาพสำหรับการบำบัดด้วยภูมิคุ้มกันเพื่อรักษาโรคมะเร็งในมนุษย์
©2021 สมาคมอเมริกันเพื่อความก้าวหน้าทางวิทยาศาสตร์ สงวนลิขสิทธิ์. AAAS เป็นหุ้นส่วนของ HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef และ COUNTER วิทยาศาสตร์ก้าวหน้า ISSN 2375-2548